国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      一種治療皮膚過敏和過敏性哮喘的注射劑及其制備方法

      文檔序號:587704閱讀:449來源:國知局
      專利名稱:一種治療皮膚過敏和過敏性哮喘的注射劑及其制備方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種治療皮膚過敏和過敏性哮喘的注射劑及其制備方法。
      背景技術(shù)
      長期以來治療皮膚過敏與過敏性哮喘就是醫(yī)學(xué)界的一個難題,目前多采用激素抗 過敏與消炎治療,但療效較差,癥狀輕者可起到一定的治療作用,但對于反復(fù)發(fā)作者只能對 病治療,且效果很差。皮膚過敏與過敏性哮喘均屬于自身免疫性疾病,其發(fā)病機(jī)理在于皮膚 過敏與過敏性哮喘是由多種細(xì)胞特別是肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞參與的慢性 氣道與皮膚炎癥,免疫病理學(xué)已經(jīng)證實(shí)在皮膚與呼吸道的慢性過敏性炎癥是相似的,均有 Th2細(xì)胞、肥大/嗜堿細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞以及IgE的參與,參與的細(xì)胞因子如IL-4等炎性 化學(xué)介質(zhì)。在敏感個體,與IgE結(jié)合的組織肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞,在接觸變應(yīng)原后,遂 被激活,釋放組織胺、白三烯和其他介質(zhì)。這種反應(yīng)輕者可引起皮膚過敏,重者可引起速發(fā) 性的鼻部刺激癥狀,如由神經(jīng)介導(dǎo)的打噴嚏和流鼻涕,由血管充血引起的鼻塞等。在下呼吸 道的速發(fā)癥狀是支氣管痙攣和黏液的高分泌,引起咳嗽,呼吸困難,胸悶和喘息。

      發(fā)明內(nèi)容
      為了克服上述治療皮膚過敏與過敏性哮喘的藥物的不足,本發(fā)明的目的在于提供 一種見效快、療效持久的治療皮膚過敏與過敏性哮喘的注射劑。本發(fā)明的另一個目的是提供這種注射劑的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種治療皮膚缺損的注射劑,該填充劑主要由細(xì)胞成分組成,每毫升注射用填充 劑中細(xì)胞成分的含量為1000萬個至5000萬個;所述細(xì)胞成分是用流產(chǎn)胎兒皮膚或新生兒 切除的包皮或動物胚胎的真皮經(jīng)過體外低血清或無血清培養(yǎng)和擴(kuò)增,收集得到的真皮成纖 維前體細(xì)胞與成纖維細(xì)胞。優(yōu)選地,在本發(fā)明所述注射劑中,所述的經(jīng)培養(yǎng)和擴(kuò)增后收集到的成纖維前體細(xì) 胞與成纖維細(xì)胞的數(shù)量之比為50-70 30-50。本發(fā)明所述的注射劑除了細(xì)胞成分,還可以含有一些輔助成分,所述輔助成分可 以是本領(lǐng)域常見的能夠做為細(xì)胞溶劑的成分,如維生素、葡萄糖、等滲生理鹽水等等。本發(fā)明使用的低血清培養(yǎng)基僅需添加3% 5%胎牛血清,而傳統(tǒng)培養(yǎng)基通常加 入約10%的新生牛血清,低血清培養(yǎng)基對于細(xì)胞生長、增殖、形態(tài)、活性和功能沒有不良影 響,甚至有所改善。此外,本發(fā)明還提供了一種所述治療皮膚過敏與過敏性哮喘的注射劑的制備方 法,該方法步驟為采用流產(chǎn)胎兒皮膚或新生兒切除的包皮或動物胚胎的真皮標(biāo)本進(jìn)行分 離、體外低血清或無血清培養(yǎng)和擴(kuò)增,對所得到的成纖維前體細(xì)胞與成纖維細(xì)胞進(jìn)行收集。本發(fā)明所采集的皮膚組織是流產(chǎn)胎兒皮膚或新生兒切除的包皮或動物胚胎的皮 膚。
      在本發(fā)明所提供的填充劑制備方法中,將來源于流產(chǎn)胎兒皮膚或新生兒切除的包 皮皮膚或動物胚胎皮膚,例如,1平方毫米至30平方毫米的皮膚,在加入了生長因子和活 性材料的低血清或無血清培養(yǎng)液中進(jìn)行體外培養(yǎng)和擴(kuò)增,得到成纖維前體細(xì)胞與成纖維細(xì) 胞。所述體外低血清或無血清培養(yǎng)和擴(kuò)增中,所述培養(yǎng)液的組成可以是本領(lǐng)域常用的 基礎(chǔ)培養(yǎng)液,例如,可以參見《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》中的有關(guān)介紹(2001年,科學(xué)出版社出版,主 編D. L.斯佩克特,黃培唐翻譯)。優(yōu)選地,在體外全程無血清培養(yǎng)和擴(kuò)增過程中,使用的培 養(yǎng)液中還包括生長因子和活性材料。所述生長因子為選自上皮生長因子、成纖維生長因子 中的一種或多種;所述活性材料選自氫化可的松、肝素中的一種或多種。所述上皮生長因 子在培養(yǎng)液中的含量可以為1納克/毫升至5納克/毫升,優(yōu)選為3納克/毫升;所述成纖 維生長因子在培養(yǎng)液中的含量可以為2納克/毫升至20納克/毫升,優(yōu)選為10納克/毫 升;所述氫化可的松在培養(yǎng)液中的含量可以為0. 2微克/毫升至2微克/毫升,優(yōu)選為1微 克/毫升;所述肝素在培養(yǎng)液中的含量可以為2微克/毫升至20微克/毫升,優(yōu)選為10微 克/毫升。上述的培養(yǎng)液和生長因子及活性材料可以是選自一個公司或者多個公司(如美 國的Cascade公司、Sigma公司、Hyclne公司等)的市售產(chǎn)品。在本發(fā)明所提供的注射劑制備方法中,所述體外培養(yǎng)和擴(kuò)增可采用本領(lǐng)域常見的 任何用于為獲得自體細(xì)胞的體外培養(yǎng)和擴(kuò)增方法,如組織消化培養(yǎng)法、組織塊培養(yǎng)法等,優(yōu) 選采用組織塊培養(yǎng)法。下面進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明所提供的注射劑制備方法,但本發(fā)明并不因此而受到 任何限制。1、皮膚取材用酒精消毒流產(chǎn)胎兒皮膚或新生兒切除的包皮或動物胚胎皮膚,用手術(shù)剪刀將表 皮和真皮組織取下,放入組織保存液中。2、皮膚組織培養(yǎng)前處理將皮膚組織塊放置于培養(yǎng)皿中清洗上皮部位,然后去除皮下組織和脂肪,將皮膚 組織剪碎為0. 1平方毫米至0. 5平方毫米的皮膚碎片,最后將皮膚碎片平鋪于培養(yǎng)皿的底 面。也可首先將皮膚組織塊用胰酶液消化一段時間,再將消化后的組織塊剪碎平鋪于培養(yǎng) 皿的底面。3、細(xì)胞體外培養(yǎng)包括原代細(xì)胞培養(yǎng)和傳代細(xì)胞培養(yǎng)兩個步驟。原代培養(yǎng)在已平鋪皮膚碎片的培養(yǎng)皿中加入DMEM和低血清培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),使 細(xì)胞擴(kuò)增到50% -90%的培養(yǎng)皿底面即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)在原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上加入生長因子(如上皮生長因子、成纖維生長因 子等)和活性材料(如氫化可的松、肝素等),培養(yǎng)2-8周,大約培養(yǎng)擴(kuò)增至1500萬-2億個 細(xì)胞。上皮生長因子在培養(yǎng)液中的含量可以為1納克/毫升至5納克/毫升,優(yōu)選為3納 克/毫升;所述成纖維生長因子在培養(yǎng)液中的含量可以為2納克/毫升至20納克/毫升, 優(yōu)選為10納克/毫升;所述氫化可的松在培養(yǎng)液中的含量可以為0. 2微克/毫升至2微克 /毫升,優(yōu)選為1微克/毫升;所述肝素在培養(yǎng)液中的含量可以為2微克/毫升至20微克/毫升,優(yōu)選為10微克/毫升。采用本領(lǐng)域常用的細(xì)胞培養(yǎng)條件即可,如可將從組織塊培養(yǎng)出的真皮細(xì)胞(含成 纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)用上述的低血清或無血清培養(yǎng)液在溫度為 37°C,5%的(X)2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3-4天換上述培養(yǎng)液一次,直至得到所需的細(xì)胞成分 的含量。4、注射劑配制將培養(yǎng)數(shù)量達(dá)到要求的細(xì)胞首先使用胰蛋白酶進(jìn)行消化處理,使其脫離培養(yǎng)皿底 面,在使用無外源性蛋白的DMEM清洗數(shù)次,去除外源性生長因子和活性物質(zhì)。再將收集到 的細(xì)胞與少量膠原蛋白直接加入到5%的含氨基酸、生理鹽水及維生素的葡萄糖注射液中, 混勻,配成注射填充劑,每150毫升注射劑中細(xì)胞成分的總個數(shù)為1000萬個至5000萬個。治療步驟將注射劑進(jìn)行靜脈滴注,一小時內(nèi)輸完。與現(xiàn)有治療手段相比,本發(fā)明的注射劑具有治療簡便、無毒副作用、見效快,療效 持久等特點(diǎn)。


      圖1是培養(yǎng)成功的細(xì)胞在100倍光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)照片;圖2是本發(fā)明的一個具體實(shí)施例的治療皮膚過敏與過敏性哮喘的注射劑在小試 管中的照片。
      具體實(shí)施例方式下面進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明所提供的治療皮膚過敏與過敏性哮喘疾病的注射劑 及其制備方法,但本發(fā)明并不因此而受到任何限制。實(shí)施例一種治療皮膚過敏和過敏性哮喘的注射劑的制備一.皮膚樣品的提取用70%的酒精消毒流產(chǎn)胎兒皮膚或新生兒切除的包皮或動物胚胎皮膚標(biāo)本,放入 組織保存液(DMEM細(xì)胞保存液,購自美國Hyclone公司)中,送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離、培養(yǎng)。二 .細(xì)胞懸液的制備1.皮膚組織培養(yǎng)前處理將皮膚組織塊放置于培養(yǎng)皿中清洗上皮部位,然后去除 皮下組織和脂肪,將皮膚組織剪碎為0. 1平方毫米至0. 5平方毫米的皮膚碎片,最后將皮膚 碎片平鋪于培養(yǎng)皿的底面。2.原代細(xì)胞培養(yǎng)在已平鋪皮膚碎片的培養(yǎng)皿中加入DMEM和3%的胎牛血清,放 入R)rmaC023131型培養(yǎng)箱中,在37°C,5 % CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng),每隔2天至3天換上述 培養(yǎng)液一次,當(dāng)原代細(xì)胞達(dá)到80%匯集后傳代。3.傳代細(xì)胞培養(yǎng)在原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上加入上皮生長因子為3納克/毫升、成纖 維生長因子10納克/毫升、氫化可的松1微克/毫升、肝素10微克/毫升,每3-4天換上 述培養(yǎng)液一次,培養(yǎng)4周,大約培養(yǎng)擴(kuò)增至1500萬個細(xì)胞。4.配制注射劑將培養(yǎng)數(shù)量達(dá)到要求的細(xì)胞首先使用胰蛋白酶進(jìn)行消化處理,使 其脫離培養(yǎng)皿底面,再使用無外源性蛋白的DMEM清洗3次。將收集到的細(xì)胞與少量膠原蛋 白加入到5%的含氨基酸的葡萄糖注射液中,混勻,配成注射填充劑,每毫升注射用填充劑
      5中細(xì)胞成分的總個數(shù)為1000萬至5000萬個。5.病毒檢測皮膚組織和培養(yǎng)4周后的細(xì)胞進(jìn)行HIV和肝炎病毒的檢驗(yàn),確定此 為無病毒細(xì)胞。6.免疫反應(yīng)測試第4周將0. Iml細(xì)胞注射液對受術(shù)者進(jìn)行皮試(同青霉素皮試 方法),無免疫反應(yīng)。7.成品檢測1)外觀注射液為無色混懸液。2)本品中細(xì)胞分類檢定成纖維前體細(xì)胞采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法觀察(在100倍光學(xué)顯微鏡下做形態(tài)學(xué)觀 察,其標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)為細(xì)小長索狀),產(chǎn)品中有70%的成纖維前體細(xì)胞。成纖維細(xì)胞采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法觀察(在100倍光學(xué)顯微鏡下做形態(tài)學(xué)觀察,其 標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)為呈多觸突的長索形細(xì)胞),產(chǎn)品中有30%的成纖維細(xì)胞。3)無菌試驗(yàn)按《中國生物制品規(guī)程》(2000版)通則《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》 A/B項(xiàng)進(jìn)行,結(jié)果符合無菌要求。三.治療用于皮膚過敏和過敏性哮喘病例各5例。1.治療前檢查,各項(xiàng)指標(biāo)均正常,包括血尿便常規(guī)、心電圖、肝腎功能、HIV、 HbsAg02.將注射部位用常規(guī)消毒消毒。3.進(jìn)行靜脈點(diǎn)滴輸液。四、禁忌孕婦慎用。五、效果描述輸液后三天癥狀減輕,一周后明顯減輕,兩周后癥狀基本消失。
      權(quán)利要求
      1.一種治療皮膚過敏和過敏性哮喘的注射劑,該注射劑主要由細(xì)胞成分組成,每毫升 注射劑中細(xì)胞成分的含量為1000萬個至5000萬個;所述細(xì)胞成分是用流產(chǎn)胎兒皮膚或新 生兒切除的包皮的皮膚經(jīng)體外低血清或無血清培養(yǎng)和擴(kuò)增后收集到的成纖維前體細(xì)胞與 成纖維細(xì)胞。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射劑,其特征在于所述的經(jīng)培養(yǎng)和擴(kuò)增后收集到的成纖 維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的數(shù)量之比為50-70 30-50。
      3.一種制備權(quán)利要求1至2中任意一項(xiàng)所述的治療皮膚缺損的注射劑的方法,包括以 下步驟(1)采用人流產(chǎn)胚胎或新生兒包皮或動物胚胎真皮進(jìn)行體外低血清或無血清培養(yǎng)和擴(kuò) 增,收集所得到的成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞;(2)將收集到的細(xì)胞成分構(gòu)成的治療皮膚過敏或過敏性哮喘的注射劑;每毫升該填充 劑中細(xì)胞成分的含量為1000萬個至5000萬個。
      4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于所述低血清或無血清體外培養(yǎng)和擴(kuò) 增采用組織塊培養(yǎng)法。
      5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法,其特征在于所述體外低血清或無血清培養(yǎng)和擴(kuò) 增中加入了生長因子和活性材料;所述生長因子選自上皮生長因子、成纖維生長因子中的 一種或多種,所述活性材料選自氫化可的松、肝素中的一種或多種。
      6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法,其特征在于所述上皮生長因子在培養(yǎng)液中的含 量為1納克/毫升至5納克/毫升;所述成纖維生長因子在培養(yǎng)液中的含量為2納克/毫 升至20納克/毫升;所述氫化可的松在培養(yǎng)液中的含量為0. 2微克/毫升至2微克/毫 升;所述肝素在培養(yǎng)液中的含量為2微克/毫升至20微克/毫升。
      7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法,其特征在于所述上皮生長因子在培養(yǎng)液中為3 納克/毫升;所述成纖維生長因子在培養(yǎng)液中的含量為10納克/毫升;所述氫化可的松在 培養(yǎng)液中的含量為1微克/毫升;所述肝素在培養(yǎng)液中的含量為10微克/毫升。
      8.用培養(yǎng)的細(xì)胞制備成注射液。注射過程為將培養(yǎng)好的細(xì)胞制備成150ml的注射液, 經(jīng)靜脈滴注。
      全文摘要
      一種治療皮膚過敏和過敏性哮喘的注射劑,以細(xì)胞為主要成分,每毫升注射劑中細(xì)胞成分的含量為1000萬個至5000萬個;所述細(xì)胞成分是用人流產(chǎn)胚胎或新生兒包皮或動物胚胎的皮膚經(jīng)過體外低血清或無血清培養(yǎng)和擴(kuò)增,收集得到的成纖維前體細(xì)胞與成纖維細(xì)胞。本發(fā)明還提供了所述治療皮膚過敏和過敏性哮喘的注射劑的制備方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是注射后可在一周內(nèi)出現(xiàn)明顯的臨床療效,且作用持久,治療程序簡便。
      文檔編號C12N5/071GK102085218SQ20101057427
      公開日2011年6月8日 申請日期2010年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月6日
      發(fā)明者張旭, 張 誠, 韓斌 申請人:北京賽爾泰和生物醫(yī)藥科技有限公司
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點(diǎn)贊!
      1