專利名稱：一種改進(jìn)的滲透培養(yǎng)基浸花法轉(zhuǎn)化玉米的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的，使用改進(jìn)的滲透培養(yǎng)基，利用浸花法轉(zhuǎn)化玉米的 方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
很大作用。此外飼料消費(fèi)也是玉米最重要的消費(fèi)渠道，約占消費(fèi)總量的70%左右。 作為工業(yè)原料使用也是玉米消費(fèi)的主要渠道。玉米可開發(fā)產(chǎn)品眾多，是糧食作物中用量最 大的工業(yè)原料。玉米廣泛用于生產(chǎn)淀粉、造紙、食品、紡織、醫(yī)藥等行業(yè)。以玉米淀粉為原料 生產(chǎn)的酒精是一種清潔的“綠色”燃料，有可能在21世紀(jì)取代傳統(tǒng)燃料而被廣泛使用。玉米適合旱地種植，在中國播種面積很大，分布也很廣，是中國北方和西南山區(qū)及 其它旱谷地區(qū)人民的主要糧食之一。但目前玉米的轉(zhuǎn)化技術(shù)還存在一些難題，如難于進(jìn)行 組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化再生能力差等。要應(yīng)用基因技術(shù)改良性狀，還比較困難。目前的轉(zhuǎn)基因技術(shù)可分為物理法、化學(xué)法及生物學(xué)法。無論那一種方法，都要依靠 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的脫分化和再分化這一組織培養(yǎng)植株再生過程，實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移，獲得轉(zhuǎn)基 因植株。但是該途徑有其局限性，如組織培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化再生能力的基因型依賴性比較強(qiáng)，而且 有些物種難于進(jìn)行組織培養(yǎng)，以及逃逸體、嵌合體、轉(zhuǎn)化率低下、過敏反應(yīng)導(dǎo)致感染部位的 褐化壞死、細(xì)胞脫分化和再分化中產(chǎn)生的體細(xì)胞變異以及轉(zhuǎn)基因株的育性降低或喪失都有 可能干擾轉(zhuǎn)基因植株的分析及應(yīng)用。植物原位轉(zhuǎn)基因方法是一種不需要組織或細(xì)胞培養(yǎng)手 段而達(dá)到植物在活體而非離體手段狀態(tài)下的轉(zhuǎn)化。浸花法轉(zhuǎn)化是植物原位轉(zhuǎn)基因方法中的 一種，是利用材料花序與農(nóng)桿菌接觸，在活體條件下，完成可遺傳細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并通過對后 代的篩選，獲得轉(zhuǎn)化株。目前浸化花法轉(zhuǎn)化已應(yīng)用于雙子葉植物十字花科的蕓薹屬作物中 并獲得成功，利用浸化花法轉(zhuǎn)化禾本科作物未見報(bào)道。我們之前的研究已利用改進(jìn)的浸化 花法轉(zhuǎn)化方法，成功獲得禾本科作物轉(zhuǎn)基因植株。在此基礎(chǔ)上，我們對轉(zhuǎn)化液的成分進(jìn)行了 改良，并取得了一定的進(jìn)展。此轉(zhuǎn)基因方法，具有簡便、高效及低成本等特點(diǎn)，具有較大的實(shí) 際應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種使用改進(jìn)的滲透培養(yǎng)基，利用浸花法轉(zhuǎn)化玉米的方法。本發(fā)明所提供浸花法轉(zhuǎn)化玉米的方法，包括在活體條件下，將農(nóng)桿菌滲透培養(yǎng)基 注射到待轉(zhuǎn)化植株的雌花序中，利用農(nóng)桿菌將目的基因整合到目的植株基因組中的方法。1.浸花法轉(zhuǎn)化可在外界的強(qiáng)壓下進(jìn)行，也可在常溫常壓下進(jìn)行。目前應(yīng)用較多 的浸花法轉(zhuǎn)化要進(jìn)行抽真空處理，但是對于株型較大的植物品種進(jìn)行抽真空處理則不太可 行。在常溫常壓下進(jìn)的轉(zhuǎn)化時(shí)，滲透培養(yǎng)基中需要添加能夠幫助提高滲透能力的表面活性 劑，通常添加的是溫和的有機(jī)硅表面活性劑silwet L-77。有機(jī)硅表面活性劑是一類高效 表面活性劑，本身無毒害作用，表面張力低，濕潤、擴(kuò)展性能好，具有很好的展著成膜性，被 廣泛使用。但在酸、堿或加熱等條件下，其硅氧鍵易被裂解，結(jié)構(gòu)易受到破壞。在我們的研究中，使用了另外兩種滲透劑=Kinetic和hduce。因?yàn)閟ilwet L-77在酸性條件下容易水 解，而在轉(zhuǎn)化時(shí)我們希望轉(zhuǎn)化液是偏酸性的。silwet L-77的pH為6. 0-7. 0，而Kinetic的 pH為5. 0-6. 0，Induce的pH為4. 0-6. 0，更符合我們實(shí)驗(yàn)的要求。KINETIC和Induce，在技 術(shù)上避免了 Silwet L-77在使用上的很多缺點(diǎn)，如在在某些pH值條件下易水解，且毒性太強(qiáng)。2.轉(zhuǎn)化液中添加抗氧化劑DTT和L-Cysteine。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，使用浸花法轉(zhuǎn) 化玉米雌穗時(shí)，有花絲褐變腐爛的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了結(jié)實(shí)率與轉(zhuǎn)化率。這種外植體的褐化可 能是植物對受傷和病原體侵害的一種防御反應(yīng)。而這種因農(nóng)桿菌的侵染和制造傷口引起的 褐化和細(xì)胞死亡可能會(huì)阻礙T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞。有文獻(xiàn)報(bào)道，DTT和L-Cysteine可以有 效的減少外植體的褐化現(xiàn)象，同時(shí)提高農(nóng)桿菌的感染率。3.將轉(zhuǎn)化液中的蔗糖改為甘露糖。轉(zhuǎn)化液中蔗糖的主要重用是維持一定的滲透 壓，而甘露醇也常被作為滲透壓調(diào)節(jié)劑使用。我們嘗試了，在轉(zhuǎn)化液種使用甘露糖作為滲透 壓調(diào)節(jié)劑。4.轉(zhuǎn)化液中添加抗生素。我們發(fā)現(xiàn)，在以往的試驗(yàn)中，當(dāng)向玉米雌穗苞葉中注射農(nóng) 桿菌轉(zhuǎn)化液時(shí)，同時(shí)也會(huì)帶入許多其它外源微生物，這些微生物進(jìn)入到玉米雌穗苞葉中后， 由于具有充足的營養(yǎng)與濕潤的環(huán)境，很容易大量繁殖生長。這不僅影響到了農(nóng)桿菌的生長， 而且可能也是導(dǎo)致花絲腐爛的一個(gè)重要因素。我們向轉(zhuǎn)化液中添加了抗生素，目的是抑制 其它外源微生物，保證農(nóng)桿菌的生長。含有本發(fā)明表達(dá)載體、細(xì)胞系、宿主菌、滲透培養(yǎng)基配方及轉(zhuǎn)化方法均屬本發(fā)明的 保護(hù)范圍。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


圖1質(zhì)粒KAT-Al圖譜圖2轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定，圖中ck+為質(zhì)粒陽性對照，wt為野生型陰性對照，1-9 為轉(zhuǎn)基因植株。圖3新舊滲透培養(yǎng)基轉(zhuǎn)基因玉米對比，圖中左圖為使用新滲透培養(yǎng)基處理一天后 的玉米花絲情況，右圖為使用改良前的滲透培養(yǎng)基處理一天后的玉米花絲情況。下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法，所用試劑購自上海生工生 物工程有限公司，KINETIC和hduce購自浙江泰達(dá)作物科技有限公司，引物均由上海英駿 生物技術(shù)有限公司合成，PCR試劑盒來自^witrogen公司，方法均參照試劑盒提供的方法 進(jìn)行。紅色熒光蛋白報(bào)告基因AsRed購自美國Clontech Laboratories Inc0實(shí)驗(yàn)中所用 的載體、菌種屬于本實(shí)驗(yàn)室。實(shí)施例1、浸花法轉(zhuǎn)化獲得玉米轉(zhuǎn)基因植株一、浸花法轉(zhuǎn)化玉米植株1.實(shí)驗(yàn)材料農(nóng)桿菌菌株農(nóng)桿菌菌株為AglO，本實(shí)驗(yàn)室保存。含有質(zhì)粒載體KAT-A1。質(zhì)粒=KAT-Al含有來源于水母的紅色熒光蛋白報(bào)告基因AsRed，帶有hpt篩選標(biāo)記 基因，可抗Hygmycin抗生素。KAT-Al載體為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。(如圖1)
供轉(zhuǎn)化玉米品種由我公司培育品種K12、Κ36。2.根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)挑取甘油凍存的含有目的基因的農(nóng)桿菌，于YEB+Amp+Rif平板上畫線，28°黑暗 培養(yǎng)2天。挑取單菌落接種于50ml抗性YEB液體培養(yǎng)基中，28° 200rpm搖過夜。吸取上 述培養(yǎng)物接種于IL YEB液體培養(yǎng)基中28° 150rpm搖過夜，直至0D600 = 2。將上述0D600 =2的農(nóng)桿菌懸浮液在6000rpm離心15min，沉淀后的農(nóng)桿菌，懸浮于滲透培養(yǎng)基中，用于植 物轉(zhuǎn)化。3.轉(zhuǎn)化菌液準(zhǔn)備配制轉(zhuǎn)化用滲透培養(yǎng)基。滲透培養(yǎng)基1/2MS培養(yǎng)基+甘露糖5% +6-BA 4 μ g/ L+As200uM+DTT ImM+L-Cysteine 8. 8mM+Kinetic or Induce 50 μ 1/L+Amp 50mg/L pH = 5. 8將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌用滲透培養(yǎng)基重懸，稀釋到0D600 = 1. 0左右備用。4.植株選擇準(zhǔn)備選取露天生長處于初花期，生長健壯的植株，作為待轉(zhuǎn)化植株。對其進(jìn)行編號、掛 牌。5.農(nóng)桿菌菌液浸染植物花序1)使用注射器，將菌液從玉米雌花序底部注射到玉米雌花序的苞皮中，直到菌液 從花序頂端溢出。2)浸染過程結(jié)束，所有花或雌蕊都已被浸潤后，用硫酸鈉紙袋將處理過的花序套 住，以保持一定的濕度。3)重復(fù)整個(gè)轉(zhuǎn)化過程每天進(jìn)行一次，共重復(fù)三次。每次浸染后都需要套袋，紙袋可于最后 一次轉(zhuǎn)化后的Mhr后去掉。7.收獲轉(zhuǎn)化后其他管理按照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行，直至種子成熟收獲。每個(gè)轉(zhuǎn)化植株都采取單 株收種(TO代種子)，對Tl代進(jìn)行篩選及其它檢測。實(shí)施例2、Tl代轉(zhuǎn)化株的篩選及檢測1. Tl代轉(zhuǎn)化株的抗生素篩選將收獲的Tl代種子，用Hygmycin篩選。轉(zhuǎn)化株由于帶有hpt抗性基因，而對 Hygmycin不敏感。Hygmycin篩選濃度為20mg/L，兩周后選取抗性植株，做進(jìn)一步的分子檢 測驗(yàn)證。2. Tl代轉(zhuǎn)化株的PCR檢測對表現(xiàn)Hygmycin抗性的植株，PCR檢測hpt基因。植物基因組DNA的提取采用 CTAB法。根據(jù)hpt基因的序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物序列如下引物 1 (上游引物)5 ‘ TCGGCGAGTACTTCTACACAGC 3 ‘引物 2 (下游引物)5 ‘ CTGGCAAACTGTGATGGACGAC 3 ‘利用引物1和引物2以抗性植株基因組DNA模板，擴(kuò)增hpt基因，擴(kuò)增體系和程序 為10X Buffer :2ul ；
IOmM dNTP 0. 5ul ；IOuM 引物 1 :0. 4ul ；IOuM 引物 2 :0. 4ul ；genomic DNA IOpg ；Taq DNA Polymerase(5U/ul) 0.5ul ；ddH20 補(bǔ)足 20ul。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95 °C，5分鐘；變性94°C，20秒；退火55°C，30秒；延伸72°C，1分鐘；30 個(gè)循環(huán)；72°C，10 分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以檢測到500bp的目的 片段(圖二)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陽性，證明基因已經(jīng)整合到水稻基因組中，即得到Tl代轉(zhuǎn)基因植 株。以上實(shí)驗(yàn)證明，利用我們改進(jìn)的轉(zhuǎn)化液，可以對玉米進(jìn)行浸花法轉(zhuǎn)化，對這類作物 的分子育種具有重要意義。
權(quán)利要求
1.一種改進(jìn)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化玉米的方法，其特征在于該方法的滲透培養(yǎng)基 含有表面活性劑、滲透調(diào)節(jié)劑，并添加了抗氧化劑和抗生素。
2.根據(jù)權(quán)利1要求所述，要求的表面活性劑為Kinetic和hduce，Kinetic的pH為 5. 0-6. 0，Induce 的 pH 為 4. 0-6. 0。
3.根據(jù)權(quán)利1要求所述，要求的滲透調(diào)節(jié)劑為甘露醇。
4.根據(jù)權(quán)利1要求所述，要求的抗氧化劑為DTT和L-Cysteine。
5.根據(jù)權(quán)利1要求所述，要求的抗生素為任何用于生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)的抗生素。
6.根據(jù)權(quán)利1要求，所述的玉米為任何生產(chǎn)上應(yīng)用的玉米品種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的浸花法轉(zhuǎn)化玉米的方法，其特征在于滲透培養(yǎng)基的表面活性劑為Kinetic和Induce，滲透調(diào)節(jié)劑為甘露醇，并添加抗氧化劑DTT和L-Cysteine，添加抗生素。利用本發(fā)明的浸花法轉(zhuǎn)化玉米轉(zhuǎn)，具有簡便、高效及低成本等特點(diǎn)。
文檔編號C12N15/82GK102102109SQ201010567338
公開日2011年6月22日 申請日期2010年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月1日
發(fā)明者何峰, 夏勉, 張會(huì)新 申請人:北京未名凱拓作物設(shè)計(jì)中心有限公司