專利名稱：一種真核表達(dá)載體以及在制備抑制白血病細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種真核表達(dá)載體，以及該真核表達(dá)載 體在制備抑制白血病細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor, LIF)作為的IL-6細(xì)胞因子 家族的一員，能夠抑制白血病細(xì)胞，例如人HL-60、U937、小鼠Ml系的增殖。然而，白血 病細(xì)胞增長快速并對LIF感應(yīng)能力差的特性，使得機(jī)體內(nèi)有限的LIF無法有效抑制白血 病細(xì)胞的生長[T.Maekawa，D. Metcalf，Clonalsuppression of HL60 and U937 cells by recombinant human leukemia inhibitoryfactor in combination with GM-CSF or G-CSF, Leukemia 3(1989)270—276 ；D. P. Gearing, N. M. Gough, J. A. King, D. J. Hilton, N. A. Nicola, R. J. Simpson, E. C. Nice, A.Kelso, D. Metcalf, Molecular cloning and expression of cDNA encoding amurine myeloid leukaemia inhibitory factor (LIF), EMBO J 6(1987)3995-4002 ；T. Maekawa, D. Metcalf, D. P. Gearing, Enhanced suppression of human myeloidleukemic cell lines by combinations of IL-6, LIF, GM-CSF and G-CSF，Int JCancer 45(1990)353-358.]。而外源性、非生理劑量的LIF對脂肪細(xì)胞、生殖 細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞等正常細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性，同時干擾了細(xì)胞因子間的正常協(xié)調(diào)作 用，所以LIF的藥用價值也不能得到有效地體現(xiàn)[D. Metcalf，N. A. Nicola, D. P. Gearing, Effects of injected leukemia inhibitory factor onhematopoietic and other tissues in mice, Blood 76(1990)50-56·]。LIF是一種多功能、作用廣泛的細(xì)胞因子。它的廣泛生物學(xué)效應(yīng)是通過結(jié)合靶細(xì)胞 膜上的LIF受體(LIFR)來實現(xiàn)的。LIFR包括兩個亞基，LIFR α (gpl90) ^P LIFRβ (gpl30)。 其中，LIFR α含有1239個氨基酸，胞外區(qū)由789個氨基酸構(gòu)成，跨膜區(qū)由沈個疏水氨基酸 組成，胞內(nèi)去由238個氨基酸構(gòu)成。LIFRa的胞內(nèi)區(qū)共有三個功能域(Β0χ1、Β0χ2和Βοχ3)， 這一官能的主要作用結(jié)構(gòu)為YXXQ(Y為酪氨酸，X為任意氨基酸，Q為谷氨酰胺)，是激活細(xì) 胞內(nèi)信號分子的必須序列，在LIF-LIFR的信號通路激活過程中，LIF首先與LIFRa結(jié)合， 并使之與另一受體亞基β結(jié)合形成異源性二聚體，進(jìn)而啟動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引導(dǎo)胞外 的信號轉(zhuǎn)入核內(nèi)，調(diào)控特定基因的表達(dá)，使細(xì)胞產(chǎn)生一系列的生理或病理變化[Y. Zhang, Τ. ffillson, D. Metcalf, D. Cary, D.J.Hilton, R. Clark, N. A. Nicola, The box-1 region of the leukemia inhibitory factor receptoralpha-chain cytoplasmic domain is sufficient for hemopoietic cell proliferation anddifferentiation, J Biol Chem 273(1998)34370-34383.]。申請人:的前期工作中已證實，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式，將LIFRa細(xì)胞內(nèi)區(qū)全長 序列(LIFRa-CT)和含Box3功能域的C末端序列(LIFRa-CT3)分別富集于人類急性 早幼粒白血病細(xì)胞HL-60胞質(zhì)中，可促進(jìn)該系白血病細(xì)胞的粒細(xì)胞方向分化，并有效抑制其增殖潛力[H. Liu, J. Dan, S. Tang, S. Wu, Involving of the cytoplasmic region of leukemia inhibitory factor receptor alphasubunit, IL-6 related signal transducer-gp 130 or fas death domain for MAPKp42/44 activation in HL-60 cell with LIF or anti-Fas IgG, Mol Cell Biochem 217(2001) 113-120 ；H.Liu, S.Liu, S. Tang, K. Ji,F. Wang,S.Hu, Molecular analysisof signaling events mediated by the cytoplasmic domain of leukemia inhibitoryfactor receptor alpha subunit， Mol Cell Biochem 258 (2004) 15-23 ；L Yang，S. R. Liu, S. P. Tang, F. M. Wang, H. Q. Liu, [Effects of the box-3 region of theLIFRalpha-chain cytoplasmic domain(gpl90CT3)on the proliferation anddifferentiation of HL-60 cells·]， Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi 25 (2004) 679-682.]，這與臨床目前治療急性早幼粒白血病經(jīng)典方案，即全反式維甲酸+常 規(guī)化療藥物的治療原則是完全一致的。但脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式只能應(yīng)用于體外實驗，如何將 LIFRQ-CT3高效能地在病理性白血病細(xì)胞內(nèi)乃至胞核內(nèi)富集，仍需進(jìn)一步探索。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transduction domain, PTD)或稱細(xì)胞穿膜肽 (cellpenetrating peptides, CPPs)是一條以肽為載體的有效運輸各種物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞 及細(xì)胞核的系統(tǒng)[Y. Wang, H. Lin, S. Lin, J. Qu, J. Xiao, Y. Huang, Y. Xiao, X. Fu, Y. Yang, X. Li,Cell-penetrating peptide TAT-mediated delivery of acidic FGF toretina and protection against ischemia-reperfusion injury in rats, J Cell Mol Med(2009)； V. P. Torchilin,Cell penetrating peptide-modified pharmaceuticalnanocarriers for intracellular drug and gene delivery, Biopolymers 90(2008)604—610·]。通過不同 途徑，可經(jīng)PTD攜帶入胞/核的物質(zhì)有全長蛋白質(zhì)、DNA、化學(xué)藥物、寡核苷酸、40nm磁珠和 200nm 月旨質(zhì)體等[L. N. Johnson, S. Μ. Cashman, R. Kumar-Singh, Cell-penetrating peptide for enhanced delivery ofnucleic acids and drugs to ocular tissues including retina and cornea, Mol Ther 16 (2008) 107-114 ；W. J. Ryves, A. J. Harwood, Use of a penetratin-linked peptide indictyostelium,Mol Biotechnol 33(2006)123-132·]。目 前研究中最常用的PTD是人類免疫缺陷I型病毒(HIV-I)來源的TAT蛋白(TAT-PTD)片 段，其全長翻譯后僅為11個富含酸性氨基酸的寡肽，與其他PTD比較，TAT-PTD具有短小、 高效、不影響下游分子生理功能的優(yōu)良特性[L. Jiang, Y. Ma, J. Wang, X. Tao, D. Wei, The transduction of His_TAT_p53 fusion protein into the humanosteogenic sarcoma cell line (Saos-2)and its influence on cell cycle arrest andapoptosis, Mol Biol Rep 35(2008) 1-8.]。TAT可以有效地介導(dǎo)外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞。1998年，Nagahara等發(fā)現(xiàn)TAT-PTD與 其他蛋白融合表達(dá)的蛋白質(zhì)(TAT-蛋白質(zhì))能夠高效地進(jìn)入體外培養(yǎng)的細(xì)胞，并且表現(xiàn) 出生物學(xué)功能，具有生物學(xué)活性[H. Nagahara, A. M. Vocero-Akbani，E. L. Snyder, A. Ho, D. G. Latham, N. A. Lissy, Μ. Becker-Hapak, S. Α. Ezhevsky, S. F. Dowdy, Transduction of full-length TAT fusion proteins intomammalian cells :TAT_p27Kipl induces cell migration, Nat Med 4(1998) 1449-1452.]。近些時候，嚴(yán)世榮、李敬風(fēng)等將TAT蛋白的 PTD區(qū)段編碼基因與外源蛋白基因連接表達(dá)融合蛋白，再將其轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)融合蛋 白可以快速到達(dá)體內(nèi)各組織，且表現(xiàn)出較強(qiáng)生物活性[嚴(yán)世榮，嚴(yán)潔，等，Tat-β-半乳 糖苷酶對小鼠生物膜穿透性的研究，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床22 000 343-345 ；李敬風(fēng)，嚴(yán)潔，方峰，陳寶芳，孫萬群，嚴(yán)世榮，Tat融合蛋白在Sd大鼠腎組織表達(dá)的研究，鄖陽醫(yī)學(xué)院 學(xué)報22 (2003) 197-199.]。作為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)功能域，TAT-PTD全長僅含11個氨基酸 (TAT-PTD49_57 :YGRKKRRQRRR)，卻能將與之連接的近100%的融合物高效帶入細(xì)胞膜和核 膜。故其機(jī)制雖仍待進(jìn)一步闡明，TAT-PTD依然得到了廣大科研工作者的廣泛應(yīng)用?？傮w 來說，TAT-PTD的生物學(xué)應(yīng)用主要是通過融合蛋白的形式，利用細(xì)菌表達(dá)載體與靶基因、靶 肽、靶氨基酸等連接來實現(xiàn)的。一般來說，TAT的融合蛋白也都含有某種蛋白“標(biāo)簽”，以利 于進(jìn)一步的純化。純化后的TAT融合蛋白可直接應(yīng)用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞體系內(nèi)或?qū)嶒瀯?物體內(nèi)。以上技術(shù)雖然實用、成熟、蛋白產(chǎn)量充足，但費時費力，經(jīng)濟(jì)性差[Barka T5Gresik ES, Henderson SC(2004)Production of celllines secreting tat fusion proteins. J Histochem Cytochem 52(4) :469-477]。且原核表達(dá)體系得到的融合蛋白缺乏轉(zhuǎn)錄后的剪 切、翻譯修飾，很大程度上存在無生物活性的可能性。申請人:已于2004年3月M日就含有g(shù)pl90CT3基因的重組表達(dá)載體申請了中國 專利，并獲得授權(quán)，專利號為ZL200410017156. 7，發(fā)明名稱為抑制白血病細(xì)胞增殖的重組 表達(dá)載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種將LIFRa -CT3與TAT-PTD技術(shù)結(jié)合起來的真核表達(dá) 載體以及在制備抑制白血病細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，該真核表達(dá)載體不僅能夠得到高純度 融合蛋白LIFRa -CT3，而且表達(dá)的LIFRa -CT3能夠高效地在病理性白血病細(xì)胞內(nèi)乃至胞 核內(nèi)富集。本發(fā)明是在申請人的中國專利ZL200410017156. 7基礎(chǔ)上，根據(jù)采用LIFRa-CT3 能激活STAT3分子這一事實，將含有LIFR α的Box3基因的LIFR a -CT3與TAT-PTD緊密結(jié) 合，構(gòu)建成含有二者的重組真核表達(dá)載體；再通過設(shè)計相應(yīng)引物，使用PCR的方法并插入相 應(yīng)的人體免疫球蛋白IgG重鏈來源的信號肽序列(N端)和cMyc蛋白純化標(biāo)簽(C端)，本 發(fā)明的pcDNA3. 0-ss-TAT-CT3-cMyc重組質(zhì)粒及插入片段示意如圖1所示。本發(fā)明提供了一種真核表達(dá)載體，它含有以下序列-自N端至C端分別含有以 下基因片段人體免疫球蛋白IgG重鏈來源的信號肽增強(qiáng)子及序列、蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)功能區(qū) HIV-I型病毒來源的TAT-PTD、gpl90-CT3基因、cMyc蛋白純化標(biāo)簽；具體序列如下 GCCGCCACCATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCC AGAGGATATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAGGCGGTTATCAGCCTCAAGCAAAACCAGAAGAAGAACA AGAAAATGACCCTGTAGGAGGGGCAGGCTATAAGCCACAGATGCACCTCCCCATTAATTCTACTGTGGAAGATATAG CTGCAGAAGAGGACTTAGATAAAACTGCGGGTTACAGACCTCAGGCCAATGTAAATACATGGAATTTAGTGTCTCCA GACTCTCCTAGATCCATAGACAGCAACAGTGAGATTGTCTCATTTGGAAGTCCATGCTCCATTAATTCCCGACAATT TTTGATTCCTCCTAAAGATGAAGACTCTCCTAAATCTAATGGAGGAGGGTGGTCCTTTACAAACTTTTTTCAGAACA AACCAAACGATGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGTAG (如 SEQ ID NO 1 所示)；上述真核表達(dá)載體是PCDNA3. 0。本發(fā)明還提供了上述真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞所得的細(xì)胞株CH0-190CT3。具 體技術(shù)方案為將以上重組載體轉(zhuǎn)染入中國倉鼠卵巢癌細(xì)胞(CH0細(xì)胞)后加G418篩選， 挑取單克隆后大量擴(kuò)增CHO細(xì)胞，得到含有融合蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基上清。該上清經(jīng)包被有抗cMyc凝膠的蛋白層析柱純化，即可得到高純度的190CT3(如圖2所示)。本發(fā)明還提供了上述細(xì)胞株CH0-190CT3所制備的蛋白190CT3。本發(fā)明還提供了上述真核表達(dá)載體在制備抑制白血病細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案主要包括以下幾部分分別合成含有信號肽(ss)、cMyc標(biāo)簽(cMyc)，TAT-PTD (TAT)和 LIFR α -CT3 的相 應(yīng)引物；經(jīng)典分子生物學(xué)方法(參見《分子克隆實驗指南》，美國冷泉港出版社)構(gòu)建含有 以上基因的重組真核質(zhì)粒pcDNA3. 0-190CT3 ；轉(zhuǎn)染pcDNA3. 0-190CT3入CHO細(xì)胞并G418加壓篩選，建立高表達(dá) pcDNA3. 0-190CT3的真核表達(dá)細(xì)胞株。收集CHO培養(yǎng)基上清，通過針對cMyc蛋白標(biāo)簽的特異性蛋白層析柱純化得到融合 蛋白 190CT3。本發(fā)明經(jīng)體外實驗發(fā)現(xiàn)，濃度30μβ/πι1時，190CT3針對人早幼粒白血病細(xì)胞 HL-60具有高效穿膜性，可在30分鐘內(nèi)穿入透胞膜/核膜；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，190CT3可以替 代LIF，啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制早幼粒白血病細(xì)胞的生長，促進(jìn)其朝粒細(xì)胞方向分化，且無明顯 毒副作用，因而可作為針對早幼粒白血病細(xì)胞的特異性蛋白治療劑(如圖3與圖4的示)。本發(fā)明公開了表達(dá)抑制急性粒細(xì)胞白血病(Ml和Μ3)增殖的190CT多肽的真核表 達(dá)載體以及CHO細(xì)胞系，其含有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)功能域(HIVl-TAT)及白血病抑制因子(LIF) 受體α亞基胞內(nèi)區(qū)含功能域Βοχ-3的C-末端序列的基因。本發(fā)明得到的多肽190CT3具 有很高的穩(wěn)定性和穿膜性，可以顯著改善臨床早幼粒白血病治療中全反式維甲酸+常規(guī)化 療帶來的靶向性差，易抗藥，藥物入胞/入核難的問題。體外實驗證實，190CT3多肽直接作 用于急性粒系白血病細(xì)胞，可迅速穿透細(xì)胞膜和核膜，進(jìn)而抑制其增殖，促進(jìn)朝成熟粒細(xì)胞 方向分化。


圖1 :pcDNA3. 0-190CT3重組質(zhì)粒及插入片段示意圖。圖2 轉(zhuǎn)染了 pcDNA3. 0-190CT3分泌的上清經(jīng)純化、濃縮后，考馬斯亮藍(lán)染色和免 疫印跡染色的結(jié)果(其中ss-CT3-cMyc是轉(zhuǎn)染了 pcDNA3. 0-ss-CT3-cMyc的CHO細(xì)胞株所 做對照)。圖3 不同時間點下，免疫熒光術(shù)檢測濃度為30μ g/ml的融合蛋白加入HL-60培 養(yǎng)基后，入胞和入核的效率對照，其中A =PBS 陰性對照；B :ss-CT3_cMyc 組；C :ss-TAT-CT3_cMyc 組。圖 4 同一時 間點(Ih)，免疫熒光術(shù)標(biāo)記不同濃度的融合蛋白190CT3加入HL-60培養(yǎng)基后，入胞/入核
量與劑量的對應(yīng)關(guān)系。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例1 構(gòu)建pcDNA3. 0-190CT3真核表達(dá)載體
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1. 1所需試劑限制性內(nèi)切酶Ml I，Nhe I,Xho I和BamH I均購于上海英駿公司(Invitrogen, 上海)。DNA聚合酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒購于寶生物工程有限公司(Takara， 大連)。真核表達(dá)載體pcDNA3. 0購于美國hvitrogen公司(Carlshd，CA, USA)。鼠抗 人cMyc表位(標(biāo)簽)單克隆抗體購于Santa Cruz公司(Santa Cruz, CA, USA) ；FITC標(biāo)記 的熒光山羊抗鼠二抗購于上?？党晒?康成，上海)。以下所有引物合成均由上海英駿 (Invitrogen，上海)完成。1. 2真核載體pcDNA3. 0-190CT3的構(gòu)建準(zhǔn)備以真核表達(dá)載體pcDNA3. 0_gpl90CT3為模板(制備方法參見中國專利 ZL200410017156. 7)，采用標(biāo)準(zhǔn) PCR 擴(kuò)增流程(94°C 30s，56°C 30s，72°C 30s, 30 個循環(huán))，和 以下引物完成上游引物5，-CGC ]GGATCC| GCCGCCACCATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGC
CTCAGTCATAATATCCAGAGGA |GCTAGC| CGC jGTGG| \Kdj TATCAGCCT-3，(如 SEQ ID NO :2 所 示)下游引物5，-CCG |CTCGAG|丨 CTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCATCGTTTGGTTTGTTC-3， (如 SEQ ID NO 3 所示)其中上游引物含有BamH I，Nhe I，Sal I三個酶切位點(方框)和人IgG重鏈來 源的信號肽序列(下劃線)；下游引物含有》ιο I酶切位點(方框內(nèi))和cMyc蛋白純化標(biāo) 簽全長(下劃線)。以上PCR產(chǎn)物約含492個堿基對(bp)(序列為CGCGGATCCGCCGCCACCATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGT GCCTCAGTCATAATATCCAGAGGAGCTAGCCGCGTCGACTATCAGCCTCAAGCAAAACCAGAAGAAGAACAAGAAAA TGACCCTGTAGGAGGGGCAGGCTATAAGCCACAGATGCACCTCCCCATTAATTCTACTGTGGAAGATATAGCTGCA GAAGAGGACTTAGATAAAACTGCGGGTTACAGACCTCAGGCCAATGTAAATACATGGAATTTAGTGTCTCCAGACTC TCCTAGATCCATAGACAGCAACAGTGAGATTGTCTCATTTGGAAGTCCATGCTCCATTAATTCCCGACAATTTTTGA TTCCTCCTAAAGATGAAGACTCTCCTAAATCTAATGGAGGAGGGTGGTCCTTTACAAACTTTTTTCAGAACAAACC AAACGATGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGTAGCTCGAGCGG)，經(jīng)常規(guī)電泳，膠回收后，測序正 確率為100%。針對TAT-PTD 的插入片段(Genbank Accession No. AAT48070 ；TATGGCAGGAAGAAGC GGAGACAGCGACGAAGA)，首先，由hvitrogen公司合成兩條核苷酸鏈，序列分別為上游5’-CTAGCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAG-3，(如 SEQ ID NO :4 所 示)；下游5，-TCGACTCTTCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCGTGCCATAG-3，(如SEQ ID NO :5 所
示)°此兩條核苷酸鏈含有互補(bǔ)的TAT-PTD序列(下劃線)，并在兩端分別設(shè)計有針對 Nhe I和Ml I的粘性末端。經(jīng)常規(guī)去火程序(等體積混合兩核苷酸鏈，95°C aiiin后在 45min內(nèi)冷卻至25°C )后直接放入4°C保存。
1. 3 真核載體 pcDNA3. 0-190CT3 的構(gòu)建按常規(guī)流程，用BamH I和Bio I內(nèi)切酶分別酶切以上PCR產(chǎn)物和載體pcDNA3. 0， 用膠回收試劑盒回收酶切后的DNA片段，然后以基因片段與載體片段摩爾比約3 1進(jìn)行 連接反應(yīng)。反應(yīng)體系(10μ1)包括Τ4連接酶緩沖液Ιμ ，載體片段50ng，基因片段20ng， T4連接酶1 μ 1，余用去離子水補(bǔ)足。反應(yīng)混合物置于16°C連接過夜，然后取全部連接產(chǎn)物 置于100 μ 1的DH5a感受態(tài)細(xì)菌中，0°C冰浴30min，43°C熱休克90s，二次冰浴^iiin,加入 LB培養(yǎng)基800 μ 1，37°C培養(yǎng)lh，5000rpm離心5min，棄掉800 μ 1上清，將菌體均勻涂布于 50 μ g/ml氨芐青霉素的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)18h。從轉(zhuǎn)化的平皿中挑去若干獨立菌落 接種于3ml含相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中，37°C震搖1 后送上海英駿公司測序。經(jīng)測序鑒定， 獲得 pcDNA3. 0-ss-CT3-cMyc 重組質(zhì)粒。對真核載體 pcDNA3. 0-190CT3,則用 Nhe I 和 Sal I內(nèi)切酶酶切以上載體pcDNA3. 0-SS-CT3-CMyC，用膠回收試劑盒回收酶切后的DNA片段，然 后將以上去火后的TAT-PTD插入片段片段與載體片段以摩爾比約3 1進(jìn)行連接反應(yīng)。連 接后轉(zhuǎn)化、涂板、挑克隆、測序操作與前述相同。經(jīng)最終測序鑒定，可得pcDNA3. 0-ss-TAT-C T3-cMyc (pcDNA3. 0-190CT3)重組質(zhì)粒。實施例2 建立穩(wěn)定的pcDNA3. 0-190CT3重組CHO細(xì)胞株首先確定篩選培養(yǎng)基中合適的G418 (Invitrogen)濃度，方法如下 孔細(xì)胞培養(yǎng) 板接種每孔1000個CHO細(xì)胞，并加G418使其濃度分別為500、1000、2000、3000 μ g/ml，選擇 能在10 14天把細(xì)胞徹底殺死的孔作為G418的篩選濃度。參照轉(zhuǎn)染試劑Fugene 6操作說明書轉(zhuǎn)染pcDNA3. 0-190CT3至CHO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后 對小時，按1 10比例進(jìn)行細(xì)胞傳代，用含有3000 μ g/ml G418的壓力篩選培養(yǎng)液篩選培 養(yǎng)細(xì)胞，10 14天后，用克隆環(huán)圈住具有新霉素抗性的細(xì)胞克隆集落，胰酶消化下后依次 于96孔、M孔和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板擴(kuò)大培養(yǎng)。篩選出的不同細(xì)胞克隆按照0. 5X IO6個細(xì)胞 接種于6孔板中生長至密度為90%左右時，胰酶消化下細(xì)胞后，使用RT-PCR方法檢測相關(guān) 基因的表達(dá)，所用引物如下上游5，-GGAGACAGCGACGAA-3，；下游5，-TTGTAAAGGACCACCC-3，；所用內(nèi)參為Hirp3，引物序列如下上游5，-CGTTATATTCGGGCTTGTGG-3，；下游5，-GGTCGACCTGAACTGCTGAT-3，。選擇表達(dá)水平最高的克隆擴(kuò)增并按常規(guī)方法凍存細(xì)胞，命名為CH0-190CT3。實施例3 融合蛋白190CT3的分離與純化將以上CH0-190CT3細(xì)胞株按照以下培養(yǎng)基成分，在75cm2培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培 養(yǎng)90%RPMI 1640培養(yǎng)基，9%胎牛血清(FBQ，1 %青鏈霉素，并在傳代細(xì)胞貼壁后添加 3000 μ g/ml G418新霉素。培養(yǎng)條件為37°C+5% CO2。待細(xì)胞融合至70 80%時，將培養(yǎng) 基更換15ml 100% RPMI 1640培養(yǎng)基。72小時后回收上清，IOOOOrpm離心20min去除細(xì)胞 碎片，將剩余上清馬上置于-20°C保存。重復(fù)以上上清回收程序直至回收量達(dá)到1L。在使 用蛋白層析柱純化相關(guān)蛋白前，將上清置于4°C，使其緩慢融化，然后通過0. 45 μ m濾器去 除可能的雜質(zhì)、死細(xì)胞及細(xì)胞碎片，準(zhǔn)備上樣至蛋白層析柱。使用Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)的針對cMyc蛋白標(biāo)簽的凝膠(ANTI-c-MycAGAROSECONJUGATE, A7470, Sigma Aldrich, USA)包被蛋白層析柱。包被完成后嚴(yán)格按照說明書冰 上操作。得到的溶于氨水的融合蛋白溶液使用IN醋酸進(jìn)行中和，使其pH值維持在約7.0。 然后，使用4°C離心機(jī)和3000MWC0超濾管(Millipore，上海)，3500rpm離心濃縮至約&ι1， 分裝后_80°C凍存?zhèn)溆?。融合蛋白的濃度測定使用上海生工公司的BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行。轉(zhuǎn)染了pcDNA3. 0-190CT3 及其對照質(zhì)粒 pcDNA3. 0-ss-CT3_cMyc 的 CHO 分泌的 上清經(jīng)純化、濃縮后，考馬斯亮藍(lán)染色和免疫印跡染色的結(jié)果顯示，與空白對照PBS相比， pcDNA3. 0-ss-CT3-cMyc與pcDNA3. 0-190CT3組均在18kDa左右出現(xiàn)了明顯蛋白條帶；從左 至右，第1 第4泳道，考馬斯亮藍(lán)染色；第5 第7泳道，使用cMyc標(biāo)簽特異性抗體標(biāo)記 的免疫印跡實驗。實施例4 急性早幼粒白血病細(xì)胞HL-60實驗(體外實驗)利用免疫熒光、細(xì)胞計數(shù)、流式細(xì)胞儀、免疫印跡等分子生物學(xué)實驗方法，從形態(tài) 學(xué)、相關(guān)蛋白表達(dá)量、融合蛋白入胞/入核情況及磷酸化水平等方面分析細(xì)胞形態(tài)變化； STAT3分子磷酸化、Jak2分子磷酸化水平及粒細(xì)胞表明標(biāo)志物CD14和CD15來分析融合蛋 白對HL-60細(xì)胞分化與增殖的影響。具體方法如下1)細(xì)胞生長狀態(tài)的比較按照30 μ g/ml的終濃度將以上純化后的融合蛋白加入標(biāo)準(zhǔn)HL-60細(xì)胞培養(yǎng)體系 中，用倒置相差顯微鏡觀察按照不同時間點(1 7天)排列的HL-60細(xì)胞及野生型HL-60 細(xì)胞(每M小時補(bǔ)充添加融合蛋白一次)，7天內(nèi)可見加入融合蛋白后的HL-60細(xì)胞組與 野生型HL-60細(xì)胞相比，細(xì)胞密度偏小，將2組分別計數(shù)后繪制細(xì)胞生長曲線。結(jié)果顯示 添加有融合蛋白190CT3的HL-60細(xì)胞組增殖明顯趨緩。2)細(xì)胞分化水平的比較將以上實驗組和對照組HL-60細(xì)胞在7天時，通過流式細(xì)胞儀檢測粒細(xì)胞表面 分化抗原CD14和CDllb的表達(dá)差異。使用BD公司提供的(BectonDickinson，F(xiàn)ranklin Lakes, NJ, USA) Calibu/流式細(xì)胞儀和⑶14，⑶lib抗體，嚴(yán)格按照說明書操作，結(jié)果使用 FACSCalibur 和 CELLQuest 3. 0 版本的軟件進(jìn)行分析處理(Becton Dickson, San Jose, CA, USA)。結(jié)果顯示，與野生型HL-60細(xì)胞比較，實驗組HL-60細(xì)胞的⑶14與⑶lib均顯著提 高，證實融合蛋白190CT3可在短時間內(nèi)促進(jìn)急性早幼粒白血病細(xì)胞朝粒細(xì)胞方向分化。3)免疫熒光檢測融合蛋白190CT3的入胞/入核情況制備以上實驗組與對照組HL-60的細(xì)胞圖片，方法記述于(J. P. Bach, H. Borta, W. Ackermann, F.Faust, 0. Borchers, Μ. Schrader, The secretory granuleprotein syncollin localizes to HL-60 cells and neutrophils, J Histochem Cytochem54 (2006) 877-888.) 一文中。用免疫熒光術(shù)檢測LIFR α的表達(dá)情況。一抗為兔抗 人LIFRa抗體(Santa Cruz, USA) ；二抗為FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中山生物技術(shù) 有限公司)。結(jié)果經(jīng)融合蛋白190CT3刺激后的HL-60細(xì)胞與野生型HL-60 (LIFR α陰性) 相比，30分鐘內(nèi)即可在1.0Χ IO5個早幼粒白血病HL-60細(xì)胞、胞核內(nèi)均顯示LIFRa強(qiáng)陽性， 且此陽性結(jié)果在他后仍可檢測到(圖幻。而在同一時間點(Ih)上，免疫熒光術(shù)標(biāo)記不同 濃度的融合蛋白190CT3加入HL-60培養(yǎng)基后，入胞/入核量與劑量的對應(yīng)關(guān)系如下隨著
9融合蛋白濃度的不斷增加，進(jìn)入HL-60細(xì)胞的蛋白量(以熒光強(qiáng)度示)在30yg/ml 190CT3 時達(dá)到頂峰，與之相比，即使190CT3量增至50 μ g/ml時亦未見熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(圖4)。 這說明融合蛋白190CT3可高效進(jìn)入HL-60細(xì)胞，并參與細(xì)胞的代謝和細(xì)胞通路變化。上述實驗證實本發(fā)明的重組融合蛋白表達(dá)載體pcDNA3. 0-190CT3通過真核表達(dá) 體系CHO細(xì)胞的高效表達(dá)，可分泌重組融合蛋白190CT3 ；該重組融合蛋白在經(jīng)過cMyc蛋白 層析柱純化后能在短時間內(nèi)高效率的進(jìn)入白血病細(xì)胞，并最終導(dǎo)致其增殖受抑制，粒系分 化程度增高。這說明190CT3融合蛋白可代替LIF啟動STAT3信號通路，抑制白血病細(xì)胞的 增殖并促進(jìn)其向粒細(xì)胞方向分化。因而，本發(fā)明重組表達(dá)載體可用于制備抑制白血病細(xì)胞增殖的靶向性蛋白藥物。
權(quán)利要求
1.一種真核表達(dá)載體，它含有如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真核表達(dá)載體，其特征在于該真核表達(dá)載體是PCDNA3.0。
3.用權(quán)利要求1或2所述的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入中國倉鼠卵巢癌細(xì)胞所得的細(xì)胞株。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞株制備的蛋白。
5.權(quán)利要求1或2所述的真核表達(dá)載體制備的蛋白。
6.權(quán)利要求4所述的蛋白在制備抑制白血病細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求5所述的蛋白在制備抑制白血病細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1或2所述的真核表達(dá)載體在制備抑制白血病細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明的目的在于提供一種將LIFRα-CT3與TAT-PTD技術(shù)結(jié)合起來的真核表達(dá)載體以及在制備抑制白血病細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明提供了一種真核表達(dá)載體，它含有如SEQ IDNO1所示的核苷酸序列，本發(fā)明還提供了上述真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系，本發(fā)明還涉及利用上述CHO細(xì)胞系生產(chǎn)的多肽190CT3具有很高的穩(wěn)定性和穿膜性，可以顯著改善臨床早幼粒白血病治療中全反式維甲酸+常規(guī)化療帶來的靶向性差，易抗藥，藥物入胞/入核難的問題。體外實驗證實，190CT3多肽直接作用于急性粒系白血病細(xì)胞，可迅速穿透細(xì)胞膜和核膜，進(jìn)而抑制其增殖，促進(jìn)朝成熟粒細(xì)胞方向分化。
文檔編號C12N5/10GK102080098SQ20101057642
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月7日
發(fā)明者劉厚奇, 孫擎, 楊玲 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)