專利名稱：一株產(chǎn)新結(jié)構(gòu)鎮(zhèn)痛作用單吲哚化合物的大腸桿菌工程菌5c11及其含的深海宏基因組基因簇的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別涉及一株產(chǎn)新結(jié)構(gòu)鎮(zhèn)痛作用單吲哚化合物的大腸桿菌工程菌5C11及其含的深海宏基因組基因簇。
背景技術(shù)：
半個(gè)世紀(jì)來，陸棲微生物早已成為抗生素、酶抑制劑等生物活性物質(zhì)的資源，海洋微生物也將成為21世紀(jì)開發(fā)新型的尤其是抗癌抗腫瘤藥品的資源。海洋微生物特別是深海微生物由于生活在高鹽、高壓及寡營養(yǎng)的特殊環(huán)境中，具有獨(dú)特的代謝方式，因此能產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特的次級代謝產(chǎn)物。深海占地球表面積的49%，是地球表面最大的生物棲息場所，深海環(huán)境中微生物基因資源的開發(fā)具有現(xiàn)實(shí)、重要的資源及科學(xué)價(jià)值。典型深海特征為低溫(< 5°C )和高壓 (最高達(dá)IlOMPa)，據(jù)估計(jì)在此極端條件下，深海環(huán)境中可培養(yǎng)微生物還不到0. 01%。采用宏基因組技術(shù)能部分克服傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限性，獲得新的科學(xué)發(fā)現(xiàn)和基因資源。自1998年宏基因技術(shù)建立以來，該技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛，在酶的開發(fā)方面已經(jīng)取得了不俗成績。隨著宏基因組學(xué)技術(shù)和譜學(xué)技術(shù)的發(fā)展和完善，基于宏基因組的藥物開發(fā)亦成為可能。本專利涉及到的一個(gè)產(chǎn)具有新結(jié)構(gòu)鎮(zhèn)痛單吲哚化合物的深海宏基因組文庫工程菌，為此類研究奠定了良好基礎(chǔ)。為此，提出本項(xiàng)發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供產(chǎn)新結(jié)構(gòu)鎮(zhèn)痛作用單吲哚化合物的大腸桿菌工程菌 5C11及其含的深海宏基因組基因簇。該大腸桿菌5C11EPI3005C11 Escherichia coli EPI3005C11)菌種保藏號為CCTCC NO =M 201(^43，保藏日期為2010年9月21日，保藏地點(diǎn)為湖北省武漢市武漢大學(xué)，保藏機(jī)構(gòu)為中國典型培養(yǎng)物保藏中心。本發(fā)明的另一目的在于提供該工程菌的應(yīng)用，其生產(chǎn)一種新結(jié)構(gòu)鎮(zhèn)痛作用單吲哚化合物。我們從太平洋深海沉積物樣品進(jìn)行富集，提取富集樣品DNA建立Fosimid文庫，質(zhì)粒載體(Fosmid，插入片段40 451Λ)，宿主是大腸桿菌(Escherichia coli)，獲得約3000 個(gè)克隆子。通過對其發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物細(xì)胞毒活性篩選，得到一個(gè)工程菌5C11。該工程菌LB發(fā)酵液的乙酸乙酯初提物在100ug/ml濃度下對HT1080腫瘤細(xì)胞具有良好鎮(zhèn)痛作用(83. 26% )。該插入片段全長302 個(gè)堿基對，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，該片段包含完整的苯和甲苯降解功能基因簇。


圖1所表示的是工程菌5C11所產(chǎn)具有鎮(zhèn)痛作用單吲哚化合物結(jié)構(gòu)。
圖2 所表示的工程菌5C11插入片段基因簇。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。實(shí)施例1本發(fā)明工程菌的獲得本發(fā)明提供的工程菌是采用以下方法獲得的1.深海沉積物樣品的富集取出4°C保存的深海沉積物樣品10g，于人工海水放線菌富集500ml培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28°，200rpm，10天。2.深海沉積物富集樣品DNA提取富集產(chǎn)物30ml，IOOOOg離心15分鐘，去上清， 加入 13. 5ml DNA抽提緩沖液(IOOmM Tris-HCl，IOOmM EDTA-Na, IOOmM磷酸鈉緩沖液，1. 5M Nacl, CTAB pH 8. 0)，混勻后，加溶菌酶(10mg/ml) ；37度水平振蕩30分鐘；加入1. 5ml 20% SDS，將其至于65度水浴渦中水浴2小時(shí)，同時(shí)每15-20分鐘伴隨著溫柔的顛倒混勻； 將離心管6000g離心十分鐘，去上清，沉淀重復(fù)洗兩次(4. 5ml buffer+0. 5mlSDS，65度， lOmin，離心6000g，10min)此步可以省略；集中三次所得到的上清，加入等體積的酚氯仿， 15000g離心15min ；取水相溶液到另一離心管中，再加入0. 6倍體積的異丙醇，室溫沉淀1 小時(shí)；16000g離心20min，得到DNA粗提物；用70%乙醇洗滌，離心之后放置于操作臺吹干， 最后用去離子水溶解。3.深海沉積物富集樣品宏基因組文庫的構(gòu)建A. DNA 剪切提取環(huán)境樣品或所富集菌體的DNA，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測B. DNA 選擇1.切下片段大約40K至4 的DNA，，在70. C溶膠lOmin，按Img固體膠溶解后體積為 1 μ 1 計(jì)算，加入 GELase 50XBuffer,每 100 μ 1 膠加入 IU GELase Enzyme, 45. C 水浴 1 小時(shí)。2. 70. C 水浴 lOmin，滅活 GELase Enzyme3.離心去除未被降解的瓊脂。4.加入1/10體積醋酸鈉，溫柔混勻。5.加入2. 5倍體積的無水乙醇，溫柔混勻。6.室溫沉淀 IOmin.7. 13000rpm/min 離心 20min，小心吸除上清8.將沉淀用預(yù)冷的70 %乙醇洗兩次9.吹干后將 DNA 溶于 TE Buffer.C. DNA末端補(bǔ)平1.補(bǔ)平體系X μ 1 無菌水8 μ 1 IOX End-Repair Buffer8 μ 1 2. 5mM dNTP Mix8 μ 1 IOmM ATP
Up to 20 μ g sheared insert DNA (約 0· 5 μ g/ μ 1)4μ 1 End-Repaie Enzyme Mix80 μ 1總反應(yīng)體積2.室溫放置 45min.3.加入酚-氯仿抽提4.取上清，加入1/10體積醋酸鈉，溫柔混勻。5.加入2. 5倍體積的無水乙醇，溫柔混勻。6.-20. C 過夜沉淀。7. 13000rpm/min 離心 20min，小心吸除上清8.將沉淀用預(yù)冷的70 %乙醇洗兩次9.吹干后將 DNA 溶于 TE Buffer.D.連接反應(yīng)1.連接體系X μ 1 無菌水1 μ 1 IOX Fast-Link Ligation Buffer1 μ 1 IOmM ATP1 μ 1 CopyControl pCClFOS VecterΧμ 1 concertrated insert DNA1 μ 1 Fast-Link DNA Ligase10 μ 1總反應(yīng)體積2.室溫放置連接2個(gè)小時(shí)3.反應(yīng)體系置于70°C，10分鐘，滅活DNA Ligase.E.克隆子制備1.將EPI300轉(zhuǎn)入已添加IOmM MgS04的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD達(dá)到0. 8-1. 0， 4度保存菌液可保存72小時(shí)。2.置冰上融化一管包裝蛋白，當(dāng)融化時(shí)迅速吸出25 μ 1到一個(gè)新的離心管中。剩下的25μ 1仍然置于-70. C接下去使用。3. 25 μ 1包裝蛋白中加入10 μ 1連接反應(yīng)產(chǎn)物。4. 30. C 水浴 90min.5.加入另外25μ1包裝蛋白，30. C水浴90min.6.力口入 Phage dilution buffer 940 μ 1,使總體積達(dá)到 lml.F. Titering the Packaged CopyControl Fosmid Clones1.加入10 μ 1包裝好的溶液與100 μ 1 EPI300-T1R宿主細(xì)胞混勻。2. 37. C 水浴 20min.3.涂于含有12. 5 μ g/ml氯霉素的LC平板上，過夜培養(yǎng)4.計(jì)算克隆子數(shù)目。G.克隆子確認(rèn).1.提取克隆子質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小。2.質(zhì)粒酶切圖譜分析
最終獲得約3000個(gè)克隆子，通過對克隆子的發(fā)酵物的乙酸乙酯萃取物細(xì)胞毒活性進(jìn)行檢測，得到一個(gè)在lOOug/ml濃度下對HT1080腫瘤細(xì)胞具有良好鎮(zhèn)痛作用 (83. 26% )的克隆子，即工程菌5C11。工程菌5C11發(fā)酵產(chǎn)物分離將獲得工程菌接種至3ml培養(yǎng)基，370C 200rpm培養(yǎng)10小時(shí)。將初級培養(yǎng)物取Iml 接種至500ml培養(yǎng)基，37°C 200rpm培養(yǎng)20小時(shí)后，接種至100升發(fā)酵罐，37°、60L/min通氣量，200rpm，200rpm，pH7. 0發(fā)酵36小時(shí)，出罐，利用連續(xù)流離心機(jī)分別收集菌體和菌液。 80L發(fā)酵液上大孔吸附樹脂(AB-8，11L)吸附后，洗脫回收乙醇得浸膏。通過硅膠層析柱， ODS柱，制備液相，最終獲得一個(gè)新結(jié)構(gòu)的單吲哚化合物。該化合物表現(xiàn)出良好鎮(zhèn)痛作用。分離得到化合物的鎮(zhèn)痛活性實(shí)驗(yàn)FAHH 實(shí)驗(yàn)從高表達(dá) FAHH 的 HEK293 細(xì)胞中提取 FAH 50 μ g, Buffer (50mM, pH 8.0)、內(nèi)源性大麻素(anandamide^SyM)的離心管中，并加入待測物PIHA，取兩個(gè)濃度梯度，分別為50 μ Μ、25 μ M，以已知對FAAH酶有抑制的URB597為陽性對照不加PIHA為空白對照。37°C條件下培養(yǎng)30min后，加入1 1 (氯仿甲醇)終止反應(yīng)，LC-MS. 37°C條件下培養(yǎng)30min后，加入1 1 (氯仿甲醇)終止反應(yīng)，LC-MS檢測酶水解產(chǎn)物，并計(jì)算抑制率。MGL實(shí)驗(yàn)從高表達(dá)MGL的HEK293細(xì)胞中提取MGL 50 μ g，加入含有 TrisBuffer (50mM, pH 8.0)、內(nèi)源性大麻素的(2-AG, 25 μ Μ)的離心管中，并加入待測物 ΡΙΗΑ，取兩個(gè)濃度梯度，分別為50 μ Μ、25 μ Μ，以已知對MGL酶有抑制作用的雷公藤紅素為陽性對照，不加PIHA為空白對照。37°C條件下培養(yǎng)30min后，加入1 1 (氯仿甲醇)終止反應(yīng)，LC-MS檢測酶水解產(chǎn)物，并計(jì)算抑制率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PIHA對FAAH的抑制50 μ M抑制率33%、25 μ M抑制率11%;ΡΙΗΑ 對MGL的抑制50 μ M抑制率37%、25 μ M抑制率7%。試驗(yàn)例2本發(fā)明工程菌5C11功能基因簇分析通過對5C11插入片段進(jìn)行全長測序得到302 對堿基序列，BLAST結(jié)果顯示其和 Pseudomonas sp. (Gene Bank Accession ID AF320981. 3)相似性最高，達(dá)到 99%，覆蓋率為55%。相關(guān)研究已經(jīng)證明此菌的相關(guān)基因與苯和甲苯的代謝有著通過密切關(guān)系。通過softberry (www. softberry. com/)在線預(yù)測其ORFs，預(yù)測該插入序列含有34個(gè)ORFs禾口 CDs。對這些基因分別進(jìn)行BLAST，發(fā)現(xiàn)其中包含了一個(gè)完整的苯、甲苯降解xyl基因簇(編號1到23號基因組成)。對5C11中的xyl基因簇分析得到結(jié)果如表1。
權(quán)利要求
1.一種含有苯和甲苯降解功能基因簇基因，其特征在于，序列如SEQ ID NO 1所示。
2.一株含有權(quán)利要求1所述降解苯和甲苯降解功能基因簇的大腸桿菌工程菌 EPI3005C11 (Escherichia coli EPI3005C11)，其特征在于，該工程菌的保藏號為=CCTCC NO :M2010243o
3.如權(quán)利要求2所述的大腸桿菌工程菌5C11在降解苯酚中的應(yīng)用。
4.一種獲得權(quán)利要求2所述的大腸桿菌工程菌5C11的方法，包括如下步驟(1).深海沉積物樣品的富集取出4°保存的深海沉積物樣品10g，于人工海水放線菌富集培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)；(2)，深海沉積物富集樣品DNA提取加入DNA提取緩沖液，使細(xì)胞裂解，然后從樣品中直接提取DNA并純化；(3)，深海沉積物富集樣品宏基因組文庫的構(gòu)建質(zhì)粒載體(Fosmid，插入片段40 451Λ)，宿主是大腸桿菌(Escherichia coli)，獲得約3000個(gè)克隆子；，宏基因組文庫篩選功能驅(qū)動(dòng)的篩選即基于活性的篩選；化合物結(jié)構(gòu)水平的篩選；序列驅(qū)動(dòng)的篩選；(5)，通過對克隆子的發(fā)酵物的乙酸乙酯萃取物活性進(jìn)行檢測，得到工程菌。
5.如權(quán)利要求2所述的大腸桿菌工程菌5C11在制備一種具有鎮(zhèn)痛作用的單吲哚化合物中的應(yīng)用，該單吲哚化合物具有下列結(jié)構(gòu)
6.如權(quán)利要求2所述的大腸桿菌工程菌5C11在制備一種具有鎮(zhèn)痛作用的單吲哚化合物中的應(yīng)用，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)大腸桿菌工程菌5C11，獲取含有該單吲哚化合物的發(fā)酵物，然后從該發(fā)酵物中分離純化該單吲哚化合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株產(chǎn)新結(jié)構(gòu)鎮(zhèn)痛作用單吲哚化合物的大腸桿菌工程菌5C11及其含的深海宏基因組基因簇，該基因簇來源于深海沉積物樣品，包括26個(gè)基因。該基因簇轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到了該基因工程菌5C11，其保藏號為CCTCC NOM 2010243。該工程菌還能夠合成一種具有鎮(zhèn)痛作用的新結(jié)構(gòu)單吲哚化合物。
文檔編號C12R1/19GK102477436SQ20101056730
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月29日
發(fā)明者易志偉, 湯熙翔, 王風(fēng)平, 肖湘 申請人:國家海洋局第三海洋研究所