專利名稱：分離四聚體尿酸氧化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從尿酸氧化酶溶液中分離四聚體尿酸氧化酶的方法，以及由該方法獲得的分離四聚體尿酸氧化酶。本發(fā)明涉及用化學(xué)方法修飾蛋白，以延長蛋白的循環(huán)生命期并降低其免疫原性。 更具體而言，本發(fā)明涉及將聚乙二醇或聚環(huán)氧乙烷綴合到尿酸氧化酶上，這樣的綴合基本上消除了尿酸氧化酶的免疫原性，而尿酸氧化酶分解尿酸的活性并不受影響。
背景技術(shù)：
背景部分的陳述并不是對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的全盤接受，相反，它反映了發(fā)明人員對(duì)進(jìn)行此項(xiàng)發(fā)明時(shí)的技術(shù)情況的主觀評(píng)價(jià)和解釋。這些解釋可能包括發(fā)明人員自己的、迄今為止尚未透露的對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的洞悉。而這些洞悉本身并不是現(xiàn)有技術(shù)的一部分。尿酸氧化酶(尿酸酶；E. C. 1. 7. 3. 3)是一類酶，這類酶催化尿酸氧化，氧化產(chǎn)物是更易于溶解的尿囊素。尿囊素屬嘌呤類代謝物，更易于排泄。因?yàn)樵诟叩褥`長類動(dòng)物進(jìn)化過程中，使尿酸氧化酶具有活性的基因已發(fā)生數(shù)次突變，所以人類自身并不產(chǎn)生具有酶活性的尿酸酶。mi，X等(1992)J Mol Evol 34:78-84。其結(jié)果是，在那些易受影響的人的體內(nèi)，血液(血尿酸過多癥)及尿液(hyperuricosuria)中過高的尿酸濃度可能會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛(痛風(fēng))、損傷性尿酸沉淀(結(jié)節(jié)瘤)和腎衰的發(fā)生。對(duì)于有些易受影響個(gè)人，現(xiàn)可買到的藥物，如別嘌呤醇(尿酸合成抑制劑)，會(huì)產(chǎn)生治療允許范圍內(nèi)的副作用或不能充分緩解病情。Hande, KR 等(1984) Am J Med76 :47-56 ；Fam, AG(1990)Bailliere，s Clin Rheumatol 4:177-192。注射尿酸氧化酶可以降低血液及尿液中的尿酸濃度，至少是暫時(shí)性降低。但是，由于對(duì)于人體來說尿酸氧化酶屬外源蛋白，因此，即使是第一次注射來源于黃曲霉(Aspergillus flavus)的未經(jīng)修飾的尿酸氧化酶，也有百分之幾接受治療的病人發(fā)生過敏反應(yīng)(Pui，C-H等(1997) Leukemia 11 :1813-1816)，免疫反應(yīng)制約了尿酸氧化酶在長期治療和間斷性治療方面的應(yīng)用。Donadio，D等(1981)Nouv Presse Med 10:711-712; Leaustic，M 等(1983)Rev Rhum Mal Osteoartic 50 :553_554?，F(xiàn)在可行的、治療高尿酸血的亞優(yōu)選方法已被接受好幾十年了。Kissel，P等 (1968)Nature 217:72-74。類似地，一些患有嚴(yán)重痛風(fēng)病的病人可以獲得安全有效的注射尿酸氧化酶的可能性早已既成事實(shí)數(shù)年了。Davis，F(xiàn)F等(1978) in GB Broun等，(Eds.)Enzyme Engineering,Vol 4(pp. 169-173)New York,Plenum Press ；Nishimura,H等(1979) Enzyme 24 :261-264 ；Nishimura，H 等(1981)Enzyme 26 :49-53 ；Davis,S 等(1981)Lancet 2(8241) :281-283 ;Abuchowski，A 等(1981)J Pharmacol Exp Ther 219 :352-354 ；Chen, RH-L等(1981)Biochim Biophys Acta 660 :293-298 ；Chua，CC等(1988)Ann Int Med 109 114-117 ;Greenberg，ML 等(1989)Anal Biochem 176:290-293。來源于動(dòng)物器官的尿酸氧化酶在安全注射量的溶劑中幾乎是不可溶的。美國專利3，616，231。特定的來源于植物或微生物的尿酸氧化酶在醫(yī)學(xué)上可接受的溶劑中易溶些。但是，注射來源于微生物的尿酸氧化酶會(huì)很快引發(fā)免疫反應(yīng)，從而可能導(dǎo)致威脅生命的過敏反應(yīng)的發(fā)生，或者導(dǎo)致循環(huán)中的尿酸氧化酶失活和/或尿酸氧化酶從體內(nèi)清除的速度加快。Donadio，D等(1981) ；Leaustic, M等(198 。根據(jù)源于哺乳動(dòng)物，包括豬和狒狒，或源于昆蟲，如黑尾果蠅(Drosophila melanogaster)或假暗腹果蠅(Drosophila pseudoobscura) (ffallrath, LL 等，(1990)Mol Cell Biol 10 :5114-5127)的尿酸氧化酶的氨基酸序列而制備的酶，由于免疫原性和在生理PH條件下的不可溶等問題，至今還不能用于臨床。用聚乙二醇或聚環(huán)氧乙烷(都以PEG來表示)對(duì)蛋白進(jìn)行共價(jià)修飾，這種方法已被用來延長蛋白的半壽期和降低蛋白的免疫原性。美國專禾IJ 4，179，337,4, 766，106和 4，847，325 ;Saifer，MGP等(1994)Adv Exp Med Biol 366 :377_387。高分子量的PEG與蛋白綴合后生成的綴合物，循環(huán)生命期延長和/或免疫原性下降，并且仍保持著蛋白的功能。這一結(jié)論已在另一種酶，超氧化物歧化酶(Somack，R等(1991)Free Rad Res Commun 12-13 553-562;美國專利5，283，317和5，468，478)以及其他類型的蛋白，如細(xì)胞因子(Saifer, MGP 等(1997)Polym Preprints 38 :576-577 ；Sherman, MR 等(1997) in JM Harris 等 (Eds.) Poly (ethylene glycol)Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (pp. 155-169) Washington, DC =American Chemical Society)中得到證實(shí)。除 PEG以外的多聚體與尿酸氧化酶的綴合物在美國專利4，460，683也有陳述。在幾乎所有報(bào)導(dǎo)過的將尿酸氧化酶PEG化(如將PEG共價(jià)偶聯(lián)到尿酸氧化酶上)的嘗試中，PEG總是最先與氨基綴合，包括氨基末端殘基和可用的賴氨酸殘基。常用的尿酸氧化酶，四個(gè)單獨(dú)的亞基中每個(gè)亞基的賴氨酸的總數(shù)為25-29(黃曲霉(美國專利 5，382，518))(豬，Wu，X 等(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86:9412-9416))。在天然尿酸氧化酶的結(jié)構(gòu)中，有些賴氨酸殘基不參與PEG化。降低尿酸氧化酶免疫原性的最常用的方法是大量綴合由低分子量PEG組成的PEG鏈。但是，由這種方法得到的綴合物，其酶活性也總是大大下降。先前的研究人員曾在離體條件下注射尿酸氧化酶以催化尿酸轉(zhuǎn)化成尿囊素(見 Pui等(1997))。這為法國和意大利應(yīng)用來源于真菌黃曲霉的尿酸氧化酶⑴ricozyme ) 防治或暫時(shí)緩解由細(xì)胞毒素治療壞血病而引起的高尿酸血，以及暫時(shí)降低痛風(fēng)病人血液中嚴(yán)重超量的尿酸提供了理論基礎(chǔ)。Potaux，L等(1975)Nouv Presse Med 4:1109-1112; Legoux，R 等(1992)J Biol Chem 267 :8565-8570 ；美國專利 s 5，382，518 和 5，541，098。 由于toicozyme 的循環(huán)生命期很短，所以需要每天注射。更進(jìn)一步，由于toicozyme 具有免疫原性，所以它并不適用于長期治療。將來源于單假絲酵母(Candida utilis)的尿酸氧化酶與分子量為5KD的PEG綴合，制備物單次靜脈注射到五名實(shí)驗(yàn)者身上，這五名實(shí)驗(yàn)者在注射前血清中尿酸的平均濃度為6. ang/dL，屬正常水平。注射后，實(shí)驗(yàn)者血清中的尿酸濃度降低到了檢測(cè)不出的水平。 Davis等(1981)。四星期后再次注射。文章中沒有報(bào)導(dǎo)他們的反應(yīng)。第二次(也是最后一次)注射后，用靈敏度相對(duì)不高的凝膠擴(kuò)散分析方法沒有檢測(cè)到尿酸氧化酶的抗體。該文獻(xiàn)沒有報(bào)導(dǎo)接受長期治療或次長期治療的病人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的結(jié)果。將來源于球節(jié)細(xì)菌(Arthrobacter protoformiae)的尿酸氧化酶與分子量為5KD 的PEG綴合，制備物用來暫時(shí)性控制一名淋巴瘤患者血液中的尿酸高濃度，該患者在注射前血清中的尿酸濃度為15mg/mL。Chua等(1988)。由于病人病情的危急以及治療期之短 (14天注射四次)，不可能評(píng)估綴合物治療的長期效果或安全性。在本申請(qǐng)中，術(shù)語“免疫原性”指的是由注射經(jīng)PEG修飾的或未經(jīng)修飾的尿酸氧化酶(抗原)制備物而引起的免疫反應(yīng)。“抗原性”指的是抗原與已存在抗體的反應(yīng)。抗原性和免疫反應(yīng)統(tǒng)稱為“免疫反應(yīng)性”。在先前有關(guān)PEG-尿酸氧化酶的研究中，評(píng)價(jià)免疫反應(yīng)性的方法有很多種，包括1)離體條件下，PEG-尿酸氧化酶與預(yù)先存在的抗體的反應(yīng)；2)檢測(cè)經(jīng)誘導(dǎo)而產(chǎn)生的抗體的合成；幻重復(fù)注射后加快了的清除速率。通過用不同的連接物綴合不同數(shù)量的PEG鏈到尿酸氧化酶上，以消除不同來源尿酸氧化酶的免疫原性的嘗試已取得了一定的成功。第一次將PEG-尿酸氧化酶公諸于眾的是FF Davis和Y Inada以及他們的同事們。Davis等(1978)；美國專利4，179，337 ； Nishimura等(1979)；日本專利55-99189和62-55079。美國專利4，179，337中所述的綴合物是這樣合成的將Imol非特異來源的尿酸氧化酶與2000倍過量摩爾量的分子量為750D 的PEG反應(yīng)，這意味著個(gè)尿酸氧化酶亞基都可能綴合大量的多聚分子。美國專利4，179，337 揭示了各種多肽類激素和酶，包括氧化還原酶(其中尿酸氧化酶是三個(gè)例子中的一個(gè))綴合分子量為500D-20，000D，優(yōu)選分子量為500D-5，OOOD的PEG或聚丙二醇后，可以產(chǎn)生有活性的、水溶性的，沒有免疫原性的綴合物。另外，美國專利4，179，337還強(qiáng)調(diào)每個(gè)酶分子綴合10-100個(gè)多聚鏈而使得至少40%的酶活性得以保留。專利文獻(xiàn)中沒有關(guān)于尿酸氧化酶中可用的氨基末端PEG綴合的程度、綴合產(chǎn)物水解尿酸的活性或綴合物免疫反應(yīng)性的檢測(cè)結(jié)果。與PEG化尿酸氧化酶有關(guān)的十三個(gè)引證中的數(shù)據(jù)都列在表1中。這些結(jié)果中有一些也以圖的形式出現(xiàn)在

圖1A-2B中。這些引證中，有七篇文章都寫明將不同數(shù)量的PEG鏈與來源于單假絲酵母(Candida utilis)的尿酸氧化酶偶聯(lián)后，離體檢測(cè)的綴合物水解尿酸的活性都有很大程度的降低。將大量的分子量為5KD的PEG與豬肝臟尿酸氧化酶偶聯(lián)也得到了類似的結(jié)果，這在Chen發(fā)表的文章和他們的討論報(bào)告上都有記載。參見Chen等(1981)； Davis 等(1978)。在表1總結(jié)的研究中，有七項(xiàng)研究報(bào)導(dǎo)PEG化的尿酸氧化酶的免疫反應(yīng)性降低， 五項(xiàng)報(bào)導(dǎo)免疫反應(yīng)性消除。后五項(xiàng)研究中有三項(xiàng)，免疫反應(yīng)性消除的同時(shí)也伴隨著水解尿酸活性顯著降低——至多達(dá)到最初活性的15%、觀％或45%。參見Nishimura等(1979) (15%活性)；Chen 等(1981)( %活性)；Nishimura 等(1981) (45%活性)。第四項(xiàng)研究報(bào)導(dǎo)PEG與61 %的可用賴氨酸殘基綴合，但沒有關(guān)于剩余酶活性的陳述。參見Abuchowski 等(1981)。然而，一支包括這同樣兩名科學(xué)家的研究小組，用同樣的方法，在另一刊物上報(bào)導(dǎo)以這種程度綴合，剩余的活性只能達(dá)到23_觀％。參見Chen等(1981)。從Abuchowski 等和Chen等在1981年發(fā)表的文章可以看出，要基本上降低尿酸氧化酶的免疫原性，PEG必須與將近60%的可用賴氨酸殘基綴合(表1)。在報(bào)導(dǎo)尿酸氧化酶的活性已被消除的第五項(xiàng)研究中，PEG綴合的程度、剩余的水解尿酸的活性或PEG-蛋白連接的本質(zhì)都沒有說明。 參見 Veronese，F(xiàn)M 等(1997) in JM Harris 等(Eds.), Poly (ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications.ACS Symposium Series 680(pp. 182-192)Washington,DC American Chemical Society。研究表明，尿酸氧化酶中綴合PEG的賴氨酸殘基低于60%時(shí)，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，綴合物的免疫反應(yīng)性降低但并沒有消除。參見Tsuji，J等(1985Πη J Immunopharmacol 7 :725-730(28-45 % 的氨基被綴合)；Yasuda, Y 等(1990)Chem Pharm Bull 38 2053-2056 (38%的氨基被綴合)。相應(yīng)化合物的剩余水解尿酸的活性范圍從小于33% (Tsuji，J等)到60% (Yasuda，Y等)不等，此值相對(duì)于它們的最初活性值而言。Tsuji，J 等合成PEG-尿酸氧化酶用的PEG除5KD的外，還有7. 5KD和10KD的PEG。所有的連接產(chǎn)物都有一定程度的免疫原性和抗原性，同時(shí)酶活大大降低(表1 ；圖1A-1B)。將來源于單假絲酵母的尿酸氧化酶PEG化后的制備物，給五人每人安全施藥兩次。這種制備物據(jù)報(bào)導(dǎo)只保留了其最初活性的11%。Davis等(1981)。幾年后，經(jīng)PEG修飾的來源于球節(jié)細(xì)菌的尿酸氧化酶被四次用于同一病人，該病人患有嚴(yán)重的淋巴瘤和高尿酸血。參見Chua等(1988)。Chua等沒有檢測(cè)酶制備物剩余的活性，但是他們用酶連免疫吸附測(cè)定法(ELISA)證實(shí)了在第一次注射PEG化尿酸酶后的沈天，病人血清中的抗-尿酸氧化酶抗體不見了。如在表1中所總結(jié)的，先前的關(guān)于PEG化尿酸酶的研究表明，要基本上降低尿酸氧化酶的免疫反應(yīng)性，需要綴合足量的PEG鏈，但這又會(huì)大大降低其水解尿酸的活性。更進(jìn)一步，最先合成PEG-尿酸氧化酶是用氰尿酰氯，一種三嗪衍生物(2，4，6-三氯-1，3，5-三嗪) 來活化PEG的。已證實(shí)在兔子體內(nèi)，氰尿酰氯會(huì)引起新的抗原因子的產(chǎn)生，并會(huì)誘導(dǎo)新的抗體的形成。參見Tsuji，J等(1985)。表1先前研究中PEG-尿酸氧化酶的特征
權(quán)利要求
1.一種綴合物，包含與聚乙二醇綴合的尿酸氧化酶，其中聚乙二醇的平均分子量為 10000-100000道爾頓，并且其中該綴合物相對(duì)于未綴合的尿酸氧化酶仍保留至少約75% 的裂解尿酸的活性，而且該尿酸氧化酶的免疫原性顯著降低。
2.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量為約20000道爾頓。
3.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量為約10000道爾頓。
4.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量為約30000道爾頓。
5.權(quán)利要求1的綴合物，其中尿酸氧化酶是四聚體。
6.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述尿酸氧化酶綴合物由含不超過約10%非四聚體凝聚的尿酸氧化酶的尿酸氧化酶制備。
7.權(quán)利要求1的綴合物，其中綴合物含有少于約10%的尿酸氧化酶凝聚物。
8.權(quán)利要求1的綴合物，其中聚乙二醇的分子量為約10KD-約100KD。
9.權(quán)利要求1的綴合物，其中每個(gè)尿酸氧化酶亞基上共價(jià)綴合的聚乙二醇鏈的數(shù)目為 2-10 個(gè)。
10.權(quán)利要求9的綴合物，其中聚乙二醇的分子量不超過約IOKD且小于約100KD。
11.權(quán)利要求1的綴合物，其中尿酸氧化酶是哺乳動(dòng)物尿酸氧化酶。
12.權(quán)利要求1的綴合物，其中尿酸氧化酶是豬肝、牛肝或綿羊肝的尿酸氧化酶。
13.權(quán)利要求1的綴合物，其中尿酸氧化酶是重組的。
14.權(quán)利要求1的綴合物，其中尿酸氧化酶基本上含有豬肝、牛肝、綿羊肝或狒狒肝的尿酸氧化酶序列。
15.權(quán)利要求1的綴合物，其中尿酸氧化酶是嵌合體。
16.權(quán)利要求15的綴合物，其中嵌合尿酸氧化酶含有豬肝和狒狒肝尿酸氧化酶的一部分。
17.一種用來降低體液或組織中尿酸水平的藥物組合物，包括權(quán)利要求1的綴合物和藥學(xué)上可接受的載體。
18.一種分離的重組的四聚體哺乳動(dòng)物尿酸氧化酶，其中所述尿酸氧化酶基本為四聚體形式，其中少于10%的所述尿酸氧化酶為非四聚體聚合物形式，并且所述尿酸氧化酶是嵌合的。
19.權(quán)利要求18的分離的四聚體尿酸氧化酶，其中嵌合尿酸氧化酶含有豬肝和狒狒肝尿酸氧化酶的一部分。
20.權(quán)利要求19的分離的四聚體尿酸氧化酶，其中所述嵌合的尿酸氧化酶是豬-狒狒嵌合尿酸氧化酶。
21.一種分離的重組的四聚體哺乳動(dòng)物尿酸氧化酶，其中所述尿酸氧化酶為重組豬尿酸氧化酶，其含有替代序列SEQ ID NO :1中四1位精氨酸殘基的賴氨酸殘基和替代序列SEQ ID NO :1中301位蘇氨酸的絲氨酸。
22.—種分離的重組的四聚體哺乳動(dòng)物尿酸氧化酶，其中所述尿酸氧化酶具有狒狒肝臟尿酸氧化酶的序列，其中序列SEQ ID NO 2中97位酪氨酸被組氨酸代替。
23.權(quán)利要求18的分離的四聚體尿酸氧化酶，其中所述尿酸氧化酶包含氨基端和羧基端，其中所述尿酸氧化酶在其中一端或兩端是平截形式的。
24.權(quán)利要求21的分離的四聚體尿酸氧化酶，其中所述尿酸氧化酶包含氨基端和羧基端，其中所述尿酸氧化酶在其中一端或兩端是平截形式的。
25.權(quán)利要求22的分離的四聚體尿酸氧化酶，其中所述尿酸氧化酶包含氨基端和羧基端，其中所述尿酸氧化酶在其中一端或兩端是平截形式的。
26.一種尿酸氧化酶的綴合物，該綴合物相對(duì)于未綴合的尿酸氧化酶保留了裂解尿酸的活性并具有延長的體內(nèi)半壽期，所述綴合物包含與聚乙二醇綴合的純化尿酸氧化酶，其中超過90%的尿酸氧化酶為四聚體形式。
27.權(quán)利要求沈的綴合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量為約10000-約60000道爾頓。
28.權(quán)利要求27的綴合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量為約10000道爾頓。
29.權(quán)利要求27的綴合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量為約20000道爾頓。
30.權(quán)利要求27的綴合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量為約30000道爾頓。
31.權(quán)利要求沈的綴合物，其中每個(gè)尿酸氧化酶亞基上共價(jià)偶聯(lián)的聚乙二醇鏈的平均數(shù)目為2-10個(gè)。
32.權(quán)利要求沈的綴合物，其中尿酸氧化酶是哺乳動(dòng)物尿酸氧化酶。
33.權(quán)利要求32的綴合物，其中尿酸氧化酶是豬肝、牛肝或綿羊肝的尿酸氧化酶。
34.權(quán)利要求沈的綴合物，其中尿酸氧化酶是重組的。
35.權(quán)利要求34的綴合物，其中尿酸氧化酶含有豬肝、牛肝、綿羊肝或狒狒肝的尿酸氧化酶序列。
36.權(quán)利要求34的綴合物，其中尿酸氧化酶是嵌合的。
37.權(quán)利要求36的綴合物，其中嵌合尿酸氧化酶含有豬肝和狒狒肝尿酸氧化酶的一部分。
38.權(quán)利要求37的綴合物，其中所述嵌合尿酸氧化酶是豬-狒狒嵌合尿酸氧化酶(PBC 尿酸氧化酶)。
39.權(quán)利要求37的綴合物，其中所述嵌合尿酸氧化酶為豬尿酸氧化酶(PKS酸氧化酶)，其中序列SEQ ID NO :1中291位精氨酸殘基被賴氨酸殘基替代(R291K)并且序列SEQ ID NO :1中301位蘇氨酸被絲氨酸替代(T301S)。
40.權(quán)利要求34的綴合物，其中所述重組尿酸氧化酶具有狒狒肝臟尿酸氧化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)，其中97位酪氨酸被組氨酸代替(Y97H)。
41.權(quán)利要求34的綴合物，其中所述重組尿酸氧化酶包含氨基端和羧基端，其中所述尿酸氧化酶在其中一端或兩端是平截形式的。
42.權(quán)利要求31的綴合物，其中每個(gè)尿酸氧化酶亞基上共價(jià)偶聯(lián)的聚乙二醇鏈的平均數(shù)目為3-8個(gè)。
43.權(quán)利要求42的綴合物，其中每個(gè)尿酸氧化酶亞基上共價(jià)偶聯(lián)的聚乙二醇鏈的平均數(shù)目為4-6個(gè)。
44.權(quán)利要求37的綴合物，其中PEG鏈通過選自氨酯鍵，仲胺鍵，和酰胺鍵共價(jià)偶聯(lián)到尿酸氧化酶上。
45.權(quán)利要求沈的綴合物，其中所述聚乙二醇是線形的。
46.權(quán)利要求沈的綴合物，其中所述聚乙二醇是分支的。
47.權(quán)利要求沈的綴合物，其中超過95%的尿酸氧化酶為四聚體形式。
48.權(quán)利要求41的綴合物，其中所述尿酸氧化酶通過至少去除氨基端前6個(gè)氨基酸從而在氨基端是平截形式的。
49.一種用來降低體液或組織中尿酸水平的藥物組合物，包括與聚乙二醇綴合的純化尿酸氧化酶和一種藥學(xué)上可接受的載體，其中超過90%的尿酸氧化酶為四聚體形式。
50.權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述組合物經(jīng)冷凍干燥而穩(wěn)定化，并在重建時(shí)迅速溶解，以提供適用于不經(jīng)腸胃的溶液。
全文摘要
一種從尿酸氧化酶溶液中分離四聚體尿酸氧化酶的方法，所述溶液包含四聚體尿酸氧化酶和尿酸氧化酶凝集物，包括步驟將所述溶液加到至少一個(gè)分離柱上，分離柱的pH介于約9-10.5；從所述柱子上收集一份或多份洗脫級(jí)分，級(jí)分含有分離的四聚體尿酸氧化酶，其中所述一份或多份的級(jí)分基本不含尿酸氧化酶凝集物。
文檔編號(hào)C12N9/96GK102161984SQ201010565549
公開日2011年8月24日 申請(qǐng)日期1999年8月2日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月6日
發(fā)明者L·D·威廉斯, M·G·P·塞菲爾, M·R·舍爾曼, M·S·赫爾斯菲爾德, S·J·凱利 申請(qǐng)人:山景藥品公司, 杜克大學(xué)