專利名稱：豬gigyf2基因中一個(gè)可用于溯源的snp標(biāo)記及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬食品安全領(lǐng)域，具體涉及一種豬GIGYF2基因中一個(gè)可用于溯源的SNP標(biāo)記及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
隨著生活水平和保健意識(shí)的提高，人們?cè)絹碓阶⒅厥称钒踩珕栴}。豬肉制品作為人膳食中重要的蛋白質(zhì)來源，如何確保其安全衛(wèi)生，保障消費(fèi)者的身體健康和生命安全已成為全球性的熱點(diǎn)問題。世界各國政府紛紛采取一系列的技術(shù)措施來強(qiáng)化對(duì)肉產(chǎn)品的安全管理，以期最大程度上減少食品安全事件的發(fā)生。我國各大城市也紛紛建立了肉產(chǎn)品的追溯系統(tǒng)，通過肉制品的溯源管理，能夠?yàn)橄M(fèi)者提供準(zhǔn)確而詳細(xì)的有關(guān)產(chǎn)品的信息，有利于生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)者及時(shí)發(fā)現(xiàn)各環(huán)節(jié)中存在的不安全隱患，為消費(fèi)者提供一個(gè)獲取有效可靠信息的途徑。更為重要的是，大大加強(qiáng)了政府部門對(duì)肉質(zhì)品質(zhì)量安全的監(jiān)管，為國家迅速建立食品安全風(fēng)險(xiǎn)的應(yīng)對(duì)機(jī)制提供有效信息，將有助于社會(huì)的安定。但是我國肉產(chǎn)品追溯系統(tǒng)所采用的標(biāo)簽技術(shù)存在標(biāo)簽丟失、記錄出差、標(biāo)記圖案模糊不清以及標(biāo)簽容易人為改換等缺點(diǎn)；而國外發(fā)達(dá)國家所采用的DNA溯源技術(shù)是基于個(gè)體DNA指紋圖譜的生物學(xué)技術(shù)，有著絕對(duì)的不可更改性和唯一性，不受人為因素影響。而且因?yàn)镈NA溯源技術(shù)容易分型、重復(fù)性好、檢測(cè)手段簡(jiǎn)單快捷、成本低廉等成為目前國際上被公認(rèn)為最具發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用價(jià)值的快速溯源技術(shù)。DNA溯源技術(shù)的產(chǎn)生源于DNA的遺傳與變異，用于構(gòu)建個(gè)體DNA指紋圖譜的分子標(biāo)記有AFLP標(biāo)記(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)、SSR標(biāo)記(微衛(wèi)星標(biāo)記)和SNP標(biāo)記(單核苷酸多態(tài)性)。AFLP具有的高度可靠性和操作簡(jiǎn)便性，但是AFLP存在著對(duì)模板反應(yīng)表現(xiàn)遲鈍、譜帶可能發(fā)生錯(cuò)配與缺失、成本相對(duì)比較高等缺點(diǎn)。相比SNP標(biāo)記，微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因眾多，多態(tài)豐富，但也正因如此，使得SSR標(biāo)記的帶型復(fù)雜，給DNA指紋識(shí)別自動(dòng)化和規(guī)?；瘞砝щy。SNP標(biāo)記是第三代分子遺傳標(biāo)記，是指基因組同一位點(diǎn)上單個(gè)核苷酸的變異，一股表現(xiàn)為二等位基因，非常適宜高通量自動(dòng)化分析，所以日益成為動(dòng)物身份識(shí)別最受關(guān)注的分子標(biāo)記。但是用于肉產(chǎn)品溯源的SNP標(biāo)記不同于一股的SNP標(biāo)記，對(duì)于單個(gè)的SNP標(biāo)記，它必須至少具有以下特征(1)變異度高，在品種或品系中等位基因頻率接近；(2)品種間等位基因分布頻率差異?。?3)雜合度大于等于0. 3。在長(zhǎng)期的育種工作中，研究者積累了大量的SNP標(biāo)記，但是這些SNP標(biāo)記往往集中分布在某些染色體上，如1號(hào)染色體，12號(hào)染色體等，而另外部分染色體，如5號(hào)，8號(hào)，14、 15號(hào)染色體等則缺乏SNP標(biāo)記，因此為了滿足對(duì)豬肉產(chǎn)品進(jìn)行DNA溯源的要求，我們進(jìn)行新 SNP標(biāo)記的研究工作。豬的GIGYF2基因位于豬的15號(hào)染色體，人類的GIGYF2基因位于第二號(hào)染色體上，由31個(gè)外顯子和30個(gè)內(nèi)含子組成，包含4個(gè)剪切體。研究表明GIGYF2蛋白參與酪氨酸受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種豬GIGYF2基因中一個(gè)可用于溯源的SNP 標(biāo)記及其檢測(cè)方法。本發(fā)明的SNP標(biāo)記在商品豬培育中，可以廣泛用于豬肉產(chǎn)品DNA溯源及其檢測(cè)，特別是用于豬肉產(chǎn)品的安全性溯源。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案所述的SNP標(biāo)記，位于豬GIGYF2基因一段基因組DNA片段中，是通過DNA池(pool) 測(cè)序獲得，并在包括10個(gè)豬品種或品系的試驗(yàn)群體(共計(jì)213個(gè)個(gè)體)中，分析該SNP標(biāo)記SNP標(biāo)記在試驗(yàn)群體中等位基因的分布情況，發(fā)現(xiàn)該分子標(biāo)記在不同的品種和品系中的等位基因頻率接近，多態(tài)性豐富，品種或品系間等位基因頻率分布差異小，初步判定該SNP 標(biāo)記可用作豬肉產(chǎn)品DNA溯源。所述的豬GIGYF2基因一段基因組DNA片段，如SEQ ID NO 1所示，共452bp，包含部分23內(nèi)含子，且其第187位堿基處有一個(gè)堿基突變187A — 187C。在該DNA片段中，其A 等位基因只有452bp —個(gè)位點(diǎn)，C等位基因有187bp和265bp兩個(gè)位點(diǎn)，這兩個(gè)等位基因可組成三種基因型AA，AC，CC。所述的SNP標(biāo)記的檢測(cè)方法，采用PCR-RFLP方法進(jìn)行，具體包括以下步驟(1)構(gòu)建豬的 DNA 池(pool)；(2)設(shè)計(jì)正、反向引物分離GIGYF2基因的DNA片段，測(cè)序并分析；(3)突變位點(diǎn)檢測(cè)方法的建立；(4)采集10個(gè)品種和品系的耳組織樣，共計(jì)213個(gè)個(gè)體；(5)檢測(cè)SNP標(biāo)記在試驗(yàn)群體的分布，統(tǒng)計(jì)分析判斷是否適用于豬肉產(chǎn)品的DNA溯源。其中，上述檢測(cè)方法中，分離GIGYF2基因的DNA片段的正、反向引物序列分別如 SEQ ID No 2 和 SEQ ID No 3 所示。本發(fā)明采用DNA池檢測(cè)到豬GIGYF2基因中存在的SNP標(biāo)記，在包括10個(gè)豬品種或品系的試驗(yàn)群體中，分析該SNP標(biāo)記在試驗(yàn)群體中等位基因的分布情況，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記在不同的品種或品系中的等位基因頻率接近，多態(tài)性豐富，品種或品系間等位基因頻率分布差異小，并且雜合度都大于0. 3，初步判定該SNP標(biāo)記可用作豬肉產(chǎn)品DNA溯源以及豬肉產(chǎn)品的安全性溯源中。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例1SNP標(biāo)記的查找(I)DNA 池(pool)的構(gòu)建分別隨機(jī)采集杜洛克豬、申農(nóng)豬個(gè)體各2頭(不分性別)的耳組織，提取DNA后， 等量吸取4個(gè)個(gè)體的DNA放入同一離心管中，混勻待用。(2)引物設(shè)計(jì)
以豬GIGYF2基因的cDNA序列(Genbank =NW 001885690)為模板,設(shè)計(jì)引物分離豬 GIGYF2基因(以一頭申農(nóng)豬的DNA為PCR擴(kuò)增的模板)，引物如下正向引物5'-TTTCTCCCTAAGTCGTCG-3‘(參見序列 SEQ ID No 2)反向引物5'-CGTGCTGCTAAGTTTCTA-3‘(參見序列 SEQ ID No 3)PCR反應(yīng)總體積為20 μ 1，其中豬GIGYF2基因組DNA約lOOng，含 1 Xbuffer (Promega公司)，1. 5mmol/L MgCl 2, dNTP (上海生工生物公司)終濃度為 150μmol/L，引物終濃度為0.2μmol/L，2U Taq DNA 聚合酶(Promega 公司)。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 4min，然后循環(huán) 30 次 94°C 30s，56°C退火 30s，72°C 30s，最后 72°C延伸 IOmin0PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。(3)測(cè)序分析將得到的豬GIGYF2基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5ml Ependorff管中，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(天根生化科技有限公司)純化，送到上海生工生物有限公司測(cè)序。經(jīng)測(cè)試，該經(jīng)拼接后的豬GIGYF2基因的DNA片段為452bp，其序列如SEQ ID No 1 所示。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該DNA片段的第187堿基處存在一個(gè)堿基突變(187A-187C)，通過分子生物學(xué)軟件分析，發(fā)現(xiàn)該第187堿基處的堿基突變導(dǎo)致Eco31I-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)多態(tài)性。(4) RFLP檢測(cè)方法的建立酶切反應(yīng)總體積10 μ 1，其中IXbuffer 10 μ 1，PCR產(chǎn)物3 5 μ 1，限制性內(nèi)切酶Eco31I為0. 5 μ 1(5扔，用H2O補(bǔ)足10 μ 1，37°C水浴6h，稱取0. 6g瓊脂糖溶于15. 75ml DEPC(上海生工生物公司)處理水中，稍冷卻(60°C )，加入5ml的5X甲醛凝膠電泳緩沖液和4. 25ml的37%甲醛溶液，混勻制膠，電泳后檢測(cè)酶切結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該DNA片段中，A 等位基因只有452bp —個(gè)位點(diǎn)，C等位基因有187bp和265bp兩個(gè)位點(diǎn)，這兩個(gè)等位基因可組成三種基因型AA，AC, CC。本發(fā)明的SNP標(biāo)記具體是位于序列SEQ ID NO 1中的第187位堿基，其發(fā)生A — C 的替代，可以用PCR-Eco3II-RFLP方法進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)施例2等位基因的分布情況(1)試驗(yàn)群體的設(shè)計(jì)試驗(yàn)組采集皮特蘭(24頭)、申農(nóng)(32頭)、大申(31頭)、皮申(10頭)、長(zhǎng)申(26 頭)、皮大申(19頭)、長(zhǎng)大申(25頭)、杜大申(7頭)、杜皮申(8頭)和杜皮大申(31頭) 個(gè)體的耳組織，提取DNA，共計(jì)213個(gè)DNA樣本。試驗(yàn)群體的目的在于檢測(cè)SNP標(biāo)記在不同品種中的分布情況。(2)基因型檢測(cè)利用正向引物5'-TTTCTCCCTAAGTCGTCG-3‘(參見序列 SEQ ID No 2)反向引物5'-CGTGCTGCTAAGTTTCTA-3‘(參見序列 SEQ ID No 3)進(jìn)行擴(kuò)增，用相同的RFLP方法檢測(cè)試驗(yàn)群體所有的個(gè)體基因型。(3)統(tǒng)計(jì)分析
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記錄所有個(gè)體的基因型，并計(jì)算等位基因頻率和雜合度，結(jié)果如下表1所示。表 1
品種個(gè)體基因型基因頻率雜合度 HAAACCCAC皮特蘭2420400.91670.08330.1528申農(nóng)3292120.60940.39060.4761大申31111820.64520.35480.4579皮申104240.50000.50000.5000長(zhǎng)申26161000.80770.19230.3107皮大申1971110.65790.34210.4501長(zhǎng)大申2591600.68000.32000.4352杜大申75200.85710.14290.2449杜皮申86200.87500.12500.2188杜皮人申31151600.74190.25810.3829分析該SNP標(biāo)記位點(diǎn)等位基因的分布情況，發(fā)現(xiàn)該分子標(biāo)記除了在培育品種皮申中A等位基因頻率和C等位基因頻率相同外，在其它品種中都是A等位基因頻率占明顯優(yōu)勢(shì)外，尤其是在皮特蘭品種中；在皮特蘭品種、杜大申和杜皮申品系中雜合度低于0.3，皮特蘭是外來品種，可能存在遺傳差異，而杜大申和杜皮申品系可能是因?yàn)闃颖竞窟^小造成雜合度低；除此之外，其余品種或者品系的雜合度H均大于0. 3，因此我們初步認(rèn)為該SNP 標(biāo)記可以用于豬肉產(chǎn)品的DNA溯源。最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
權(quán)利要求
1.豬GIGYF2基因的一段基因組DNA片段，其序列如SEQID NO 1所示，共45^p，包含部分第M內(nèi)含子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬GIGYF2基因的一段基因組DNA片段，其特征在于，所述的 DNA片段第187位堿基處有一個(gè)堿基突變187A — 187C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬GIGYF2基因的一段基因組DNA片段，其特征在于，所述的 DNA片段的452bp處有一 A等位基因，其187bp和處各有一 C等位基因。
4.一種SNP標(biāo)記，其特征在于，位于權(quán)利要求1或2或3所述的豬GIGYF2基因的一段基因組DNA片段中。
5.權(quán)利要求4所述的SNP標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于，采用PCR-Eco3II-RFLP方法進(jìn)行，具體包括以下步驟(1)構(gòu)建豬的DNA池；(2)設(shè)計(jì)正、反引物分離豬GIGYF2基因的DNA片段，測(cè)序并分析；(3)突變位點(diǎn)檢測(cè)方法的建立；(4)采集豬的10個(gè)品種或品系的耳組織樣，共計(jì)213個(gè)個(gè)體；(5)檢測(cè)SNP標(biāo)記在試驗(yàn)群體的分布，分析判斷該標(biāo)記是否適用于豬肉產(chǎn)品的DNA溯源。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的SNP標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于，分離豬GIGYF2基因的DNA 片段的正、反向引物的序列分別如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。
7.權(quán)利要求4所述的SNP標(biāo)記在豬肉產(chǎn)品DNA溯源中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬GIGYF2基因中一個(gè)可用于溯源的SNP標(biāo)記及其檢測(cè)方法。所述的SNP標(biāo)記位于豬GIGYF2基因中一段基因組DNA片段中，是通過DNA池(pool)測(cè)序獲得。所述的豬GIGYF2基因中一段基因組DNA片段，如SEQ ID NO 1所示，共452bp，包含部分23內(nèi)含子，且其第187位堿基處有一個(gè)堿基突變187A→187C。在包括10個(gè)豬品種或品系的試驗(yàn)群體中，分析本發(fā)明的SNP標(biāo)記在試驗(yàn)群體中等位基因的分布情況，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記在不同的品種或品系中的等位基因頻率接近，多態(tài)性豐富，品種或品系間等位基因頻率分布差異小，并且雜合度都大于0.3，初步判定本發(fā)明的SNP標(biāo)記可用作豬肉產(chǎn)品DNA溯源。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102485892SQ20101057325
公開日2012年6月6日 申請(qǐng)日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者吳瀟, 唐雪明, 張小波, 朱宏, 王金斌, 譚芙蓉, 趙凱, 陳凱, 魏曼曼 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院