專利名稱：一種真菌分子生物學(xué)鑒定的dna模板簡易制備及pcr擴增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可以用于大規(guī)模真菌菌株鑒定的、 不需要提取真菌DNA的PCR擴增模板簡易制備及擴增方法。
背景技術(shù)：
真菌廣泛分布于地球表面，從高山、湖泊到田野、森林、從海洋、高空到赤道、兩極、 到處都有(刑來君和李明春)。地球上估計存在有100-150萬種真菌，其中已報道的約有 10萬種(Hawksworth 1991 ；邱立友等，2009)。真菌在在環(huán)境、工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥以及基礎(chǔ)生物學(xué)研究中具有重要作用，多年來一直被廣泛地研究。然而人類所了解的生境真菌組成只是很小一部分，很多生境的真菌組成及其功能有待調(diào)查研究。了解不同生境真菌的組成以及進行真菌資源開發(fā)，需要分離培養(yǎng)并鑒定所分離的真菌。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，真菌分子鑒定方法發(fā)揮著越來越重要的作用。進行真菌分子生物學(xué)鑒定，首先要提取真菌的DNA，常用的方法有CTAB法、SDS提取法、蝸牛酶法、蛋白酶K法(Alex et al. , 2001 ；昂莎莎等，2009)，各種改良的提取方法 (Saitoh et al. , 2006 ；劉素玲等，2006)及商品化的真菌DNA提取試劑盒(如EZ Spin Column Fungal DNA Isolation Kit)。這些方法主要的技術(shù)路線是用液氮破碎真菌菌絲， 加入各提取液溶解DNA，使用有機溶劑去除雜質(zhì)，通過沉淀法或膜結(jié)合法獲得DNA。雖然已經(jīng)報道的方法可以獲得大量的高純度的真菌DNA，但是這類方法存在費時費力費耗材等缺點ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題是大規(guī)模真菌分子生物學(xué)鑒定過程中，DNA制備方法復(fù)雜、費時、費力、費耗材等缺點。本發(fā)明的技術(shù)方案為 1.簡易真菌DNA的制備方法
用無菌鑷子或接種環(huán)，在超凈工作臺上取一環(huán)大小的真菌菌絲體，放入到0.2 mL的 PCR 管中，加入 2-5 倍于菌絲體積的 IXTE buffer (100 mmol I71 Tris-HCl, 10 mmol I71 EDTA, pH 8.0)，蓋緊管蓋后，放入PCR擴增儀，98 V加熱8_10 min。取上清即為簡易制備的真菌DNA，可以直接用作為PCR反應(yīng)的模板。2. PCR擴增技術(shù)
使用PCR擴增18 S rRNA與28 S rRNA之間ITS區(qū)域，上游引物ITS3: GCATCGATGAAGAAGAACGCAGC； ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC (White et al. 1990， PCR Protocols, Academic Press)。改良的PCR反應(yīng)體系如表1所示，使用較高濃度的Taq酶的激活劑Mg2+及較高濃度的Taq酶達(dá)到增強反應(yīng)體系的擴增能力的目的。直接吸取上述簡易制備的上清1 μ L作為PCR擴增反應(yīng)的DNA模板。擴增條件94 °C預(yù)變性5 min, 94 °C變性，30 sec ；55 °C退火，30 sec ；72 °C延伸，30 sec ;30 個循環(huán)；72 °C延伸，5 min。表1 PCR擴增的反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1. 一種真菌分子生物學(xué)鑒定的DNA模板簡易制備及PCR擴增方法，其特征是由以下步驟組成1)用無菌鑷子或接種環(huán)，在超凈工作臺上取一環(huán)大小的真菌菌絲體，放入到0.2 mL的 PCR管中；2)加入2-5倍于菌絲體積的IXTEbuffer，蓋緊管蓋后，放入PCR擴增儀，98 V加熱 8-10 min ；IXTE buffer 組成為100 mmol L-1 Tris-HCl, 10 mmol L-1 EDTA, pH 8. 0 ；3)取上清即為簡易制備的真菌DNA，用作為PCR反應(yīng)的模板；4)以改良的PCR反應(yīng)體系進行擴增反應(yīng)，50μ L PCR反應(yīng)體系包括10 XPCR buffer 5 μ L5MgCl2 20 mmol Γ1 6 μ L,dNTPs 10 mmol Γ1 1 μ L，*禾中弓 L 10 μ mol Γ1 2 μ L, Taq DNA polymerase 5 U μ Γ1 0.6 μ L，上述簡易真菌DNA 1 μ L ；使用較高濃度的Taq 酶的激活劑Mg2+及較高濃度的Taq酶增強PCR反應(yīng)體系的擴增能力。
全文摘要
本發(fā)明屬于環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可以用于大規(guī)模真菌菌株鑒定的、不需要提取真菌DNA的PCR模板簡易制備及PCR擴增方法。本發(fā)明所用的真菌DNA簡易制備方法是利用PCR擴增儀加熱破碎含有少量菌絲體的及少量TE緩沖液的PCR管，獲得少量的真菌DNA，結(jié)合改良的PCR擴增體系擴增獲得所真菌鑒定所需要的真菌DNA片段。該步驟少、低成本、操作簡單、擴增效果良好且環(huán)境友好，適用于大規(guī)模的真菌分子生物學(xué)鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK102559848SQ20101057786
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者何興兵, 王從彥, 王保忠, 王保明, 韓國民 申請人:南京大學(xué)