專利名稱：轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片、試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片、試劑盒及 應(yīng)用。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因生物是指利用生物技術(shù)，將外源基因轉(zhuǎn)移到其它物種中以改造其遺傳特 性，從而獲得具有人類所需性狀、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的生物新品種。轉(zhuǎn)基因棉花的發(fā)展?fàn)顩r棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，全世界有18億人口以種植棉花為生。從1987年第 一例轉(zhuǎn)基因棉花在美國(guó)誕生至今，棉花基因工程的研究工作迅速在全世界展開(kāi)。目前我國(guó) 通過(guò)國(guó)家和省級(jí)審定的轉(zhuǎn)基因棉花品種50多個(gè)，累計(jì)推廣600多萬(wàn)公頃。至今已培育出抗 蟲(chóng)、抗病、抗除草劑、抗逆及品質(zhì)改良等特質(zhì)的轉(zhuǎn)基因棉花品系，為改良棉花品種、提高產(chǎn)量 以及解決環(huán)境問(wèn)題提供了行之有效的方法。轉(zhuǎn)基因棉花的國(guó)內(nèi)外監(jiān)管隨著轉(zhuǎn)基因作物的廣泛種植，作為一種新興的生物技術(shù)，其對(duì)人體健康、生態(tài)平衡 是否具有危害還未確定。它潛在的安全性如轉(zhuǎn)基因食品的過(guò)敏性、生態(tài)危害等越來(lái)越受到 消費(fèi)者的關(guān)注。世界上主要國(guó)家都已立法對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行管理，美國(guó)、歐盟、日本、韓國(guó)、澳大利 亞、新加坡的法律明確規(guī)定，轉(zhuǎn)基因品種需經(jīng)政府批準(zhǔn)，并經(jīng)嚴(yán)格的生物安全、環(huán)境安全測(cè) 試才可以田間種植、環(huán)境釋放及作為食品、飼料，歐盟、日本、韓國(guó)、澳大利亞、新加坡等要求 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識(shí)，并規(guī)定了相應(yīng)閾值水平。我國(guó)于2001年5月23日頒布《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因 生物安全管理?xiàng)l例》，規(guī)定對(duì)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物實(shí)行檢驗(yàn)檢疫。2002年3月20日，棉花等5類 17種產(chǎn)品，成為我國(guó)第一批正式實(shí)施轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)制度的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物。由于轉(zhuǎn)基因棉花 產(chǎn)品的國(guó)內(nèi)外貿(mào)易迅速發(fā)展，因此轉(zhuǎn)基因棉花的檢測(cè)顯得尤為重要。轉(zhuǎn)基因棉花的檢測(cè)方法轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)可分為兩類方法，一類是核酸檢測(cè)，當(dāng)外源基因插入到受體細(xì) 胞染色體時(shí)，一般要構(gòu)建啟動(dòng)子、終止子、選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因，如花椰菜花葉病毒 (CaMV) 35S啟動(dòng)子，胭脂堿合酶NOS終止子等，轉(zhuǎn)基因食品核酸檢測(cè)的靶標(biāo)是插入的外源基 因，包括外源基因的整合位點(diǎn)、啟動(dòng)子、終止子、選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因的核酸序列。另一 類是蛋白檢測(cè)，即通過(guò)插入外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物或其功能進(jìn)行檢測(cè)，已有多種轉(zhuǎn)基 因棉花蛋白檢測(cè)方法在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)領(lǐng)域中投入了使用。核酸檢測(cè)主要應(yīng)用PCR方法和基因芯片技術(shù)。PCR方法具有很高的靈敏度，在 轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域使用最為廣泛。與蛋白質(zhì)具有組織特異性相比，PCR技術(shù)不受到材料的限制。 另外，核酸比蛋白質(zhì)穩(wěn)定，變性之后容易復(fù)性，在加工食品中仍可檢出。基因芯片(DNA Microarray)，又稱為DNA微探針陣列。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的大量應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因的品種越來(lái)越 多，所轉(zhuǎn)的外源基因種類越來(lái)越龐雜，普通PCR技術(shù)一次只能檢測(cè)一種轉(zhuǎn)基因成分，利用普通PCR技術(shù)往往不能獲得轉(zhuǎn)基因植物的完整信息，特別當(dāng)大量的不同品系轉(zhuǎn)基因存在于同 一待測(cè)樣品中時(shí)。相比之下，DNA芯片檢測(cè)一次可以定性篩選大量不同種類的報(bào)告基因、啟 動(dòng)子、終止子、外源基因，如將通用的報(bào)告基因、抗性基因、啟動(dòng)子和終止子等常用轉(zhuǎn)基因元 件制成檢測(cè)芯片與待測(cè)樣品雜交，即可鑒別出樣品中所含的各種轉(zhuǎn)基因成分?；蛐酒?有高通量、集成化的特點(diǎn)，在轉(zhuǎn)基因棉花監(jiān)管、國(guó)內(nèi)外轉(zhuǎn)基因棉花檢驗(yàn)中，將會(huì)有越來(lái)越廣 泛的應(yīng)用。目前，國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)報(bào)道利用芯片技術(shù)快速、高通量地檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花的方法。因此，本領(lǐng)域需要一種快速、高通量、特異性好、靈敏度高的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)方法， 進(jìn)行轉(zhuǎn)基因棉花的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供高通量、操作簡(jiǎn)單、特異且靈敏地檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花的
-H-· I I心片。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供包括本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片的試劑盒。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于，提供一種可視性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花的方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于，提供本發(fā)明的芯片和試劑盒在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花中的應(yīng)用。針對(duì)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案本發(fā)明根據(jù)從有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)收集的序列資料設(shè)計(jì)了針對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花品系 3006-210-23、轉(zhuǎn)基因棉花品系觀1-對(duì)_236、轉(zhuǎn)基因棉花品系LLC0TTN 25、轉(zhuǎn)基因棉花品系 Mon531、轉(zhuǎn)基因棉花品系Monl5985、轉(zhuǎn)基因棉花品系Monl445、轉(zhuǎn)基因棉花品系GHB614和轉(zhuǎn) 基因棉花品系GKU8個(gè)品系的外源基因設(shè)計(jì)了特異性寡核苷酸引物對(duì)和探針。通過(guò)大量的 篩選工作建立了穩(wěn)定的PCR體系。將核酸探針點(diǎn)布在基片上，制備成用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢 測(cè)的芯片。芯片與PCR擴(kuò)增的待測(cè)樣品雜交，根據(jù)雜交信號(hào)直觀的確定待測(cè)樣品中是否含 有外源目標(biāo)基因。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花的芯片，所述芯片 包括基片和位于基片上的核酸探針，所述核酸探針包括選自核苷酸序列為SEQ ID NO. 3、 SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 20 和SEQ ID NO. 23的核酸探針中的一種或多種核酸探針，其中在所述探針的5’端從5’到3’ 方向依次連接有醛基基團(tuán)(ALD) 10-20個(gè)脫氧腺嘌呤核苷酸殘基，并通過(guò)氨醛縮合反應(yīng)固 定在基片上。在本發(fā)明的芯片中，所述核酸探針是針對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花中外源基因插入位點(diǎn)處 的旁側(cè)序列設(shè)計(jì)的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的芯片包括基片和位于基片上的核 苷酸序列為SEQ ID NO. 3 (針對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花品系3006-210-23旁側(cè)序列)、SEQ ID Ν0· 5 (針 對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花品系觀1-對(duì)_236旁側(cè)序列)、SEQ ID NO. 8 (針對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花品系LLC0TTN 25旁側(cè)序列)、SEQ ID NO. 11(針對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花品系Mon531旁側(cè)序列)、SEQ ID NO. 14(針 對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花品系Monl5985旁側(cè)序列)、SEQ ID N0. 17 (針對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花品系Monl445旁 側(cè)序列)、SEQ ID N0. 20 (針對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花品系GHB614旁側(cè)序列)和SEQ ID N0. 23 (針對(duì) 轉(zhuǎn)基因棉花品系GK12)的全部核酸探針，其中在所述探針的5’到3’端依次連接有ALD和 10-20個(gè)脫氧腺嘌呤核苷酸殘基(a)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的芯片為可視芯片。在本發(fā)明的芯片中，所述基片為聚苯乙烯材料、玻璃片和經(jīng)特殊處理的硅片等。在優(yōu)選的實(shí)施方 案中，為了控制雜交反應(yīng)結(jié)果，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片設(shè)有嚴(yán)格的質(zhì)控，包括陽(yáng)性對(duì) 照和陰性對(duì)照。如果雜交后陰性對(duì)照點(diǎn)沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)，表明正常，如果有信號(hào)，表明雜交 失敗。為了監(jiān)控雜交反應(yīng)中假陰性的出現(xiàn)，設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照探針為與目標(biāo)檢測(cè)基因 無(wú)關(guān)的核苷酸片段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述陽(yáng)性對(duì)照探針為20個(gè)脫氧腺嘌呤核苷 酸殘基組成，例如SEQ ID No. 22。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，為監(jiān)控雜交結(jié)果的準(zhǔn)確性，每 個(gè)探針在芯片上至少重復(fù)2個(gè)點(diǎn)，例如至少重復(fù)3個(gè)點(diǎn)，至少重復(fù)4個(gè)點(diǎn)，至少重復(fù)5個(gè)點(diǎn)， 至少重復(fù)6個(gè)點(diǎn)或以上。在雜交后同一探針的所有點(diǎn)如果信號(hào)一致，表明正常，如果有的點(diǎn) 沒(méi)有信號(hào)，則重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。在本發(fā)明中，所述棉花包括棉花原材料及其加工產(chǎn)品。所述原料包括但不限于棉 花的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等，所述加工產(chǎn)品包括簡(jiǎn)單加工和深加工產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)試劑盒，所述試 劑盒包括本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片和用于PCR擴(kuò)增的與所述芯片上的探針相對(duì)應(yīng)的 特異性寡核苷酸引物對(duì)，所述引物對(duì)包括以下一對(duì)或多對(duì)引物用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系3006-210-23的SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn) 基因棉花品系281-24-236的SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 4 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系LLC0TTN 25 的 SEQID NO. 6 和 SEQ ID N0. 7 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系 Mon531 的 SEQID N0. 9 和 SEQ ID NO. 10 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系Monl5985的SEQ ID N0. 12禾口 SEQ ID N0. 13 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花 品系Monl445的SEQ ID N0. 15和SEQ ID N0. 16 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系GHB614的SEQ ID N0. 18 和 SEQ ID N0. 19 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系 GK12 的 SEQ ID N0. 21 和 SEQ ID N0. 22，所 述引物的5’端連接有共價(jià)結(jié)合的生物素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)試劑盒還包括用于可視性檢 測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素抗體和辣根過(guò)氧化物酶的底物。優(yōu)選地，在 本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)試劑盒中，所述辣根過(guò)氧化物酶的底物為四甲基聯(lián)苯胺。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括用于樣品DNA提取的試劑和用于PCR反 應(yīng)的試劑以及使用說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒中的使用說(shuō)明書(shū)包括對(duì) 轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)的PCR擴(kuò)增條件的描述。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花的方法，所述方法包 括(1)提取待測(cè)棉花的DNA，所述棉花包括棉花原料和/或棉花加工產(chǎn)品；(2)使用以下一對(duì)或多對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系3006-210-23的SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn) 基因棉花品系281-24-236的SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 4 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系LLC0TTN 25 的 SEQID N0. 6 和 SEQ ID N0. 7 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系 Mon531 的 SEQID N0. 9 和 SEQ ID NO. 10 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系Monl5985的SEQ ID N0. 12禾口 SEQ ID N0. 13 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花 品系Monl445的SEQ ID N0. 15和SEQ ID N0. 16 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系GHB614的SEQ ID N0. 18 和 SEQ ID N0. 19 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系 GK12 的 SEQ ID N0. 21 和 SEQ ID N0. 22，所 述引物的5’端連接有共價(jià)結(jié)合的生物素。(3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片雜交；
(4)將步驟(3)的芯片與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素抗體雜交，洗滌；和(5)在步驟(4)的芯片上加入辣根過(guò)氧化物酶的底物進(jìn)行反應(yīng)，水洗，干燥；(6)觀察顏色變化，確定所述待測(cè)棉花是否為轉(zhuǎn)基因棉花。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)方法中，使用實(shí)時(shí) 熒光PCR方法進(jìn)行樣品DNA的擴(kuò)增。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因棉花 檢測(cè)方法中，所述辣根過(guò)氧化物酶的底物為四甲基聯(lián)苯胺。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片或轉(zhuǎn)基 因棉花檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花中的應(yīng)用。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片或試劑盒可 以用于棉花或其加工產(chǎn)品是否含有外源目標(biāo)基因的檢測(cè)，以及用于轉(zhuǎn)基因品種的鑒定。在本發(fā)明中，使用生物素殘基標(biāo)記引物，將生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片雜交，洗 滌后加入親和素連接的熒光物，通過(guò)生物素與親和素的結(jié)合及靶序列與探針的結(jié)合產(chǎn)生熒 光信號(hào)，然后利用熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片中，所述基片由硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚苯乙烯 或載玻片構(gòu)成，或?yàn)榭缮藤?gòu)的空白可視芯片。本發(fā)明采用可視光學(xué)薄膜生物傳感器芯片用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花。該可視光學(xué)薄膜 生物傳感器芯片是經(jīng)過(guò)特殊處理的硅晶片，結(jié)構(gòu)可分為三層，由硅基質(zhì)組成的基底層；基底 層上面的由氮化硅構(gòu)成的可視層；以及在可視層上面的反應(yīng)層。可視光學(xué)薄膜生物傳感器 是一種基于光的折射原理，將芯片表面沉淀物的厚度變化轉(zhuǎn)化為折射波長(zhǎng)的變化，通過(guò)肉 眼可視的顏色變化，判斷芯片表面的雜交反應(yīng)結(jié)果的檢測(cè)方法。所用芯片必須是高度平整 光滑的表面，首先在芯片表面覆蓋一層帶氨基、羥基或羧基等活性官能團(tuán)的多聚物，然后將 寡核苷酸以相應(yīng)基團(tuán)標(biāo)記，并用芯片點(diǎn)樣儀有序噴點(diǎn)于芯片表面，通過(guò)核酸雜交反應(yīng)檢測(cè) 樣品中的靶基因分子。本發(fā)明的可視轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片通過(guò)在8種轉(zhuǎn)基因棉花的旁側(cè)序列(flanking sequence)設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物/探針，然后用生物素標(biāo)記的引物擴(kuò)增待測(cè)樣品中的目標(biāo)基 因，用標(biāo)記了生物素的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片上的探針雜交，用親和素過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物 (streptavidin-HRP)與生物素結(jié)合，用四甲基聯(lián)苯胺(TMB)與辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行沉淀反 應(yīng)，由于沉淀物改變了芯片表面的厚度，從而改變芯片表面的折射波長(zhǎng)，引起肉眼可視的顏 色變化，據(jù)此判斷芯片表面的雜交反應(yīng)結(jié)果。本發(fā)明的DNA芯片能夠高通量地檢測(cè)樣品中的大量的不同種類的外源基因，檢測(cè) 結(jié)果更靈敏、準(zhǔn)確。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片、試劑盒和方法中使用的探針和引用退火溫度盡量 保持一致，各引物間盡量減少互補(bǔ)序列。本發(fā)明通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)，篩選出的8對(duì)高特異性引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的效率較高，探針的同源性較低。使用本發(fā)明的芯片檢測(cè)方法，其簡(jiǎn)單、高通量、快速、特異且靈敏的特點(diǎn)適合用于 國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上轉(zhuǎn)基因棉花的檢測(cè)。


圖1是探針排列示意圖，其中C 陽(yáng)性對(duì)照(核苷酸序列 aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa (SEQ ID NO. 24)) ； 1 轉(zhuǎn)基因棉花品系 3006-210- (SEQ ID NO. 3)；2 轉(zhuǎn)基因棉花品系 l-24-236(SEQ ID NO. 5) ；3 :LLC0TTN 25 (SEQ ID NO. 8) ；4 轉(zhuǎn)基因棉 花品系Mon531(SEQ ID NO. 11) ；5 轉(zhuǎn)基因棉花品系Monl5985 (SEQ ID NO. 14) ；6 轉(zhuǎn)基因棉 花品系Monl445(SEQID NO. 17) ；7 轉(zhuǎn)基因棉花品系GHB614 (SEQ ID NO. 20) ；8 轉(zhuǎn)基因棉花 品系 GK12 (SEQ ID N0. 23) ；9 陰性對(duì)照 ddH20。圖2是8種轉(zhuǎn)基因棉花品系特異性雜交結(jié)果，依次為轉(zhuǎn)基因棉花品系 3006-210-23、281-24-236、LLC0TTN25、Mon531、Monl5985、Monl445、GHB614 以及 GK12。圖3是8種轉(zhuǎn)基因棉花品系引物特異性篩選及多重PCR中最佳引物濃度組合結(jié)果 圖，1 :3006-210-23 ；2 :281-24-236 ；3 =LLCotton ；4 :Mon531 ；5 :Monl5985 ；6 :Monl445 ；7 GH614 ；8 :GK12 ；9 八重 PCR ；10 陰性棉花；M =Marker0圖4是以轉(zhuǎn)基因棉花M1445為例，實(shí)驗(yàn)不同點(diǎn)樣濃度的探針雜交結(jié)果示意圖。圖 中探針濃度依次為1 μ mol/L、5 μ mol/L和10 μ mol/L。

圖5是轉(zhuǎn)基因棉花品系靈敏度驗(yàn)證結(jié)果，分別為轉(zhuǎn)基因棉花3006-210-23與 GHB614的靈敏度梯度結(jié)果，各圖中從左到右DNA含量依次為lng、0. lng、10pg。
具體實(shí)施例方式通過(guò)實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但是本發(fā)明并不僅僅局限于以下實(shí) 施例。實(shí)施例1本發(fā)明的發(fā)明人首次通過(guò)可視芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)8種轉(zhuǎn)基因棉花的同時(shí)、快速檢 測(cè)。所使用的檢測(cè)主要儀器微量移液器(10μ LUOOy LUOOOy L Eppendorf)、熒光定量 PCR 儀(ABI 7700Applied Biosystems, USA))、高速臺(tái)式離心機(jī)(Picol7Thermo)、高速粉碎機(jī) (IKA-WEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析儀(DYY-6C北京六一儀器廠)、紫外凝膠成像儀為 Syngene公司生產(chǎn)Gene Genius系統(tǒng)；BioDot公司生產(chǎn)AD3200芯片點(diǎn)樣儀等。檢測(cè)主要試劑引物與探針序列均為本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)，由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司 合成(其具體序列見(jiàn)表1)。Taq酶、dNTPs、10XPCR Buffer、溴化乙錠、DNA Ladder Marker (Takara) ；TaqManUniversal PCR Master Mix(ABI)；移液器 Tips 使用帶濾芯的型 號(hào)，否則在混勻和分樣時(shí)非常容易污染；同時(shí)10 μ L和2. 5 μ L的移液器務(wù)必使用長(zhǎng)Tips， 普通短Tips在工作時(shí)，移液器桿部可能會(huì)與離心管內(nèi)壁接觸，造成污染。2000 bp DNA LadderMarker、核糖核酸酶(RNaseA)、蛋白酶K等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；辣根 過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素抗體溶液、5mg/mL酸處理酪蛋白購(gòu)自北京紐海文公司科技有限公 司；Hotstar Taq購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司。無(wú)水乙醇、三氯甲烷、異丙醇、SDS等其他化學(xué)試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)中所用空白可視芯片購(gòu)自美國(guó)Bic^tar公司。CTAB 提取緩沖液 CTAB ； 100mmol/LTris-Cl pH 8. 0 ；20mmol/LEDTApH 8. 0 ； 1. 2mmol/LNaCl ；2% PVP) ；CTAB沉淀液(0. 5% CTAB ；IOOmM Tris-Cl pH 8. 0 ；20mmol/LEDTA pH8. 0 ； 1. 2mmol/L NaC 1) ；TE緩沖液(10mmol/L Tris-Cl ；lmmol/LEDTA pH 8.0) ；5XSSC溶 液由pH 7. 0的0. 75mol/L的氯化鈉溶液和0. 075mol/L的檸檬酸鈉溶液組成；1 %的TMB溶
8液用二甲基甲酰胺溶解配制。檢測(cè)主要步驟IDNA 提取稱取50. Omg樣品粉末，加入l.Oml CTAB提取緩沖液及4. 0 μ L蛋白酶K(IOmg/ ml)，65°C溫浴孵化Ih ； 12000rpm離心15min，取幾近清澈的上清700μ 1 ；加入500 μ L氯仿， 高速渦旋混合30秒；12000rpm離心lOmin，收集500 μ L上清，轉(zhuǎn)移到新的1. 5ml反應(yīng)管中； 加入兩倍體積的CTAB沉淀緩沖液，室溫，孵育Ih ； 12000rpm離心5min棄上清，將沉淀溶于 350 μ L的1. 2mol/L的氯化鈉溶液中，充分溶解；加入350 μ L三氯甲烷，小心高速渦旋混合 30秒；以12000rpm離心lOmin，將上清轉(zhuǎn)移到新的反應(yīng)管中；加入0. 8倍的異丙醇，室溫孵 育至少20min ； 12000rpm離心lOmin，棄上清；在沉淀中加入500 μ L70 %乙醇，高速渦旋30 秒，以 12000rpm 離心 IOmin ；棄上清，60°C干燥 15_25min，并溶于 50 μ LTE (pH 8. 0)，-20°C 保存?zhèn)溆谩Ｃ看翁崛【O(shè)立相應(yīng)的空白對(duì)照(以雙蒸水代替樣品)。2芯片檢測(cè)所用引物和探針表1基因芯片引物與探針序列
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片，所述芯片包括基片和位于基片上的核酸探針，所述核酸探針 包括選自核苷酸序列為 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 20和SEQ ID NO. 23的核酸探針中的一種或多種核酸探 針，其中在所述探針的5’端從5’到3’方向依次連接有醛基和10-20個(gè)脫氧腺嘌呤核苷酸殘基。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片，其中所述芯片為可視芯片。
3.如權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片，所述基片由聚苯乙烯材料、玻璃片或 經(jīng)處理的硅片構(gòu)成，或?yàn)榭缮藤?gòu)的空白芯片。
4.如權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片，所述芯片還包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
5.一種轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基 因棉花檢測(cè)芯片和用于PCR擴(kuò)增的特異性寡核苷酸引物對(duì)，所述引物對(duì)包括以下一對(duì)或多 對(duì)引物用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系3006-210-23的SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉 花品系沘1-24-236的SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 4 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系LLC0TTN 25的SEQ IDN0. 6和SEQ ID N0. 7 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系Mon531的SEQ IDN0. 9和SEQ ID NO. 10 ；擴(kuò)增 轉(zhuǎn)基因棉花品系Monl5985的SEQID N0. 12和SEQ ID N0. 13 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系Monl445 的 SEQ ID N0. 15 和 SEQ ID N0. 16 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系 GHB614 的 SEQ ID N0. 18 和 SEQ ID N0. 19 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系GK12的SEQ ID N0. 21和SEQ ID N0. 22，所述引物的5，端 連接有共價(jià)結(jié)合的生物素。
6.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)試劑盒，其還包括用于可視性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花 的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素抗體和辣根過(guò)氧化物酶的底物。
7.如權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)試劑盒，其中所述辣根過(guò)氧化物酶的底物為四 甲基聯(lián)苯胺。
8.檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花的方法，所述方法包括(1)提取待測(cè)棉花的DNA，所述棉花包括棉花原料或棉花加工產(chǎn)品；(2)使用以下一對(duì)或多對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系3006-210-23的SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉 花品系沘1-24-236的SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 4 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系LLC0TTN 25的SEQ IDN0. 6和SEQ ID N0. 7 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系Mon531的SEQ IDN0. 9和SEQ ID NO. 10 ；擴(kuò)增 轉(zhuǎn)基因棉花品系Monl5985的SEQID N0. 12和SEQ ID N0. 13 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系Monl445 的 SEQ ID N0. 15 和 SEQ ID N0. 16 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系 GHB614 的 SEQ ID N0. 18 和 SEQ ID N0. 19 ；擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因棉花品系GK12的SEQ ID N0. 21和SEQ ID N0. 22，所述引物的5，端 連接有共價(jià)結(jié)合的生物素。(3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片雜交；(4)將步驟(3)的芯片與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素抗體雜交，洗滌；和(5)在步驟的芯片上加入辣根過(guò)氧化物酶的底物進(jìn)行反應(yīng)，水洗，干燥；(6)觀察顏色變化，確定所述待測(cè)棉花是否為轉(zhuǎn)基因棉花。
9.如權(quán)利要求8所述的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花的方法，其中所述辣根過(guò)氧化物酶的底物為四甲基聯(lián)苯胺。
10.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片或權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因棉花檢 測(cè)試劑盒在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片，該芯片包括基片和位于基片上的核酸探針，該核酸探針由選自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.20和SEQID NO.23的核酸探針中的一個(gè)或多個(gè)核酸探針組成。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片的試劑盒，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花的方法，以及本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片和試劑盒在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花中的應(yīng)用。使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)芯片能夠簡(jiǎn)單、高通量、快速、特異且靈敏地測(cè)定轉(zhuǎn)基因棉花。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102108399SQ201010575050
公開(kāi)日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2010年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月6日
發(fā)明者白素蘭, 鄧婷婷, 陳穎, 韓建勛, 黃文勝 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院