專利名稱：檢測(cè)EphA2基因表達(dá)量的熒光定量PCR方法及試劑盒與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光定量PCR方法，特別涉及一種檢測(cè)EphA2基因表達(dá)量的熒光 定量PCR方法及試劑盒與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中國(guó)是個(gè)癌癥高發(fā)國(guó)家，但目前對(duì)癌癥的術(shù)前診斷還停留在傳統(tǒng)的組織病理切片 檢查上。依靠?jī)?nèi)窺鏡鉗取的少量組織來進(jìn)行術(shù)前病理診斷有很大的局限性，活檢組織的病 理報(bào)告經(jīng)常模棱兩可。惡性腫瘤的分子診斷由于其敏感度高、特異性強(qiáng)、客觀性好、可重復(fù) 性高，可以克服上述傳統(tǒng)病理學(xué)的缺點(diǎn)，是腫瘤診斷的發(fā)展趨勢(shì)。EphA2受體是大小為130kDa的受體酪氨酸激酶，在正常生理應(yīng)答過程中的細(xì)胞生 長(zhǎng)和分化，以及致瘤轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)展中發(fā)揮了不同的作用。研究發(fā)現(xiàn)，EphA2受體在膀胱癌、 前列腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、卵巢癌、腦膠質(zhì)瘤等癌癥或腫瘤中過表達(dá)。其中腦腫瘤的發(fā)病率 為21/10萬人，約占所有癌癥的2%，腦膠質(zhì)瘤發(fā)病率占60%以上，腦膠質(zhì)瘤70%為惡性。 已發(fā)現(xiàn)EphA2mRNA表達(dá)陽性率隨腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤病理級(jí)別增高而顯著增高，該表達(dá)陽性 率與患者性別、年齡，以及腫瘤大小及部位無關(guān)。因此，對(duì)EphA2的表達(dá)量實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確、定量 地檢測(cè)，有利于醫(yī)生及時(shí)、準(zhǔn)確地制定治療方案、采取醫(yī)療措施。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種檢測(cè)EphA2基因表 達(dá)量的熒光定量PCR方法。本發(fā)明的另一目的在于提供實(shí)現(xiàn)所述檢測(cè)EphA2基因表達(dá)量的熒光定量PCR方法 的試劑盒。本發(fā)明的再一目的在于提供所述試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種檢測(cè)EphA2基因表達(dá)量的熒光定量 PCR方法，包含以下步驟(1)設(shè)計(jì)引物和探針上游引物F1 為5，-CAGGGCAAGGAAGTGGTACTG-3，下游引物Rl 為5，-TGTAGATCGGCATGTCATTCATG-3，探針為5，-FAM-CTCGGCTGGCTCACACACCCGT-TAMRA-3，；其中FAM為羧基熒光素，是標(biāo)記在5’端熒光基團(tuán)；TAMRA為熒光染料，標(biāo)記在3’ 端，熒光淬滅報(bào)告基團(tuán)的同時(shí)，TAMRA自身會(huì)在更高波長(zhǎng)處發(fā)射熒光；(2)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)抽提樣本的RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA ；(3)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)以步驟(2)得到的cDNA為模板，加入步驟(1)中所述的引物，進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，每個(gè)濃度設(shè)置至少3個(gè)平行；其中，設(shè)置陽性對(duì)照組、空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組；陽性
3對(duì)照組的模板為含有如下序列的重組質(zhì)粒，空白對(duì)照的模板為水，陰性對(duì)照組的模板為正 常人血液中的cDNA ；CAGGGCAAGGAAGTGGTACTGCTGGACTTTGCTGCAGCTGGAGGGGAGCTCGGCTGGCTCACACACCCG TATGGCAAAGGGTGGGACCTGATGCAGAACATCATGAATGACATGCCGATCTACA ；反應(yīng)條件為93°C 2min ；94°C 45sec，55°C 60sec，40 個(gè)循環(huán)；(4)結(jié)果的處理反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)陽性對(duì)照的拷貝數(shù)， 得到EphA2基因的表達(dá)拷貝數(shù)。步驟⑵中所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)優(yōu)選以下游引物Rl為逆轉(zhuǎn)錄引物；步驟O)中所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)體系組成優(yōu)選如下逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4μ1下游引物Rl(10p mol/μ 1)0. 5 μ 1逆轉(zhuǎn)錄酶QOOU/ μ 1)1 μ 1dNTPs(10mmol/l)0. 5 μ 1DEPC 處理水9 μ 1RNA 模板5 μ 1總體積20μ1;步驟O)中所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)條件優(yōu)選為37°C水浴60min，95 V 3分鐘；步驟(3)中所述重組質(zhì)粒優(yōu)選通過如下方法構(gòu)建得到抽提人腦星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞 系的RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA;以該cDNA為模板，引物為步驟(1)中所述的上游引 物Fl和下游引物R1，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到核苷酸序列如下所示的PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物與 TA克隆載體連接，得到所述重組質(zhì)粒；CAGGGCAAGGAAGTGGTACTGCTGGACTTTGCTGCAGCTGGAGGGGAGCTCGGCTGGCTCACACACCCG TATGGCAAAGGGTGGGACCTGATGCAGAACATCATGAATGACATGCCGATCTACA ；實(shí)現(xiàn)上述檢測(cè)EphA2基因表達(dá)量的熒光定量PCR方法的試劑盒，包含陽性對(duì)照、陰 性對(duì)照、上游引物、下游引物、熒光探針、Taq酶和熒光定量反應(yīng)緩沖液，其中陽性對(duì)照為 含有如SEQ ID :N0. 4所示序列的重組質(zhì)粒；陰性對(duì)照為健康人血液的cDNA ；上游引物如SEQ ID :N0. 1所示；下游引物如SEQ ID :N0. 2所示；熒光探針如SEQ ID :N0. 3所示。所述的試劑盒還包含逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液；所述的試劑盒還包含RNA抽提試劑，包括TRIzoI等；所述的試劑盒還包括DEPC處理水、無菌水。所述的試劑盒應(yīng)用于EphA2基因的定量檢測(cè)，應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明中的上下游引物和探針是 通過優(yōu)化得到的，利用該引物和探針進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好。


圖1是重組質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖2是重組質(zhì)量的不同拷貝數(shù)的熒光定量PCR曲線圖熒光曲線從左到右依次代表的cDNA濃度為IO5UO4UO3UO2UOiU個(gè)copies/ml。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。實(shí)施例1(1)設(shè)計(jì)引物以Genebank中基因序列號(hào)為匪004431的EphA2的編碼序列為參照，設(shè)計(jì)如下引 物和探針上游引物F1 為5，-CAGGGCAAGGAAGTGGTACTG-3，下游引物Rl 為5，-TGTAGATCGGCATGTCATTCATG-3，探針為5，-FAM-CTCGGCTGGCTCACACACCCGT-TAMRA-3，；其中FAM為羧基熒光素，是標(biāo)記在5’端熒光基團(tuán)；TAMRA為熒光染料，標(biāo)記在3’ 端，熒光淬滅報(bào)告基團(tuán)的同時(shí)，TAMRA自身會(huì)在更高波長(zhǎng)處發(fā)射熒光；上述序列和探針由廣州英俊公司合成。(2)構(gòu)建作為陽性對(duì)照的重組質(zhì)粒按照說明書，使用TRIzol (Invitrogen公司)抽提人腦星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 U251 (購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)的總RNA，接著進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)的體系和反應(yīng)條件如下反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液(5 X，Promega)4 μ 1下游引物Rl(10pmol/y 1)0. 5 μ 1MMLV 酶(Promega 公司)1 μ 1dNTPs(10mmol/l)0. 5 μ 1DEPC 處理水9 μ 1RNA 模板5 μ 1總體積20 μ 1反應(yīng)條件為37 °C水浴60分鐘，95 °C 3分鐘。將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的cDNA進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下所反應(yīng)條件為93°C — 2分鐘預(yù)變性，然后按93°C 30秒一55°C 45秒，72°C 45秒共做 40個(gè)循環(huán)，72°C 5分鐘。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用DNA膠回收試劑盒(Takara公司)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。 按照說明書操作，將純化后的PCR產(chǎn)物與PMD19-T載體(Takara公司)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌
不Ex Taq 酶(5U/ μ 1, Takara)10*Ex Taq buffer (Mg2+plus)dNTP Mixture (各 2. 5mM)cDNA上游引物Fl(10pmol/y 1)下游引物Rl(10pmol/y 1)雙蒸水
0. 5μ 1 10 μ 1 4μ 1 5 μ 1 4μ 1 4μ 1
補(bǔ)充至100μ 1 ;DH5a感受態(tài)細(xì)胞(Takara公司)，篩選陽性克隆，送去廣州英俊公司測(cè)序，得到的重組質(zhì)粒 含有如下序列CAGGGCAAGGAAGTGGTACTGCTGGACTTTGCTGCAGCTGGAGGGGAGCTCGGCTGGCTCACACACCCG TATGGCAAAGGGTGGGACCTGATGCAGAACATCATGAATGACATGCCGATCTACA。(3)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立將步驟( 構(gòu)建好的重組質(zhì)粒測(cè)定稀釋后，測(cè)定吸光度A值，計(jì)算拷貝數(shù)/ml， 10倍倍比稀釋成IO9-IO1c0PiesAil濃度梯度，在如下反應(yīng)條件下每個(gè)濃度平行加入3個(gè) 反應(yīng)管同時(shí)進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增，共做4次。反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。應(yīng) 用7500System SDS Software軟件上分析結(jié)果，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y = -3. 39Χ+42. 47，R = 0. 993(如圖1所示)，起始模板在IO7 103copies/ml時(shí)線性較好。熒光定量PCR反應(yīng)體系Premix Ex Taq (2X, Takara)12. 5 μ 1上游引物(IOpmol/μ 1)0. 5 μ 1下游引物(IOpmol/μ 1)0. 5 μ 1熒光探針(5pmol/μ 1)0. 5 μ 1模板 cDNA5 μ 1滅菌蒸餾水補(bǔ)充至25 μ 1 ；93°C — 2分鐘預(yù)變性，然后按93°C 45秒一55°C 60秒，共做40個(gè)循環(huán)。(4)敏感度實(shí)驗(yàn)取重組質(zhì)粒按比例稀釋為ΙΟ5、ΙΟ4、103、IO2UOU個(gè)拷貝/ml，進(jìn)行熒光定量PCR，以 檢測(cè)為陽性的最低濃度為該方法的檢測(cè)靈敏度。結(jié)果如圖2所示，所得到的圖呈現(xiàn)規(guī)律的 C(t)值變化，說明儀器參數(shù)穩(wěn)定，最低檢測(cè)下線達(dá)到lOcopies/ml。(5)陰性對(duì)照的制備使用全血RNA抽提試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)抽提取正常人的外周 血中的RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA，為陰性對(duì)照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液(5X，Promega)10 μ 1下游引物 RldOpmol/μ 1)1. 25 μ 1MMLV 酶(Promega 公司)2. 5μ 1dNTPs(10mmol/l)1. 25 μ 1RNA模板12μ 1DEPC處理水補(bǔ)至50μ 1 ；反應(yīng)條件為37°C水浴60分鐘，95°C 3分鐘。檢測(cè)該cDNA的完整性，檢測(cè)的管家基因?yàn)镚APDH(引物購(gòu)自TAKARA公司)，PCR產(chǎn)
物電泳結(jié)果表明，該cDNA完整，可用作陰性對(duì)照。(6)樣本檢測(cè)取確診患有腦癌的患者外周血抽提RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的體系和條 件同步驟(5)。進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)(反應(yīng)條件和體系同步驟C3))，設(shè)置6個(gè)梯度，每個(gè)梯度4個(gè)平行；以步驟⑵構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照、步驟(5)得到的cDNA為陰性對(duì)照、水 為空白對(duì)照；陽性對(duì)照重組質(zhì)粒按比例稀釋為105、104、103、102、10、1個(gè)拷貝/ml。結(jié)果顯示 腦癌患者的EphA2表達(dá)量是陰性對(duì)照的103倍。連續(xù)5天重復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法穩(wěn)定，重復(fù)性好。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)EphA2基因表達(dá)量的熒光定量PCR方法，其特征在于包含以下步驟(1)設(shè)計(jì)引物和探針上游引物 Fl 為5’ -CAGGGCAAGGAAGTGGTACTG-3，下游引物 Rl 為5’ -TGTAGATCGGCATGTCATTCATG-3’探針為5’ -FAM-CTCGGCTGGCTCACACACCCGT-TAMRA-3’ ；(2)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)抽提樣本的RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA；(3)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)以步驟⑵得到的cDNA為模板，加入步驟⑴中所述的引物，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)， 每個(gè)濃度設(shè)置至少3個(gè)平行；其中，設(shè)置陽性對(duì)照組、空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組；陽性對(duì)照 組的模板為SEQ ID :N0. 4所示序列的重組質(zhì)粒，空白對(duì)照的模板為水，陰性對(duì)照組的模板 為正常人血液中的cDNA;反應(yīng)條件為 93°C 2min ；94°C 45sec，55°C 60sec，40 個(gè)循環(huán)；(4)結(jié)果的處理反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)陽性對(duì)照的拷貝數(shù)，得到 EphA2基因的表達(dá)拷貝數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)EphA2基因表達(dá)量的熒光定量PCR方法，其特征在于步 驟O)中所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是以下游引物Rl為逆轉(zhuǎn)錄引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)EphA2基因表達(dá)量的熒光定量PCR方法，其特征在于步 驟O)中所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)條件為37°C水浴60min，95°C 3分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)EphA2基因表達(dá)量的熒光定量PCR方法，其特征在于步 驟(3)中所述重組質(zhì)粒通過如下方法構(gòu)建得到抽提人腦星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的RNA，進(jìn)行逆 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA;以該cDNA為模板，引物為步驟(1)中所述的上游引物Fl和下游引物 R1，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到核苷酸序列如SEQ ID :N0. 4所示的PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物與TA克隆 載體連接，得到所述重組質(zhì)粒。
5.實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1 4任一頂所述檢測(cè)EphA2基因表達(dá)量的熒光定量PCR方法的試 劑盒，包含陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、上游引物、下游引物、熒光探針、Taq酶和熒光定量反應(yīng)緩沖 液，其中陽性對(duì)照為含有如SEQ ID :N0. 4所示序列的重組質(zhì)粒；陰性對(duì)照為健康人血液的 cDNA ；上游引物如SEQ ID :N0. 1所示；下游引物如SEQ ID :N0. 2所示；熒光探針如SEQ ID NO. 3所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包含逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包含RNA抽提試劑。
8.權(quán)利要求5所述的試劑盒應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)EphA2基因表達(dá)量的熒光定量PCR方法及試劑盒與應(yīng)用。該方法中提供了如下引物和探針上游引物5’-CAGGGCAAGGAAGTGGTACTG-3’，下游引物5’-TGTAGATCGGCATGTCATTCATG-3’，探針5’-FAM-CTCGGCTGGCTCACACACCCGT-TAMRA-3’。通過該方法能準(zhǔn)確、快速、定量地確定EphA2基因表達(dá)量。本發(fā)明所述方法和試劑盒應(yīng)用在醫(yī)學(xué)臨床中，有利于醫(yī)生針對(duì)患者的情況，制定治療方案。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102094084SQ20101056402
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者史志東 申請(qǐng)人:廣州柳元醫(yī)藥科技有限公司