專利名稱：BGIos405基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因，特別是涉及BGIOS405基因，及其促進植物、特別是單子葉 植物籽粒變大的用途及方法。
背景技術(shù)：
水稻(Oryza sativa)是全世界最重要的糧食作物之一，全世界約30多億人口以 稻米為主食(Delseny M et al，2001)。水稻也是我國第一大糧食作物，其面積、單產(chǎn)和總產(chǎn) 量均居首位，水稻生產(chǎn)在我國國民經(jīng)濟中具有舉足輕重的地位。隨著人口增長和人民生活 水平的提高，市場對優(yōu)質(zhì)稻米有更大需求。糧食生產(chǎn)不但要提高品種的產(chǎn)量潛力，更要注重 品質(zhì)的改良，而水稻粒型(粒長、粒寬和長寬比)和千粒重會影響稻米外觀、產(chǎn)量及市場價 值。因此，選育大粒優(yōu)質(zhì)的水稻新品種已成為水稻育種的一個主要目標，發(fā)掘控制水稻粒型 和千粒重的主要基因是當前遺傳學(xué)家和育種家們共同關(guān)注的焦點。這對提高稻谷產(chǎn)量和稻 米市場的競爭力具有重要意義。水稻產(chǎn)量主要由千粒重、有效穗數(shù)和每穗粒數(shù)決定。據(jù)國內(nèi)外研究，在構(gòu)成水稻 產(chǎn)量的三要素中，千粒重也即谷粒重量的遺傳比較穩(wěn)定，其變異系數(shù)為40% 60%。菲律 賓國際水稻研究所研究認為，增加粒重可提高水稻產(chǎn)量30%以上(姚國新和盧磊，安徽農(nóng) 業(yè)科學(xué)，2007，35 (27) =8468-8478) 0從代謝生理和形態(tài)學(xué)上看，高產(chǎn)必須具備兩個條件， 即高水平的代謝源和足夠大的貯藏庫，其中后者表現(xiàn)在粒數(shù)多和谷粒大，即對光合產(chǎn)物有 較大的容納力?；谝陨戏治?，想實現(xiàn)水稻產(chǎn)量的進一步飛躍，提高粒重的途徑是值得重 視的，提高粒重是提高糧食產(chǎn)量的有效途徑(熊振民和孔繁林，江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)4，1981，48 25-30)。水稻千粒重由谷粒長度、寬度和厚度三者決定，是一個典型的受多基因控制的數(shù) 量性狀遺傳?？寺】刂屏Ｖ氐闹饕虿⒓右愿脑炖檬翘岣呒Z食產(chǎn)量的有效方法。目前 水稻的全基因組測序工作已經(jīng)完成，在水稻上已經(jīng)積累了相當詳細的資料，為水稻重要性 狀基因的定位克隆提供了便利。但是關(guān)于水稻粒重的基因定位克隆任務(wù)依然艱巨(姚國新 和盧磊，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35 (27) =8468-8478)。當前，已經(jīng)定位的粒重數(shù)量性狀位點多達89個，分布于水稻的所有12條染色體上 (瑪麗蓮，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，碩士學(xué)位論文，2007)。徐建龍等(中國水稻科學(xué)，2002，16(3) 6-10)應(yīng)用292個Lemont/特青的重組自交系(RILs)檢測到影響千粒重的11個作物數(shù) 量性狀位點(quantitativetraitlocus, QTL)，分別位于第1、2、3、4、5、10和12染色體上， 聯(lián)合貢獻率為53.9%。林荔輝和吳為人(分子植物育種，2003(1) 337-342)利用以兩個 釉稻品種H 359和Acc8558為親本雜交建立的重組自交系群體檢測到16個與粒重有關(guān)的 QTL，可解釋81. 40%的表型變異，分布在8條不同的染色體上，其中有5個分布在第3染色 體上。美國康奈爾大學(xué)選用熱帶粳稻品種為輪回親本，與普通野生稻材料配制組合，構(gòu)建 了 353個株系組成的BCZF2 2群體，在千粒重性狀上檢測到8個QTL，其中位于水稻第3染 色體的近中心粒區(qū)間的gw3. 1表現(xiàn)最穩(wěn)定，貢獻率也較高(Li et al,Genetics 2004，168 2187-2195)。Li et al(Genetics 1997，145 :453_465)、Guo LB 等(plant breeding 2005， 124 :127-132)和 I shimaru(Plant Physiology 2003，133 :1083_1090)等利用不同的遺傳 群體也將一個粒重QTL定位在第6染色體上。雖然已經(jīng)定位的粒重QTL有89個，但是能夠?qū)⒘Ｖ鼗蚓毝ㄎ坏暮苌?。根?jù)現(xiàn) 有文獻，關(guān)于粒重基因的精細定位僅有g(shù)w3. 1 (Li et al,Genetics 2004,168:2187-2195)、 Lk-4 (t) (ZHOU LQ et al, Acta GenetSin, 2006, 33 72-79) > gw8. 1 (Xie et al, Theor Appl Genet, 2006，113 :885-894)、GS3 (FAN CC et al, Theor Appl Genel，2006，12 (6): 1164-1171)和 GW2 (XIAN-JUN S et al, Nature Genetic，2007，39 :623_630)?？寺〉牧Ｖ?基因僅有 GS3 粒長(FAN CC et al, Theor Appl Genel，2006，12 (6) 1164-1171)禾口 GW2 粒 寬(XIAN-JUN S et al,Nature Genetic, 2007, 39 623-630)基因。所以精細定位和克隆更 多的粒重基因成為當前提高水稻產(chǎn)量的重要工作。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人在已完成的水稻全基因組測序的基礎(chǔ)上，克隆了 517個基因，并分別進行 轉(zhuǎn)基因驗證其功能，通過與對照組比較，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化了 BGIos405基因的轉(zhuǎn)基因植株所產(chǎn)谷粒 明顯比對照組大，即轉(zhuǎn)基因植株的千粒重大大提高了。由此初步驗證了 BGIos405基因是與 控制顆粒大小的數(shù)量性狀相關(guān)的功能基因，完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明包括以下幾方面本發(fā)明的一個方面涉及一種具有促進植物籽粒變大功能的核苷酸序列，所述核苷 酸序列含有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，即BGIos 405基因，所述基因的序列如下ATGGCAATCAGCAGAAGGAGCTCCATGCTGTTGGTGATGGCCTTAGTGCTTGGGACGGTCTCCCTTGCC ACGGCCGCATCTGGAGTCGCCACCTTCTACACTCAATACACACCGTCGGCGTGCTACGGGAACAGGAACATGGGGAA CATGGTGGCGGCGGCGAACGACAGGTTGTACAACAACGGCGCCGTGTGCGGGCGGTGCTACGCCGTGAAGTGCGCCG GCGCGGCGGCCGGCGGCGGCGGAGGCAACCCCTGCACCGGCGCCAGCGTCACCGTGAAGATGGTCGACAACTGCGCC AGCAGCGACGGGTGCACGAGCACCATCGACCTCTCCAGGGAGGCCTTCGCCAAGATCGCCAACCTCGACGCCGGCGT CATCAGGATCACCTACAACCCAACGGTATGTCCGTAG(SEQ ID NO 1)本發(fā)明還涉及與SEQ ID NO 1所示序列互補的核苷酸序列，或其具有促進植物籽 粒變大功能的選自如下的變體1)在高等嚴緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修 飾的核苷酸序列，和3)與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。典型地，“雜交條件”根據(jù)測量雜交時所用條件的“嚴緊性”程度來分類。嚴緊性 程度可以以例如核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴緊性”典 型地發(fā)生在約Tm-5°C (低于探針Tm 5°C )；“高等嚴緊性”發(fā)生在Tm以下約5-10°C;“中等 嚴緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10-20°C ；“低嚴緊性”發(fā)生在Tm以下約20_25°C。作為替 代，或者進一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強度條件和/或一或多次的嚴緊性洗 滌為依據(jù)。例如，6XSSC =極低嚴緊性；3XSSC =低至中等嚴緊性；IXSSC =中等嚴緊性；0. 5XSSC =高等嚴緊性。從功能上說，可以采用最大嚴緊性條件確定與雜交探針嚴緊同一 或近嚴緊同一的核酸序列；而采用高等嚴緊性條件確定與該探針有約80%或更多序列同 一性的核酸序列。對于要求高選擇性的應(yīng)用，典型地期望采用相對嚴緊的條件來形成雜交體，例如， 選擇相對低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，實驗 室手冊，Cold Spring HarborPress, Plainview, N. Y.)提供了包括中等嚴緊性和高等嚴緊 性在內(nèi)的雜交條件。為便于說明，用于檢測本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴緊 條件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(ρΗ8· 0)溶液預(yù)洗；在 50-65°C下在 5XSSC 中 雜交過夜；隨后用含0. SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，能容易地操作雜交嚴緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜 交溫度。例如，在另一個實施方案中，合適的高度嚴緊雜交條件包括上述條件，不同之處在 于雜交溫度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本發(fā)明中，所述在高等嚴緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核 苷酸序列，其具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的促植物籽粒變大活性。在本發(fā)明中，所述對SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、 缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和 /或序列內(nèi)部進行例如不超過2-45個，或者不超過2-30個，或者不超過3-20個，或者不超 過4-15個，或者不超過5-10個，或者不超過6-8個的分別用逐個連續(xù)整數(shù)表示的堿基的取 代、缺失、添加修飾。在本發(fā)明中，所述對SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進行如上述一個或多個堿基 的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列具有與SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列相同或相似的 促植物籽粒變大活性。通過一種多核苷酸進行說明，其所具有的核苷酸序列例如與SEQID NO 1的參考 核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在SEQ IDNO 1的參考核苷酸序列之每100個核 苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達5個核苷酸的不同外，該多核苷酸之核苷 酸序列與參考序列相同。換句話說，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%相同 的多核苷酸，參考序列中多達5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些核 苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄?，其中插入的核苷酸可多達參考序列之總核苷酸的5% ；或在一些核苷 酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達參考序列之總核苷酸的5%。參考 序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在這些末端位置之間的 任意地方，它們或單獨散在于參考序列的核苷酸中，或以一個或多個鄰近的組存在于參考 序列中。在本發(fā)明中，用于確定序列同一性和序列相似性百分數(shù)的算法是例如BLAST和 BLAST 2.0 算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389_3402 和 Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如文獻中所述或者默認參數(shù)，BLAST 和BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的核苷酸序列同一性百分數(shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可 以通過國立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO :1所公開序列基本同一的多核苷酸序列，例如當采用本 文所述方法(例如采用標準參數(shù)的BLAST分析)時，與本發(fā)明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的 序列同一性的那些序列。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性 的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的促植物籽粒變大活性。在本發(fā)明中，所述的BGIos405基因來源于普通野生稻元江(Oryza. rifupongon Yuanjiang)。本發(fā)明的另一方面涉及一種載體，其特征在于，所述載體含有本發(fā)明所述的核苷 酸序列，所述載體可以通過例如將上述核苷酸序列插入克隆載體或表達載體而得到，或者 可以通過人工合成得到。本發(fā)明的另一方面涉及一種重組載體，其特征在于所述重組載體含有本發(fā)明所述 的核苷酸序列，所述重組載體可以通過將上述核苷酸序列插入克隆載體或表達載體而得 到。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組載體的克隆載體包括但不限于，例如pUC18、pUC19、 pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T SimpleVecter、pMD19_T Simple Vecter 等。適于構(gòu)建本發(fā)明所述的表達載體包括但不限于，例如pBI121、pl3W4、pGEM等。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述重組載體為p6+BGIos405重組載體。本發(fā)明的另一方面涉及一種含有本發(fā)明所述載體的重組細胞，所述重組細胞可以 通過將含有本發(fā)明所述的載體轉(zhuǎn)化至宿主細胞而得到。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組細胞的宿主細胞包括但不限于，例如根癌農(nóng)桿菌細胞 LBA4404、EHA105、GV3101 等。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述重組細胞為重組農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105-p6+BGIos405。本發(fā)明的還一方面涉及一種單子葉植物愈傷組織，其特征在于，所述愈傷組織轉(zhuǎn) 化有本發(fā)明的核苷酸序列和/或載體和/或感染有本發(fā)明的重組細胞。本發(fā)明的還一方面涉及一種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化有本 發(fā)明的核苷酸序列和/或載體和/或感染本發(fā)明的重組細胞。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的核苷酸序列和/或載體和/或重組細胞用于促進 植物籽粒變大的用途，以及用于制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種的用途。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的愈傷組織用于制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種 的用途。本發(fā)明的還一方面涉及一種促進植物籽粒變大的方法，所述方法包括將本發(fā)明的 核苷酸序列和/或載體轉(zhuǎn)化入植物，或用本發(fā)明的重組細胞感染植物。所述方法包括用本發(fā)明的核苷酸序列轉(zhuǎn)化單子葉植物的愈傷組織的步驟。在本發(fā) 明的一個實施方案中，所述單子葉植物愈傷組織的轉(zhuǎn)化利用了含有本發(fā)明的核苷酸序列的 重組細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述單子葉植物愈傷組織的轉(zhuǎn)化過程中利用了前 述的重組農(nóng)桿菌EHA105-p6+BGIoS405。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述單子葉植物 的愈傷組織為水稻愈傷組織，具體地，所述水稻為日本晴。
在本發(fā)明中，可采用植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將目的基因插入到植物基因組中，包括農(nóng) 桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉(zhuǎn)化和電穿孔等。本領(lǐng)域周 知，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化常被用于單子葉植物和雙子葉植物的基因轉(zhuǎn)化，但其它轉(zhuǎn)化技 術(shù)也可用于本發(fā)明所述單子葉植物的基因轉(zhuǎn)化。當然，適于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化單子葉植物的另 一種方法是粒子轟擊(顯微金或鎢粒子包覆轉(zhuǎn)化的DNA)胚性愈傷組織或胚胎開發(fā)。另外， 還可以采用的轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化?；蜣D(zhuǎn)化后，采用通用的方法來篩 選和再生整合有表達單元的植株。本發(fā)明的還一方面涉及一種產(chǎn)生籽粒變大的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括以 下步驟1)將本發(fā)明的核苷酸序列和/或載體轉(zhuǎn)化入植物愈傷組織，或用本發(fā)明的重組細 胞感染植物愈傷組織；2)利用所述愈傷組織再生轉(zhuǎn)基因植物。在本發(fā)明中，所述植物優(yōu)選是單子葉植物，所述單子葉植物包括但不限于水稻、谷 子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選為水稻，所述水稻包括但不限于，中花9、中花10、中花11、臺 北309、丹江8號、云稻2號、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22，黔優(yōu)88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu) 128,11優(yōu)718、準兩優(yōu)527、川農(nóng)1號、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、 皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖 稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101 (上述水稻品種均可購自安徽徽商農(nóng)家福有限公 司)。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述水稻為日本晴。在本發(fā)明中，所述籽粒變大是指在飽滿程度相當?shù)那闆r下，籽粒體積變大，千粒重 增加。在本發(fā)明的一個實施方案中，發(fā)明人從水稻元江中擴增得到基因BGIos405，將該 基因重組入新構(gòu)建的p6載體中得到含有該基因的重組表達載體，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，利用重 組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，通過水稻愈傷組織的GUS染色、轉(zhuǎn)基因小苗根、葉GUS染色及 轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的性狀觀察，并與未轉(zhuǎn)入BGIos405基因的組織或植物對比，證明BGIos405 基因能夠促進植物籽粒變大。發(fā)明的有益效果本發(fā)明利用高通量測序技術(shù)，通過基因的遺傳轉(zhuǎn)化，挖掘出促進籽粒變大的 BGIos405基因，所述基因能夠大大提高轉(zhuǎn)基因植物的千粒重，證明了 BGIos405基因是與控 制水稻顆粒大小的數(shù)量性狀相關(guān)的功能基因，這將有利于在分子水平上更深入探討該性狀 形成的生理機理和機制，達到對產(chǎn)量和品質(zhì)的合理調(diào)控作用，對水稻的遺傳育種產(chǎn)生重大 的意義。關(guān)于牛物材料保藏的說明本發(fā)明涉及以下生物材料普通野生稻元江種子，其于2010年9月6日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢 大學(xué)保藏中心，即中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC P201011 ；


圖1ρ6載體示意圖。
圖2經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織的⑶S染色結(jié)果。其中，由帶有本發(fā)明所述BGIos405 基因的重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-p6+BGIoS405轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織(右)經(jīng)⑶S染色后呈 現(xiàn)藍色；不帶有本發(fā)明BGIos405基因的重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-p6質(zhì)粒的水稻愈傷組織 (對照，左)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。圖3經(jīng)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因水稻苗的根的⑶S染色結(jié)果。其中，經(jīng)含有p6+BGIos332重 組載體的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻苗的根(右)、經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍色，陰性對照(左)經(jīng) GUS染色后顏色未發(fā)生變化。圖4轉(zhuǎn)基因水稻的籽粒觀察。其中，經(jīng)含有p6+BGIos405重組載體的根癌農(nóng)桿菌 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻籽粒(右)與陰性對照(左)相比，籽粒更大。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1BGIos405基因的PCR擴增和pMD18_T+BGIos405重組載體的構(gòu)建PCR 擴增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目錄 號DP 320-02)提取普通野生稻元江(Oryza.rifupongonYuanjiang)的基因組DNA，根據(jù)該 基因在gDNA中的序列，分別在首尾設(shè)計一對PCR特異性擴增引物(上游引物F1，加限制性 酶切位點BamHI和保護堿基，下游引物R1，加限制性酶切位點Xba I和保護堿基)。以上述 提取的元江的gDNA為模板，高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶進行PCR擴增。如表 1所示。表1目的基因擴增的PCR體系
組成_
基因組DNA
dNTPs ( 2. 5 mM)
IOx Ex Buffer (含鎂離子)
引物 Fl (50 μΜ)
引物 Rl (50 μΜ)
Ex taq
ddH20
體積(μ 1)
0. 2
補充至總體積25 μ PCR擴增程序為94°C預(yù)變性5min，然后以94°C變性45s，55°C退火50s，72°C延伸 90s，進行35個反應(yīng)循環(huán)，最后72°C延伸7min。其中，上游引物Fl CGCGGATCCATGGCAATCAGCAGAAGG (SEQ ID NO :2)，含 BamHI 酶切 位點。下游引物 Rl TGCTCTAGACGGACATACCGTTGGGTTG (SEQ ID NO: 3)，含 Xba I 酶切位點。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離，得到大小為410bp左右的條帶，使用 TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(目錄號DP209-03)進行純化回收。
pMD18-T+BGIos405 重組載體的構(gòu)津?qū)⑸鲜龅玫降腜CR擴增產(chǎn)物進行T/A克隆(pMD18-T質(zhì)粒，TaKaRa，D103A)，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌，挑取陽性克隆測序，證明準確。其中，T/A克隆的連接條件如下T/A 連接體系10 μ 1pMD18-T1 μ 12 X solution I5μ 1PCR擴增產(chǎn)物(回收插入片段)10-20ng，根據(jù)其濃度定ddH20補齊至 10 μ 1于16 °C在節(jié)能型智能恒溫槽(寧波新芝，SDC-6)中連接8h以上，得到 pMD18-T+BGIos405重組載體。將經(jīng)過上述連接后的產(chǎn)物按照如下方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌從超低溫冰箱中取出按照《分子克隆實驗指南》(第三版，科學(xué)出版社)所示氯 化鈣法制備的感受態(tài)細胞100μ 1 DH5(中國科學(xué)院昆明動物研究所董楊提供；或者可從例 如上海生工購得)，冰上融化后，加入10 μ 1如上所得的連接產(chǎn)物，即pMD18-T+BGIos405 重組載體，輕輕攪勻，冰浴30min，42°C熱激60s，冰浴5min，加入600 μ 1 4°C預(yù)冷的SOC培 養(yǎng)基(具體配方詳見《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社)，37°C 220rpm復(fù)蘇45min， 8000rpm離心30s，去上清，留取150 μ 1，用剩下的150 μ 1上清重懸沉淀后的混合物，輕輕吹 勻，玻璃珠涂布LB(加卡那霉素，Kan)平板(具體配方詳見《分子克隆實驗指南》，第三版， 科學(xué)出版社)，37°C倒置培養(yǎng)16-24h。獲得含有pMD18-T+BGIos405克隆載體的重組大腸桿 菌，命名為DH5a-BGIos405。深圳華大基因科技有限公司對pMD18_T+BGIos405克隆載體中 的BGIos405進行測序，測序結(jié)果與SEQ ID NO :1—致。表明獲得的pMD18_T+BGIos405克 隆載體中BGIos405基因序列正確。實施例2p6重組載體的構(gòu)建1)玉米Ubiquitin啟動子片段的PCR擴增和pMD18_T+Ubi重組載體的構(gòu)建Ubi啟動子PCR擴增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目 錄號DP320-02)提取玉米品種 B73(Zea mays mays cv. B73)的基因組 DNA (http://www. maizegdb. org/)，根據(jù)該啟動子在玉米B73gDNA中的序列，分別在首尾設(shè)計一對PCR特異性 擴增引物(上游引物F2 GGCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCGT (SEQ ID NO :4)，加限制性酶切位 點Pst I和保護堿基，下游引物R2 :GGCTGCAGAAGTAACACCAAAC(SEQ ID NO :5)，加限制性酶 切位點Pst I和保護堿基)。以上述提取的玉米B73的gDNA為模板，高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶進行PCR擴增。如表2所示。表2Ubi啟動子擴增的PCR體系
權(quán)利要求
1.一種具有促進植物籽粒變大功能的核苷酸序列，所述核苷酸序列含有SEQ ID NO 1 所示的核苷酸序列或與其互補的核苷酸序列，或其具有促進植物籽粒變大功能的選自如下 的變體1)在高等嚴緊條件下與SEQID NO :1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對SEQID NO :1所示的核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的 核苷酸序列，和3)與SEQID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。
2.一種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，例如所述載體 為p6+BGIos405重組載體。
3.一種含有權(quán)利要求2所述載體的重組細胞，例如所述重組細胞為重組農(nóng)桿菌 EHA105-p6+BGIos405o
4.一種單子葉植物愈傷組織，其特征在于，所述愈傷組織轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求1的核苷酸 序列和/或權(quán)利要求2的載體和/或感染有權(quán)利要求3的重組細胞；具體地，所述單子葉植 物為水稻、谷子、小麥、高粱、玉米；更具體地，所述單子葉植物為水稻，例如為日本晴。
5.一種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求1的核苷酸序列和 /或權(quán)利要求2的載體和/或感染有權(quán)利要求3的重組細胞；具體地，所述植物為單子葉植 物，特別是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米；更具體地，所述單子葉植物為水稻，例如為日本晴。
6.權(quán)利要求1的核苷酸序列和/或權(quán)利要求2的載體和/或權(quán)利要求3的重組細胞 用于促進植物籽粒變大的用途；所述植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選是水稻、谷子、小麥、高 粱、玉米，特別優(yōu)選是水稻，例如為日本晴。
7.權(quán)利要求1的核苷酸序列和/或權(quán)利要求2的載體和/或權(quán)利要求3的重組細胞用 于制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種的用途；所述植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選是水稻、谷 子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選是水稻，例如為日本晴。
8.權(quán)利要求4的愈傷組織用于制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種的用途；所述植物優(yōu)選 是單子葉植物，更優(yōu)選是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選是水稻，例如為日本晴。
9.一種促進植物籽粒變大的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1的核苷酸序列和/或權(quán) 利要求2的載體轉(zhuǎn)化入植物，或用權(quán)利要求3的重組細胞感染植物；所述植物優(yōu)選是單子葉 植物，更優(yōu)選是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選是水稻，例如為日本晴。
10.一種產(chǎn)生籽粒變大的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括以下步驟1)將權(quán)利要求1的核苷酸序列和/或權(quán)利要求2的載體轉(zhuǎn)化入植物愈傷組織，或用權(quán) 利要求3的重組細胞感染植物愈傷組織；2)利用所述愈傷組織再生轉(zhuǎn)基因植物；所述植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選是水稻， 例如為日本晴。
全文摘要
本發(fā)明涉及BGIos405基因及其用途。本發(fā)明的BGIos405基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或其具有促進植物籽粒變大功能的變體。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)化有BGIos405基因或其變體的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還涉及所述BGIos405基因或其變體用于促進植物籽粒變大的用途以及促進植物籽粒變大的方法。
文檔編號C12N15/29GK102094016SQ201010568938
公開日2011年6月15日 申請日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者倪雪梅, 孫紅正, 張耕耘, 李寧 申請人:深圳華大基因科技有限公司