專利名稱：高賴氨酸蛋白基因sb401表達載體的構(gòu)建方法及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種高賴氨酸蛋白基因Sb401表達載體的構(gòu)建方法及其應用。
背景技術(shù)：
玉米是我國的重要糧食作物。隨著玉米在產(chǎn)量、抗性等方面研究的深入，人們越來 越關(guān)玉米米品質(zhì)的提高。蛋白質(zhì)、氨基酸的含量是品質(zhì)的一個重要指標。增加玉米中蛋 白質(zhì)和賴氨酸的含量將提高玉米的生物價值，促進人和動物對其蛋白質(zhì)的消化吸收和利 用。玉米是我國的重要糧食作物。隨著玉米在產(chǎn)量、抗性等方面研究的深入，人們越來越關(guān) 玉米米品質(zhì)的提高。蛋白質(zhì)、氨基酸的含量是品質(zhì)的一個重要指標。增加玉米中蛋白質(zhì)和賴 氨酸的含量將提高玉米的生物價值，促進人和動物對其蛋白質(zhì)的消化吸收和利用。應用傳 統(tǒng)育種手段改良玉米蛋白質(zhì)品質(zhì)雖然取得了可喜的成績，但傳統(tǒng)育種方法周期長、見效慢、 受種質(zhì)資源的限制，且難以解決諸如玉米中蛋白質(zhì)的氨基酸營養(yǎng)組分不平衡和不含維生素 A等問題。由于玉米蛋白質(zhì)含量主要受遺傳基因控制，利用基因工程將自然界植物體內(nèi)分子 量較小、且富含賴氨酸的蛋白質(zhì)基因?qū)胗衩?，是一個改良玉米營養(yǎng)品質(zhì)的可行途徑。向植物中導入富含賴氨酸的外源蛋白基因是提高植物賴氨酸含量的一個有效途 徑。此類方法國內(nèi)也有一定的研究，孫學輝等(2001)將外源蛋白基因?qū)胗衩鬃越幌挡牧?P12和綜3獲得了賴氨酸含量提高16%的轉(zhuǎn)基因玉米材料，后通過常規(guī)育種方法獲得了穩(wěn)定 的轉(zhuǎn)基因玉米自交系該自交系的蛋白質(zhì)和賴氨酸含量均提高50%以上；王為民等(2004)用 基因槍法將該基因?qū)攵i稻中優(yōu)早5號，獲得了蛋白質(zhì)和賴氨酸的含量分別提高35. 18% 和45. 09%的Tl代轉(zhuǎn)基因植株。這些研究結(jié)果顯示了 M^V基因在提高作物賴氨酸含量、 改良作物蛋白質(zhì)品質(zhì)方面的良好應用前景。但是由于植物表達載體所用的啟動子不同，或 者遺傳轉(zhuǎn)化的方法不同，導致基因表達水平低，外源基因與載體構(gòu)成的重組DNA分子性質(zhì) 不同，宿主細胞也不同，將重組子導入宿主細胞的具體方法有許多優(yōu)越性，但同時也存在著 一些不足之處。例如，基因槍轟擊的隨機性導致轉(zhuǎn)化率不高；基因槍插入往往是多拷貝成 簇整合到受體基因組中，而且可能發(fā)生多種方式重排；同源序列能以DNA-DNA、DNA-RNA、 RNA-RNA的方式相互作用，導致轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默；轟擊過程中還可能造成外 源基因的斷裂，并且使插入的基因成為無活性的片段；出現(xiàn)非轉(zhuǎn)化體或嵌合體的可能性較 高以及基因槍轉(zhuǎn)化所用的成本較高等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高賴氨酸蛋白基因SB401表達載體的構(gòu)建方法及應用， 該方法費用低、拷貝數(shù)低、重復性好、基因沉默現(xiàn)象少、同時具有轉(zhuǎn)育周期短及能轉(zhuǎn)化較大 片段等獨特優(yōu)點。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
提取馬鈴薯花粉提取RNA，進行反轉(zhuǎn)錄，利用特異引物從馬鈴薯花粉里面克隆了高賴氨酸基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；根據(jù)克隆需要在序列兩端加上限制性內(nèi)切酶 識別位點序列并構(gòu)建到相應的表達載體上。主要包括以下步驟，
(1)提取馬鈴薯花粉高賴氨酸基因sb401總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；
(2)以上述cDNA為模板，以特異引物克隆馬鈴薯高賴氨酸基因sb401；
(3)將馬鈴薯高賴氨酸基因sb401與亞克隆載體pGSI連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.Coli JM109感受態(tài)細胞，構(gòu)建馬鈴薯高賴氨酸基因sb401亞克隆載體質(zhì)粒；
(4)將上述克隆質(zhì)粒構(gòu)建到植物表達載體pCAMBIA1300，獲得含高賴氨酸基因sb401片 段重組表達載體CUB-sb401。在植物雙元表達載體pCAMBIA1300中插入SB401基因，啟動子來自玉米基因組 Ubiquitin基因，是一個在單子葉植物中有較強表達的啟動子，負責啟動SB401基因基因表 達，Ubi啟動子它來自于玉米多聚泛素蛋白基因(maiz印loyubigene)，它實際上包含Ubi 基因的啟動子區(qū)，5’非翻譯區(qū)和第一內(nèi)含子；在脅迫條件下(如熱休克)Ubiqutin啟動子的 表達活性顯著增強。所述馬鈴薯高賴氨酸基因SB401具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。所述特異引物序列如下(如SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4所示) 上游弓I物 Fl: 5' -ggatccttttctttttgcaagttcctcc-3'；
下游弓I物 Rl: 5' -gagctcaaagaaatccccaaaagaaag-3'。將上述表達載體導入相應的農(nóng)桿菌中，進而將含高賴氨酸基因sb401片段重組表 達載體CUB-sb401導入玉米愈傷組織，經(jīng)過侵染、恢復、選擇、再生、煉苗等階段，獲得轉(zhuǎn)基 因苗，培育高賴氨酸玉米；也可以對其它農(nóng)作物(農(nóng)作物、果樹或蔬菜，如水稻、小麥等)進行 遺傳轉(zhuǎn)化，提其賴氨酸的含量，進而提高農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)。上述高賴氨酸基因編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。本發(fā)明具有積極有益的效果
在載體構(gòu)建中使用自玉米基因組高效表達啟動子Ubiquitin基因，負責啟動SB401基 因基因表達，所用的篩選標記基因為bar基因，bar基因在生物安全性上比其它標記基因要 好，它的編碼蛋白在人體內(nèi)不存在，并且和已知的毒蛋白無同源序列，也不具過敏原，相對 較為安全。通過農(nóng)桿菌介導的方法進行高賴氨酸基因的遺傳轉(zhuǎn)化，不但費用低、拷貝數(shù)低、重 復性好、基因沉默現(xiàn)象少、同時具有轉(zhuǎn)育周期短及能轉(zhuǎn)化較大片段等獨特優(yōu)點；通過本發(fā)明 方法使sb401基因成功轉(zhuǎn)化到玉米中，并獲得了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化苗。編碼馬鈴薯花粉特異水溶性蛋白的SB401基因編碼的蛋白質(zhì)中賴氨酸含量高達 16. 7%，是目前報道的賴氨酸含量較高的蛋白質(zhì)編碼基因，該基因高效表達后可以提高玉米 賴氨酸的含量，進而提高玉米的品質(zhì)。


圖1 pGSI-SB401用BamHI和SacI酶切鑒定圖，證明SB401基因連入pGSI載體 中，所的到的片段為SB401基因片段；Marker分子量大小分別為2000bp，IOOObp, 750bp, 500bp, 200bp ；pGSI是上海生工提供的的亞克隆，是經(jīng)過改造的pBSK ；
圖2為CUBSB401用BamHI和SacI酶切鑒定圖，證明SB401基因連入植物表達載體
4CUB中，所的到的酶切片段為SB401基因片段；Marker分子量大小為2900bp，IlOObp, 500bp, 400bp, 300bp, 200bp, IOObp ；
圖 3 為 CUB (pCAMBIA1300-Ubi-MCS-Bar)質(zhì)粒圖譜；
圖4為采用農(nóng)桿菌介導法獲得的轉(zhuǎn)SB401基因玉米照片；其中，愈傷組織的篩選(左)、 再生(中)以及轉(zhuǎn)基因植株移栽到大田(右)；
圖5為TO代轉(zhuǎn)化體目的基因SB401的PCR檢測結(jié)果圖譜，其中，M為M:DL2000 plus ； CKl為陽性質(zhì)粒對照；CK2為未轉(zhuǎn)基因陰性對照；空白為雙蒸水對照；1-8是SB401-1到 SB401-8。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。下述實施例中的試驗方法，如無特別說 明，均為常規(guī)方法；下述實施例中所用的試驗材料及試劑，如無特別說明，均購自常規(guī)生化 試齊Ll商店。實施例一高賴氨酸蛋白基因Sb401表達載體的構(gòu)建方法，具體步驟如下
1.選取新鮮馬鈴薯花粉材料0.lg，以Plant RNA Midi Kit試劑盒(購自上海生物工程 有限公司)提取馬鈴薯高賴氨酸基因sb401總RNA
2.逆轉(zhuǎn)錄
第一鏈cDNA合成采用Promega公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶在0. 5mL離心管內(nèi)混合下列試
劑
5μ gRNA樣品
2mL01igo(dT) 15 (250ng/mL)
H2O
28mLTotal
樣品混勻后，短暫離心，65°C變性5min，迅速置于冰上冷卻lOmin，短暫離心后，再向管 內(nèi)加入下列試劑
8mL5X First-strand Buffer
2mLdNTP (IOmM)
ImLRNA酶抑制劑
ImL逆轉(zhuǎn)錄酶(200units/mL)
12mLTotal
用移液槍輕輕混勻樣品，置于42°C空氣浴中反應1小時，然后將樣品置于70°C處理15 分鐘終止反應，冰上冷卻后，_20°C保存。3.馬鈴薯高賴氨酸基因sb401的克隆
根據(jù)克隆高賴氨酸基因SB401的需要，我們設計了克隆引物，并在上游引物序列的 5’端添加BamHI內(nèi)切酶識別位點序列CATATG，3’端添加HindIII內(nèi)切酶識別位點序列 AAGCTT0設計引物序列如下
上游弓丨物 Fl: 5，-GGATCCttttctttttgcaagttcctcc-3，； 下游引物 Rl: 5' -GAGCTCaaagaaatccccaaaagaaag-3'。以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA(全株總RNA逆轉(zhuǎn)錄)為模板，以F1、R1為引物，擴增SB401基因，PCR條件為 95 0C, 5 分鐘； 95 0C變性30秒； 58 0C退火30秒； 72 0C延伸60秒； 72 0C延伸10分鐘； 反應體系為20μ
目的片段大小901bp，退火溫度60°C，33個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳確認后，回收。4.構(gòu)建高賴氨酸基因sb401基因克隆載體
(1)將上述擴增的SB401基因片段凝膠回收純化，步驟如下
①在UV燈下切膠，放入滅菌的1.5mL離心管中；
②加入等體積的NJ緩沖液；
③55 65°C溫浴7分鐘，至膠融解，每2分鐘搖一下；
④將上述溶膠700μ 轉(zhuǎn)移至Mu-PuDNA回收純化柱中；
⑤室溫下IOOOOrpm離心1分鐘，棄流出液；
⑥加入50(^LSPW(乙醇稀釋)洗滌2次(IOOOOrpm離心洗)，倒掉流出液；
⑦IOOOOrpm離心2分鐘；
將柱子放入1. 5mL離心管中，加入30 50μ 無菌水洗脫DNA。(2)SB401基因片段和亞克隆載體pGSI連接，連接體系如下
克隆載體PGSI μ
T4DNA連接緩沖液WL
T4DNA連接酶IPL
PCR產(chǎn)物7μ Total ΙΟμ
以上混合物在16 0C連接反應16小時
(3)構(gòu)建所得亞克隆載體命名pGSISB401，用BamHI和SacI限制性內(nèi)切酶進行酶切鑒 定，表明載體構(gòu)建正確(參見圖1)。用PGSISB401質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.Coli JM109感受態(tài)細胞(購自 于上海生物工程有限公司)。
5.植物表達載體構(gòu)建
(1)用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI雙酶切上述pGSISB401質(zhì)粒，用凝膠回收純化試劑 盒回收SB401片段；同時用BamHI和SacI雙酶切植物表達載體CUB(由山東大學提供，也可 以從市場中購買)，用凝膠回收純化試劑盒回收酶切后的CUB片段；將兩個片段進行連接反 應，連接反應體系如下
CUB植物表達載體(BamHI、Sac I酶切后)1 μ
T4DNA連接緩沖液 μ
T4DNA連接酶 μ
sb401基因片段7μ
TotalΙΟμ 以上混合物在16 0C連接反應16小時。(2)構(gòu)建好的植物表達載體為pCAMBIA1300-SB401_Bar(啟動子為Ubiquitin，標記 基因為吸水鏈霉菌的抗除草劑基因Bar)，將質(zhì)粒pCAMBIA1300-SB401-Bar用BamHI和SacI 進行酶切鑒定，鑒定出重組質(zhì)粒CUB-sb401含有高賴氨酸基因sb401片段，表明載體構(gòu)建正 確(圖2)。然后轉(zhuǎn)化E. Coli JM109感受態(tài)細胞(購自于上海生物工程有限公司)。其中，CUB(pCAMBIA1300-Ubiquitin-MCS_Bar (參見圖 3)，質(zhì)粒是在 pCAMBIA1300 質(zhì)?；A(chǔ)上構(gòu)建的質(zhì)粒，含有一個目的基因插入盒(35S—多克隆酶切位點一 Tnos)和一 個來自吸水鏈霉菌的抗除草劑基因Bar質(zhì)粒pCAMBIA1300為澳大利亞CAMBIA (Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)公司產(chǎn)品，參 考網(wǎng)址 http://www. cambia. org/daisy/cambia/585. html。實施例二玉米農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
本實驗采用根瘤農(nóng)桿菌介導法將含高賴氨酸基因sb401片段重組表達載體CUB-sb401 含導入玉米愈傷組織，經(jīng)過侵染、恢復、選擇、再生、煉苗等階段，獲得轉(zhuǎn)基因苗(參見圖4)。 其具體步驟如下
1.農(nóng)桿菌侵染幼胚把剛剝離的幼胚放入含有D-inf (2ml)的離心管中，每管約 20 100個幼胚，用這樣的培養(yǎng)基浸泡Ih以上，然后濾出D-inf，加入1 1. 5ml特定濃度 (0D600=0. 3 0. 4)的農(nóng)桿菌菌液，輕輕顛倒離心管20次，然后直立放置在暗箱里5分鐘， 確保幼胚全部浸泡在農(nóng)桿菌液體里，整個過程避免旋渦振蕩，五分鐘后將幼胚及菌液倒于 滅菌的吸水紙上吸干(約2 5min)。2.共培養(yǎng)侵染后，把侵染過的幼胚轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)上，使幼胚的盾片朝上，同時 吸除培養(yǎng)基表面多余的農(nóng)桿菌，將晾干后的愈傷組織置于鋪有滅菌濾紙的共培養(yǎng)基上，用 封口膜封住培養(yǎng)皿，培養(yǎng)箱中20°C左右暗培養(yǎng)3天。3.恢復培養(yǎng)共培養(yǎng)3天后，把幼胚(愈傷組織)轉(zhuǎn)移到resting medium上面，同 時用封口膜封住培養(yǎng)皿，放在28°C條件下暗培養(yǎng)7 10天。4.選擇7 10天后，把所有的幼胚(愈傷組織)轉(zhuǎn)移到選擇(依載體不同選擇合 適的選擇標記)
培養(yǎng)基上面，可以經(jīng)過多輪篩選，每次選擇培養(yǎng)兩周，選擇標記濃度適當?shù)卦龃蟆１热纾?選擇培養(yǎng)基I含有Bar 1. 5mg/L，兩周后再進行第二輪篩選時Bar的濃度可以增加到3mg/ L，第三輪篩選時可以增Bar的濃度可以增加到4. 5mg/L。5.轉(zhuǎn)基因植株的再生經(jīng)過多輪篩選后，將長出的顏色較鮮艷的抗性愈傷放在再 生培養(yǎng)基I上面，暗培養(yǎng)2 3周，當出現(xiàn)胚狀體后將胚狀體轉(zhuǎn)到再生培養(yǎng)基II上光照培 養(yǎng)，誘導分化，約三天后胚狀體將出現(xiàn)綠點；約2周后，會有幼苗分化出來，取處于再生培養(yǎng) 基II中長至2cm以上高的苗將其轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基中，繼續(xù)在光照培養(yǎng)室培養(yǎng)；在經(jīng)2 周后當幼苗長出3條根以上、高度約8cm以上時，打開瓶蓋，在培養(yǎng)基上加少許滅菌水進行 煉苗處理，并繼續(xù)在光照培養(yǎng)室中生長。6.三天后將幼苗從培養(yǎng)瓶中取出，將苗移栽含有泥炭土和蛭石(3:1)的營養(yǎng)缽 中，最后把苗移入人工氣候室中。實施例三轉(zhuǎn)基因玉米植株P(guān)CR檢測
實施例二中移栽成活的轉(zhuǎn)化植株長出7 8葉時，取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測是否帶有外源基因；植物DNA提取以Saghai-Maroof等提出的CTAB的方法進行；采用 PCR技術(shù)檢測外源基因；圖5中顯示了 TO代轉(zhuǎn)化體目的基因sb401的PCR檢測結(jié)果，其中 M :M:DL2000 plus ；CKl 陽性質(zhì)粒對照；CK2 未轉(zhuǎn)基因陰性對照；空白雙蒸水對照；1_8 sb401-l 到 sb401-8。所用的 PCR 檢測引物為(如 SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6 所示) Y2-SB401 5' -cacgcagttgcaacggagaacg-3' R2SB401 5' _ataaacactcttccttccatat_3' 目的片段大小560 bp，退火溫度58°C，35個循環(huán)。玉米植株DNA的提取步驟如下
1.取約Icm2左右新鮮幼嫩葉片放在1. 5ml的Eppendorf管中，然后將放有葉子的管 插在冰盒中，以保持新鮮度；
3.取液氮，將材料速凍，用鉆頭將材料研磨成粉，向管中迅速加入600ul提取緩沖液 (65°C預熱的CTAB，2%β -巰基乙醇)，振蕩混勻，在65°C水浴鍋中溫育30min，其間顛倒3_4 次，混勻；
4.將離心機降溫，在4°C條件下，12500rpm離心IOmin；
5.取上清，加入等體積氯仿異戊醇(24:1)，混勻，抽提lOmin，至溶液呈乳濁狀。在 室溫下離心，12500rpm, IOmin ；
6.取上清液(約400ul)移至一個新的1.5mL離心管中，并加入2倍體積的無水乙醇， 顛倒混勻，在_20°C放置30min ；
7.將離心機降溫，在4°C條件下12500rpm離心IOmin；
8.沉淀用70%乙醇洗二次，7500rpm離心2min，將70%乙醇倒，空甩，用移液槍吸棄殘 存的乙醇，然后在37°C烘箱中烘干20min左右；
12.將DNA溶于50-100ul無菌水中，4°C保存。轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR操作步驟如下
1.先在PCR板每個孔中，加入DNA模板；
2.配制混合物取一新的Eppendorf管，將除DNA模板以外的其它試劑按照所需要的 總量混合在一起形成混合物，其試劑加入順序為無菌水、PCR反應緩沖液、引物、dNTP，最 后加Taq DNA聚合酶。；
3.分裝混合物將配制的混合物混勻后分裝到PCR板每個孔中；
4.混勻，在離心機上甩一下，加入一滴石蠟油；
5.將PCR板放入PCR儀中，按所需程序操作，PCR反應體系
DNA模板2PL
IOXPCR反應緩沖液2PL
上游引物(IOmM)0. 2μ
下游引物(IOmM)0. 2μ
dNTP (IOmM each)0. 4μ
Taq DNA 聚合酶(5υ/μ1)0. 2μ
無菌水15μ
6.植物DNA的酶切、電泳均按常規(guī)方法進行。
實施例四轉(zhuǎn)基因玉米種子中賴氨酸含量檢測選取3個株系TO代轉(zhuǎn)基因玉米株系，測定其賴氨酸和蛋白質(zhì)在種子干重中的百分含 量。測定結(jié)果表明與非轉(zhuǎn)基因苗相比，轉(zhuǎn)高賴氨酸基因的轉(zhuǎn)基因株系其賴氨酸和蛋白質(zhì)的 含量都有較大幅度的提高，提高幅度分別為32. 26% 48. 39%和37. 94% 49. 93%。測定結(jié) 果如表1所示
表1 TO代部分轉(zhuǎn)基因玉米株系賴氨酸和蛋白質(zhì)含量檢測結(jié)果
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā) 明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在 不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.一種高賴氨酸蛋白基因Sb401植物表達載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)提取馬鈴薯花粉高賴氨酸基因Sb401總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成CDNA；(2)以上述cDNA為模板，以特異引物克隆馬鈴薯高賴氨酸基因sb401；(3)將馬鈴薯高賴氨酸基因sb401與亞克隆載體pGSI連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.Coli JM109感受態(tài)細胞，構(gòu)建馬鈴薯高賴氨酸基因sb401亞克隆載體質(zhì)粒；(4)將上述克隆質(zhì)粒構(gòu)建到植物表達載體pCAMBIA1300，獲得含高賴氨酸基因sb401片 段重組表達載體CUB-sb401。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述高賴氨酸蛋白基因Sb401表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所 述馬鈴薯高賴氨酸基因SB401具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述高賴氨酸蛋白基因Sb401表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所 述特異引物序列如下上游弓I物 Fl: 5' -ggatccttttctttttgcaagttcctcc-3'；下游弓I物 Rl: 5' -gagctcaaagaaatccccaaaagaaag-3'。
4.權(quán)利要求1所述高賴氨酸蛋白基因Sb401植物表達載體在玉米育種上的應用，其特 征在于，采用根瘤農(nóng)桿菌介導法將含高賴氨酸基因sb401片段重組表達載體CUB-sb401導 入玉米愈傷組織，經(jīng)過侵染、恢復、選擇、再生、煉苗等階段，獲得轉(zhuǎn)基因苗。
5.權(quán)利要求1所述高賴氨酸蛋白基因Sb401植物表達載體在提高轉(zhuǎn)基因植物高賴氨酸 中的應用。
6.如權(quán)利要求5所述的應用，所述植物為玉米。
全文摘要
本發(fā)明涉及高賴氨酸蛋白基因Sb401表達載體的構(gòu)建與應用。旨在解決將外源高賴氨酸蛋白基因?qū)胫仓曛胁⒏咝Р⒏咝П磉_的技術(shù)難題。該方法將采用提取馬鈴薯的RNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲得馬鈴薯全長CDNA，用PCR方法獲得sb401基因，并將該基因重組后克隆到植物雙元表達載體中；通過農(nóng)桿菌介導方法將該基因?qū)胗衩谆蚪M，并獲得表達轉(zhuǎn)基因陽性苗，并高效表達，可以提高玉米賴氨酸的含量，進而提高玉米的品質(zhì)；本發(fā)明方法費用低、拷貝數(shù)低、重復性好、基因沉默現(xiàn)象少、同時具有轉(zhuǎn)育周期短及能轉(zhuǎn)化較大片段等獨特優(yōu)點。
文檔編號C12N15/82GK102071216SQ20101057255
公開日2011年5月25日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者盧彩霞, 孫靜, 岳潤清, 朱衛(wèi)紅, 柏松, 王延召, 鐵雙貴, 齊建雙 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學院