專利名稱：模板線性擴(kuò)增和多生物素信號的雙重放大方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命物質(zhì)的檢測，尤其涉及對生命特征物質(zhì)的檢測。
背景技術(shù)：
一方面，呼吸道疾病由RNA (核糖核酸)病毒、DNA (脫氧核糖核酸)病毒或細(xì)菌引起。確定病原體種類對選擇針對性藥物至關(guān)重要。由于標(biāo)本中病原體核酸量少，需要用模板擴(kuò)增如PCR (聚合酶鏈反應(yīng))或信號放大如bDNA技術(shù)(枝鏈核酸信號放大技術(shù))來進(jìn)行檢測。PCR是最常用于診斷的方法。不過，由于PCR應(yīng)用過程中的一些缺陷，如非線性擴(kuò)增、假陽性以及實(shí)時PCR檢測時的高成本，其不是應(yīng)用的最理想的方式。呼吸道疾病的診斷可選擇性的通過模板擴(kuò)增來達(dá)到，但模板擴(kuò)增后，通常需要雜交過夜檢測，這樣對于臨床就不是一個很合適的方法。另一方面，中國專利CN101792800A所公開的一種多生物素信號放大方法，通過一多生物素分子的連接對待檢測信號進(jìn)行放大以提升核酸檢測的靈敏度，該多生物素分子包括通過雜交識別連接物分子的單鏈核酸分子和用于生物素標(biāo)記的載體分子。從而一個靶分子可以與連接分子、載體分子和多個生物素以及相應(yīng)的標(biāo)記物連接而使檢測的信號得到放大。在靶分子的不同區(qū)域連接上多個連接物分子，可獲得更大的放大效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足而提出一種成本低、數(shù)據(jù)更可靠并且敏感性和檢測時間與PCR方法類似的放大方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，設(shè)計(jì)制造一種模板線性擴(kuò)增和多生物素信號的雙重放大方法，其包括步驟有核酸分離，從標(biāo)本中分離核酸；T7 RNA聚合酶線性擴(kuò)增，得到RNA產(chǎn)物；以及，將線性擴(kuò)增的RNA產(chǎn)物捕獲到微孔板上，進(jìn)行信號放大。在本發(fā)明中，對于該核酸是DNA的情況，在線性擴(kuò)增之前還包括在加入轉(zhuǎn)錄酶之前采用加熱或NaOH/HCl進(jìn)行變性；與第一條引物退火后，DNA聚合酶可用于第一鏈和第二鏈的合成一帶有一設(shè)定啟動子的dsDNA (雙鏈DNA)。在本發(fā)明中，對于該核酸是RNA的情況，在線性擴(kuò)增之前還包括將該RNA轉(zhuǎn)化為 dsDNA的過程。將該RNA轉(zhuǎn)化為dsDNA的過程包括以帶有一設(shè)定啟動子的引物用反轉(zhuǎn)錄酶AMV (來自禽成纖維病毒逆轉(zhuǎn)錄酶)或MMLV (來自鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄酶)將該RNA轉(zhuǎn)變成cDNA (complementary DNA，互補(bǔ) DNA)，再用 RNase H (RNA 酶 H)處理，使 RNA/DNA 變成單鏈的 cDNA，在DNA聚合酶和第二條引物作用下，以合成該dsDNA。將該RNA轉(zhuǎn)化為dsDNA的過程包括以帶有一設(shè)定啟動子的引物用反轉(zhuǎn)錄酶AMV 或MMLV將該RNA轉(zhuǎn)變成cDNA ；該cDNA通過92度加熱變性，與第二條引物退火后，用DNA聚合酶制備該dsDNA。
將該RNA轉(zhuǎn)化為dsDNA的過程包括以帶有一設(shè)定啟動子的引物用反轉(zhuǎn)錄酶AMV 或MMLV將該RNA轉(zhuǎn)變成cDNA ；該cDNA通過92度加熱變性，與第二條引物退火后，通過PCR 的一個循環(huán)以合成該dsDNA。將該RNA轉(zhuǎn)化為dsDNA的過程包括通過一設(shè)定啟動子制備dsDNA是采用NASBA (nucleic acid sequence based amplification，基于核酸序列的擴(kuò)增技術(shù))描述的步驟， 其具體包括AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase H和T7 RNA聚合酶與二條引物一起加入，其中一條引物帶有T7啟動子。該設(shè)定啟動子為T7、T3或SP6啟動子，或者T7、Τ3或SP6 RNA聚合酶。在本發(fā)明中，該信號放大的過程具體包括通過一多生物素分子的連接對該RNA 產(chǎn)物進(jìn)行放大，該多生物素分子包括通過雜交識別連接物分子的單鏈DNA分子和用于生物素標(biāo)記的載體分子。該載體分子上的生物素為通過酶反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)雜交標(biāo)記的生物素。同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的模板線性擴(kuò)增和多生物素信號的雙重放大方法，成本低、數(shù)據(jù)更可靠并且敏感性和檢測時間與PCR方法類似。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合各附圖
所示之最佳實(shí)施例作進(jìn)一步詳述。本發(fā)明的模板線性擴(kuò)增和多生物素信號的雙重放大方法，是一種結(jié)合Τ7擴(kuò)增和多生物素信號放大(MBSA)的雙擴(kuò)增方法。其中，靶核酸先由Τ7線性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過 MBSA分析。與PCR不同，Τ7 RNA線性擴(kuò)增不改變核酸模板的比例，其擴(kuò)增的終產(chǎn)物是單鏈的RNA，RNA再用MBSA定量檢測。MBSA是一種高敏的檢測方法，通過雜交過夜，其可以檢測到100個靶分子。但是靶通過T7RNA聚合酶擴(kuò)增后，雜交就可縮短在2小時以內(nèi)。該雙重放大方法，包括的步驟有 1、核酸分離
從標(biāo)本中分離核酸。無論RNA還是DNA，用商品化的核酸分離試劑盒，如核酸抽提用 NucliSens Extractor(BioMerieux, Boxtel, The Netherland)。2、T7 擴(kuò)增
如果模板是RNA的話，有許多方法可用來轉(zhuǎn)化，在T7RNA擴(kuò)增前使之成為dsDNA。Α、以帶有T7啟動子的引物用反轉(zhuǎn)錄酶AMV或MMLV將RNA轉(zhuǎn)變成cDNA，再用RNase H處理，使RNA/DNA變成單鏈的cDNA，在DNA聚合酶和第二條引物作用下，其可做為合成 dsDNA的模板。B、cDNA通過92C加熱變性，與第二條引物退火后，用DNA聚合酶制備dsDNA，也可通過PCR的一個循環(huán)達(dá)到。C、第三種方法，通過T7啟動子制備dsDNA是用NASBA描述的方法步驟。在這個方法中，AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase H和T7 RNA聚合酶與二條引物一起加入，其中一條引物帶有T7
啟動子。如果靶是DNA，在加入轉(zhuǎn)錄酶之前需要變性，變性可通過加熱或NaOH/HCl ；與第一條引物退火后，DNA聚合酶可用于第一鏈和第二鏈的合成。帶有T7啟動子的dsDNA就可以在T7 RNA聚合酶作用下轉(zhuǎn)錄成RNA。
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上述的T7啟動子或T7 RNA聚合酶可用其它啟動子如T3和SP6以及T3和SP6 RNA聚合酶。3、信號放大
擴(kuò)增的RNA產(chǎn)物捕獲到微孔板上，用多生物素信號放大或其它信號放大方法檢測。該信號放大的過程具體包括通過一多生物素分子的連接對該RNA產(chǎn)物進(jìn)行放大，該多生物素分子包括通過雜交識別連接物分子的單鏈DNA分子和用于生物素標(biāo)記的載體分子。該載體分子上的生物素為通過酶反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)雜交標(biāo)記的生物素。本發(fā)明的模板線性擴(kuò)增和多生物素信號的雙重放大方法，與實(shí)時PCR相比，具有許多優(yōu)點(diǎn)成本低，該方法不需要貴重儀器和昂貴的熒光探針；該方法在擴(kuò)增中不會改變模板的比例，因而數(shù)據(jù)更可靠；敏感性和檢測時間與PCR類似。以上，僅為本發(fā)明之較佳實(shí)施例，意在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非對其進(jìn)行限定。凡根據(jù)上述之文字和附圖所公開的內(nèi)容進(jìn)行的簡單的替換，都在本專利的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種模板線性擴(kuò)增和多生物素信號的雙重放大方法，其特征在于，包括步驟有核酸分離，從標(biāo)本中分離核酸；T7 RNA聚合酶線性擴(kuò)增，得到RNA產(chǎn)物；以及，將線性擴(kuò)增的RNA產(chǎn)物捕獲到微孔板上，進(jìn)行信號放大。
2.如權(quán)利要求1所述的雙重放大方法，其特征在于，對于該核酸是DNA的情況，在線性擴(kuò)增之前還包括在加入轉(zhuǎn)錄酶之前采用加熱或NaOH/HCl進(jìn)行變性；與第一條引物退火后，DNA聚合酶可用于第一鏈和第二鏈的合成一帶有一設(shè)定啟動子的dsDNA。
3.如權(quán)利要求1所述的雙重放大方法，其特征在于，對于該核酸是RNA的情況，在線性擴(kuò)增之前還包括將該RNA轉(zhuǎn)化為dsDNA的過程。
4.如權(quán)利要求3所述的雙重放大方法，其特征在于，將該RNA轉(zhuǎn)化為dsDNA的過程包括以帶有一設(shè)定啟動子的引物用反轉(zhuǎn)錄酶AMV或MMLV將該RNA轉(zhuǎn)變成cDNA，再用RNase H處理，使RNA/DNA變成單鏈的cDNA，在DNA聚合酶和第二條引物作用下，以合成該dsDNA。
5.如權(quán)利要求3所述的雙重放大方法，其特征在于，將該RNA轉(zhuǎn)化為dsDNA的過程包括以帶有一設(shè)定啟動子的引物用反轉(zhuǎn)錄酶AMV或MMLV將該RNA轉(zhuǎn)變成cDNA ；該cDNA通過92度加熱變性，與第二條引物退火后，用DNA聚合酶制備該dsDNA。
6.如權(quán)利要求3所述的雙重放大方法，其特征在于，將該RNA轉(zhuǎn)化為dsDNA的過程包括以帶有一設(shè)定啟動子的引物用反轉(zhuǎn)錄酶AMV或MMLV將該RNA轉(zhuǎn)變成cDNA ；該cDNA通過92度加熱變性，與第二條引物退火后，通過PCR的一個循環(huán)以合成該dsDNA。
7.如權(quán)利要求3所述的雙重放大方法，其特征在于，將該RNA轉(zhuǎn)化為dsDNA的過程包括通過一設(shè)定啟動子制備dsDNA是采用NASBA描述的步驟，其具體包括AMV反轉(zhuǎn)錄酶、 RNase H和T7 RNA聚合酶與二條引物一起加入，其中一條引物帶有T7啟動子。
8.如權(quán)利要求2、4、5、6或7所述的雙重放大方法，其特征在于，該設(shè)定啟動子為T7、T3 或SP6啟動子，或者Τ7、Τ3或SP6 RNA聚合酶。
9.如權(quán)利要求1所述的雙重放大方法，其特征在于，該信號放大的過程具體包括通過一多生物素分子的連接對該RNA產(chǎn)物進(jìn)行放大，該多生物素分子包括通過雜交識別連接物分子的單鏈DNA分子和用于生物素標(biāo)記的載體分子。
10.如權(quán)利要求9所述的雙重放大方法，其特征在于，該載體分子上的生物素為通過酶反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)雜交標(biāo)記的生物素。
全文摘要
一種模板線性擴(kuò)增和多生物素信號的雙重放大方法，包括步驟有核酸分離，從標(biāo)本中分離核酸；T7RNA聚合酶線性擴(kuò)增，得到RNA產(chǎn)物；以及，將線性擴(kuò)增的RNA產(chǎn)物捕獲到微孔板上，進(jìn)行信號放大。成本低、數(shù)據(jù)更可靠并且敏感性和檢測時間與PCR方法類似。
文檔編號C12Q1/68GK102485906SQ201010572588
公開日2012年6月6日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者姜昕, 李先強(qiáng) 申請人:武漢中幟生物科技有限公司