專利名稱：用于預(yù)防艾滋病的重組腺病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種新的疫苗，尤其是，所述疫苗為含有編碼人類免疫缺陷病毒-1 (HIV-I)結(jié)構(gòu)蛋白的經(jīng)過人工修飾的feig、Pol和野生的Env核苷酸序列的重組腺病毒。這些疫苗在體內(nèi)施用時用作病毒蛋白抗原生物合成的轉(zhuǎn)錄單位。
背景技術(shù)：
艾滋病被認為是世界上直接威脅人類健康的第一大傳染病，聯(lián)合國艾滋病聯(lián)合規(guī)劃署發(fā)表的《2004全球艾滋病疫情年度報告》指出，目前全球有3800萬名艾滋病病毒攜帯者，2003年共有290萬人死于艾滋病。2003年，亞洲地區(qū)共有110萬人被感染，50多萬人死于艾滋病，該地區(qū)目前共有740萬名艾滋病毒攜帯者。2003年底，中國有艾滋病病毒感染者約84萬，其中艾滋病患者約8萬例。報告感染數(shù)波及31個省、自治區(qū)、直轄市。雖然近幾年抗艾滋病藥物的“雞尾酒”療法在發(fā)達國家有效地控制了 HIV的蔓延，但是昂貴的價格 (在我國該藥物價格大約為3000-10000元人民幣/人/月)，耐藥病毒株的產(chǎn)生，長期用藥的副作用以及最終無法徹底清除患者體內(nèi)病毒等方面的不利因素顯示，只有艾滋病疫苗才能真正有效地預(yù)防和控制艾滋病。所以艾滋病疫苗研制勢在必行。國內(nèi)外有關(guān)方面研究現(xiàn)狀用HIV-I疫苗防治AIDS被國際上認為是目前最行之有效的方法，已成為世界上許多科研機構(gòu)研究的熱點。目前，關(guān)于艾滋病疫苗的生產(chǎn)國際上尚屬空白。而HIV-I疫苗的研制工作在國外已有多家大型科研機構(gòu)、制藥公司正開展進行。自八十年代發(fā)現(xiàn)艾滋病以來，人們就開始進行艾滋病疫苗的研究。一般來說， 減毒活疫苗和滅活疫苗能產(chǎn)生較好免疫保護性反應(yīng)，但安全性較差，不適用于作為艾滋病疫苗。隨著人類對艾滋病認識的不斷提高，九十年代初人們意識到CTUCytotoxic T Lymphocytes細胞毒性T細胞，即細胞免疫應(yīng)答)的重要性，越來越多的證據(jù)顯示陽性⑶8 介導(dǎo)的CTL在控制艾滋病毒感染中起舉足輕重的作用。因此人們開始研究用重組病毒載體疫苗來誘導(dǎo)CTL，然后用胞膜蛋白亞單位疫苗增強免疫來誘導(dǎo)中和抗體，カ圖從體液免疫和細胞免疫兩方面來誘導(dǎo)人體對艾滋病毒的保護反應(yīng)。但由于免疫強度有限，而用重組載體疫苗又難以進行多次增強免疫，所以在動物模型和人體試驗結(jié)果都顯示了較低的對HIV的免疫保護反應(yīng)。與其他病毒載體相比，腺病毒載體具有許多獨特的優(yōu)點①腺病毒顆粒相對穩(wěn)定，病毒基因組重排頻率低，外源基因插入段在病毒復(fù)制幾個周期后仍可保持不變，易用于重組DNA操作；②安全性較好，腺病毒無需整合進宿主細胞基因組中，目的基因在宿主細胞基因組外游離狀態(tài)下表達，整合突變致癌可能性小，基因毒性低；③腺病毒基因組較大 (361Λ)，絕大多數(shù)基因組(約351Λ)均能被外源基因取代，插入大片段外源性基因的潛力大；④有較大的宿主范圍，對于受體細胞是否處于分裂期要求不嚴格；⑤腺病毒載體容易將外源基因直接轉(zhuǎn)移到靶細胞中，并有效表達成活性蛋白。因此，第一代復(fù)制缺陷型腺病毒載體在動物模型中顯示了高效的臨床前轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和良好的效果。
3
國內(nèi)研究艾滋病疫苗的隊伍主要有中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院、衛(wèi)生部艾滋病預(yù)防與控制中心和病毒學(xué)研究所、清華大學(xué)、中國科學(xué)院微生物所及一些部隊院校等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用于預(yù)防艾滋病的重組腺病毒疫苗(A-GPE)。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是該預(yù)防艾滋病的重組腺病毒疫苗一種含有轉(zhuǎn)錄單位的經(jīng)過重組的腺病毒，所述轉(zhuǎn)錄單位編碼人類免疫缺陷病毒-I(HIV-I)結(jié)構(gòu)蛋白序列，該人類免疫缺陷病毒-1 (HIV-I)結(jié)構(gòu)蛋白序列是具有免疫原性的人類免疫缺陷病毒-1 (HIV-I) 抗原，其中轉(zhuǎn)錄單位指導(dǎo)抗原的合成。本發(fā)明的一個重要方面，采用的腺病毒是復(fù)制缺陷型腺病毒。在本發(fā)明的另一個重要方面，所含有的轉(zhuǎn)錄單位編碼的是人類免疫缺陷病毒-1 (HIV-I) B/C重組型的結(jié)構(gòu)蛋白，進一步包括人類免疫缺陷病毒-1 (HIV-I)的完整核心蛋白(iag、編碼酶類蛋白的Pol和外膜蛋白Env。其各氨基酸序列分別如SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3, SEQ ID NO 4 所述。本發(fā)明所述的重組的腺病毒是非復(fù)制型的。本發(fā)明可作為一種用于預(yù)防艾滋病的復(fù)制缺陷型的重組腺病毒載體疫苗，它包含了可編碼人類免疫缺陷病毒-I(HIV-I)結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個重要實施方案中，包含由穿梭質(zhì)粒pDC316-GPE與5型腺病毒重組而成，穿梭質(zhì)粒PDC316-GPE包含了編碼人類免疫缺陷病毒-I(HIV-I)結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列，穿梭質(zhì)粒PDC316-GPE的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所述，其中編碼feigPol的核苷酸序列來源于經(jīng)過修飾的野生型人類免疫缺陷病毒-I(HIV-I) WfegPol的核苷酸序列，而編碼 Env蛋白的核苷酸序列則來源于未經(jīng)修飾的野生型人類免疫缺陷病毒-1 (HIV-I)的Env的核苷酸序列。本發(fā)明提供了一種藥用組合物，為含有轉(zhuǎn)錄單位的經(jīng)過重組的腺病毒和一種可藥用的載體。它的一個重要實施方案中含有轉(zhuǎn)錄單位的經(jīng)過重組的腺病毒A-GPE與生理鹽水的滴度體積比為IO6-IOuiPfVml,每次注射0. lml，注射1次。本發(fā)明提供了一種抗原，其由含有轉(zhuǎn)錄單位的經(jīng)過重組的腺病毒表達產(chǎn)生，該表達產(chǎn)生的是人類免疫缺陷病毒-1 (Hiv-I)的結(jié)構(gòu)蛋白feig、Pol和Env。本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)表達水平高；( 感染多種細胞，使抗原有效地提呈到不同的組織；(3)安全性好；(4)疫苗靶抗原包括了幾乎所有的HIV-I結(jié)構(gòu)蛋白，如feigPol和 Env,更好的誘導(dǎo)人體產(chǎn)生對HIV有效的免疫保護。


圖1、穿梭質(zhì)粒pDC316-GPE示意圖。該質(zhì)粒共含有10770bp，包括ITR與IoxP 兩段與腺病毒載體的同源序列，正是由于這兩段同源序列的存在，使該重組穿梭質(zhì)粒 PDC316-GPE和腺病毒包裝質(zhì)粒在細胞內(nèi)能發(fā)生同源重組，從而構(gòu)建了重組腺病毒載體疫苗 A-GPE0圖2、A_GPE示意圖。HIV-I結(jié)構(gòu)基因表達框架重組到Ad_5的骨架序列中，基因表達的啟動子采用MCMV。圖3gagp0l基因重組腺苗病毒在哺乳動物細胞中的表達情況。
含有g(shù)agpol基因的重組病毒感染HEK293細胞，感染48_72小時后收集細胞，用 WESTEN BLOT檢測蛋白表達情況。LANE 1 空白對照；LANE 2 未修飾的gagpol基因表達產(chǎn)物；LANE 3 修飾的gagpol基因表達產(chǎn)物。圖4A-GPE在哺乳動物細胞中的表達。人HEK293細胞被A-GPE感染。蛋白表達用TOSTERN BLOT分析。實驗所用抗體為廣西壯族自治區(qū)HIV-I陽性血清。LANE 1 標準蛋白分子量；LANE2 空白對照；LANE 3 A-GPE表達產(chǎn)物；LANE 4 標準病毒(廣西壯族自治區(qū)HIV-I高發(fā)區(qū)病毒樣品)。
具體實施例方式實施例1抗原的選擇與修飾1、目的基因的選擇目前中國主要的HIV-I流行株為B/C重組型HIV-I。選擇的HIV-I中國流行株gagpol基因序列如SEQ ID NO :6，選擇的HIV-I中國流行株env基因序列如SEQ ID NO -J,我們這里用于構(gòu)建艾滋病疫苗的HIV-I目的基因就是根據(jù)上述B/C重組亞型的基因序列為基礎(chǔ)，然后對gagpol進行了全序列人工合成，該合成的基因所表達的氨基酸序列與野生的HIV-I中國流行株gagpol基因表達的氨基酸序列一致，但基因表達效率則大大提
問ο以上述修飾過的gagpol和野生的env基因作為目標抗原的基因，它們的表達產(chǎn)物組成了 HIV-I最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，因此它們是抗原基因的最佳選擇。2、抗原基因gagpol的修飾2. 1方法根據(jù)我們以前研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIV-I gag, pol基因內(nèi)存在許多抑制因子。這些抑制因子是以A和T為主組成，造成HIV-I mRNA不穩(wěn)定，不能從細胞核轉(zhuǎn)制到細胞漿，從而影響蛋白表達。去除抑制因子的辦法就是在不影響氨基酸編碼的前提下，將Codon 第三位的A或T盡量改為C或G。2. 2過程GPCINS、ENVCINS分別代表合成的全新的gagpol和env基因GPCINS基因序列合成引物Fl:GTGGGCGACGCCTACTTCAGCGTGCCCCTGGATAAGGACTTCCGGAAGTACACCGCCTTCACCATC CCCAGCGTGAACAATGAGACCRl:TGCACTGGAAGATGGCGGGGCTGCCCTTCCAGCCCTGGGGCAGCACGTTGTACTGGTACCGGATGC CGGGGGTCTCATTGTTCACGCF2 :GACTTCTGGGAGGTGCAGCTGGGCATCCCCCACCCCGCCGGCCTGAAGAAAAAGAAAAGCGTGACC GTGCTGGACGTGGGCGACGCR2 CAGATCGTCCATGTACTGGTAGATCACGATGTCGGGGTTCTGCTTCCGGAAGGGCTCCAGGATCTT GGTCATGCTGCACTGGAAGATGGCF3 :CATCTTCGCCATCCGGAAGAAAGACAGCTCCAAGTGGCGGAAGCTGGTGGACTTCCGGGAGCTGAA CAAGCGGACCCAGGACTTCTGGGAR3 TTCAGGAGGTGCTCCCGCAGTTCCTCGATCTTGGTCCGGTGCTGGCCGATCTCCAGGTCGCTGCCCACGTACAGATCGTCCATGTACTGGF4 :CCGCCATCTGCGACGAGATGGAAAAGGAGGGCAAGATCACCAAGATCGGCCCCGACAACCCCTACA ACACCCCCATCTTCGCCATCCGR4 :GGTGCAGCTCGTAGCCCATCCACAGGAAGGGAGGCTCCTTCTGGTGTTTCTTGTCGGGTGTGGTGA AGCCCCACTTCAGGAGGTGCTCCC F5 :TGAAGCTGAAGCCCGGCATGGACGGCCCCAAGGTGAAGCAGTGGCCCCTGACCGAGGAAAAGATCA AGGCCCTGACCGCCATCTGCGR5 CAGCTTCTGGATGTCGTTCACGGTCCAGCTGTCCTTCTCGGGCAGCTGGATGGGCTGCACGGTCCA CTTGTCGGGGTGCAGCTCGTAGCCF6 CATTGGCCGGAACATGCTGACCCAGCTGGGCTGCACCCTGAACTTCCCCATCAGCCCCATCGAGAC CGTGCCCGTGAAGCTGAAGCCR6 CCGCAGGAGCTTGCACAGCTGCCGCACCTTGATGCCGGGGTAGATCTGGCTGGCCCAGTTCAGCTT GCCCACCAGCTTCTGGATGTCGTTF7 :GAGCAGATCCCCATTGAGATCTGCGGCAAGAAAGCCATCGGCACCGTGCTGGTGGGCCCCACCCCC GTGAACATCATTGGCCGGAACR7 :TCTCCCGGTTCTCGGCCAGTTCCAGCTCGGCTTCCTCGGTCAGGGGCACGATGTCGGTCAGGGCCT TGGCGCCCCGCAGGAGCTTGCF8 :GTGAACCTGCCCGGCAAGTGGAAGCCCAAGATGATCGGCGGGATCGGAGGCTTCATCAAGGTGCGG CAGTACGAGCAGATCCCCATR8 TTGGCCCTGCTTCTGGATCTCGGCGATCAGCTCCTTGCTGGGGTCATAGTAGGCGCCGTGCACGGG CTCCTTCAGGATCTCCCGGTTCTCF9 :CTTGTCTCAATAAAAGTAGGGGGCCAGATAAAAGAGGCTCTCCTGGACACCGGCGCCGATGACACC GTGCTGGAGGAAGTGAACCTGCCCR9 :GGTCCGCATCTTGGCGTACTTGCCGGTCTTCAGGTTCTTGAAGGGCTCCTGGTAGATCTGGTAGGT CCACTGGTCTTGGCCCTGCTTCTG FlO :CCGAAGCAGGAACCGAAAGACAGGGAACCCTTAACTTCCCTCAGATCACTCTTTGGCAGCGACCC CTTGTCTCAATAAAAGTAGGGRlO :GCCCCAAATCACGATGCTCTCCATGGCGATCTTCTGCACGGCCTCGGTCAGCTGCTTCACGTCGT TGGTGTGGGCGGTCCGCATCTTGGCFl1:GGGAATTTTCTCCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCACCAGCAGAGAGCTTCAGGTTCGAGGA GACAACCCCAGCTCCGAAGCAGGAARl1:GTGGCCTGCCAGTAGTCGGTCCACCAGGTCTCCCAGGTCTCCTTCTGGATGGGCAGCCGGAACTT GGGGATCTTGCCCCAAATCACGATGFl2 :TGAAAGACTGTACTGAAAGGCAGGCGAATTTTTTAGGGAAATTTTGGCCTTCCCACAAGGGGAGG CCAGGGAATTTTCTCCAGAGCRl2 :GGGGTCCTTCTCCAGCTGGTACCACAGCTTCACCAGGGGAGGGGTGTTCACGAACTCCCACTCGG GGATCCAGGTGGCCTGCCAGTAGTCF13 :GCCACATCGCCAAGAACTGCAGGGCCCCTAGGAAAAAAGGCTGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGA CACCAAATGAAAGACTGTACTGAAA
Rl3 :ACGTAGCCGGCCTTGCCGATCTTGGTCTCCCGGTTAGCGGCGCCGTCCACGTAGAAGGTCTCCAC GCCGGCGATGGGGTCCTTCTCCAGCF14 :ACACCATCCTGATGCAGCGGAGCAACTTCAAGGGCAGCAAACGGATCGTGAAGTGCTTCAACTGT GGCAAGGAGGGCCACATCGCCAAGAR14 :TAGATGGCCTGCAGCTCGGTCTTCTGGTTGGTTGTGTCGGTCAGGCTCACGATTTTCTTCCGGCC TCTGTCGGTCACGTAGCCGGCCTTG F15 ACCGCCTGCCAGGGCGTGGGAGGCCCCAGCCACAAGGCCCGGGTGCTGGCTGAGGCCATGAGCCA GACCTCCAACACCATCCTGATGCAGR15 :CTGAATGATGCCCAGGGCGTACTGGCTGTCGGTCACGATGTTCACCTCGCTGCCGCTGTCCTGCA GGGCGATGTAGATGGCCTGCAGCTCF16 AGAATGCCAACCCCGACTGCAAGACCATCCTGCGGGCCCTGGGCAGCGGCGCCTCCCTGGAAGAG ATGATGACCGCCTGCCAGGR16 :TACACCCGCTCTTTCTTGATCAGCTGCTCAATGATCTGGTTCACCAGCTCGCTCTCGCTCTTGTC GGGCTGGGCCTGAATGATGCCCAGGFl7 :ATTCTTTAAGACCCTGCGGGCCGAGCAGGCCACCCAGGACGTGAAGAACTGGATGACCGACACCC TGCTCGTGCAGAATGCCAARl7 :ATGCCGTTGCTCACCAGCTTGTCCACCTGCTCGTTGCCCCCGATGCCCTTGTGGGCGGGCACCCA GCTCAGGTACACCCGCTCTTTCTTGF18 :GCGGATGTACAGCCCCACCTCCATCCTGGACATCAAGCAGGGCCCTAAGGAGCCCTTCCGGGACT ACGTGGATAGATTCTTTAAGACCCTR18 :GCCCGCCAGTTGCTGTGGTACTTCTCGTGTTCCTCCTGGGCCTTGTCGATGCCGTCCAGGAACAG CACCTTCCGGATGCCGTTGCTCACCF19 :GATGACCAACAATCCTCCCATCCCAGTGGGCGAGATCTACAAGCGGTGGATTATCCTGGGCCTGA ACAAGATCGTGCGGATGTACAGCCCR19 :CTTCAGCTGACACTGGTCGCAGCTGGCCACGATCTCCTTGGCCACGATGGGAGGCAGGTTGAAGT CGCTGGCCATGGCCCGCCAGTTGCT F20 :TGGCCAGATGCGGGAGCCCAGAGGCAGCGACATCGCCGGCACCACATCCAGCCTGCAGGAGCAGA TCGGCTGGATGACCAACAATCCTCCR20 CCCTCCAGGTGGGTGCAGTCCAGCTGCCAGATGCCGGGGCTGCAGTCCACCTGGCCGTGCATGGC CTCGCCCTTCAGCTGACACTGGTCGF21 :TGCTGAAGGACACCATCAACGAGGAAGCCGCTGAGTGGGACCGGCTGCACCCCGTGCACGCCGGC CCCGTGGCCCCTGGCCAGATGCGGGR21 :TGGCCGGTCTCGGCGGGGATCACCTCGGCCTCGATGTAGCCGCTGGCCACGTGGACGGCCACCAG AATGATCTTGCCCTCCAGGTGGGTGF22 :AGCGAGGGCGCCACCCCCCAGGACCTGAACACCATGCTGAACACCGTGGGCGGGCACCAGGCTGC CATGCAGATGCTGAAGGACACCATCR22 :AGTTGCTGCCGTTGTCGGTGTGGATCACCTTCACGGGCCACCGGCCGGCCAGCTTCAGGATGAAG TAGGCGGTCTCCTGGCCGGTCTCGG23 :CGGACCCTGAACGCCTGGGTGAAGGTCGTGGAGGAAAAGGCCTTCAGCCCCGAGGTGATCCCTATGTTCACCGCCCTGAGCGAGGGCGCCR23 :GGGGTTGTAGGGGATGCCGAACTCTTGCTGGATGCCGGCCCACCAGCAGGCTGCCTTCACAGCGG CGCTGGTGAAGTTGCTGCCGTTGTCF24 :CGACGAGAAGGTGAGCCAGAACTACCCCATCGTGCAGAACCCCCAGGGCCAGATGGTGCACCAGC CTCTGAGCCCCCGGACCCTGAACGCR24 TCGGCCTGGTCCCGCACCTGGCCGATCAGCTTTTTCAGCTCCTTGTTCATGCTCTCCACCACGCC CTGGCTCTGGGGGTTGTAGGGGATG F25 :AGGCCCTGGACAAGATCGAGGAAGAGCAGAACAAGATCCAGCAAAAGACCCAGCAGGCCAAGAAA GCCGACGAGAAGGTGAGCR25 :AGCCTCCGATCCCGCCCTTCCGCTTGAAGTTGTGGATGAACACGGCCATCTGCACGGCGGTCTTC AGGTGCTCGGCCTGGTCCCF26 :ACCGAGGAACTGCGGAGCCTGTTCAACACCGTGGCCACCCTGTACTGCGTGCACGAGGAAATCGA GGTGCGGGACACCAAGGAGGCCCTGR26 :GGATCTTAATGATCTGCTTCTGCAGCTCCCGGGTCTGGATGTCGGTGGCGATAATGTCCACGATC CGCTCGCCGGCGCTGTAGCCTCCGAF27 :GGCCTCCTGGAGACCAGCGAAGGCTGCAAGCAGATCATTAAGCAGCTGCAACCCGCCCTGCAGAC CGGCACCGAGGAACTGCGGR27 :AGAGCAGCTTGGCGGGGCCCTTCCAGATGGGGTCCCGGCTGTCTCTATAGTACACCCGGAAGTTC TGGATCTTAATGATCTGCTTCF28 :TGAGACCCGGAGGCAAGAAACACTACATGCTGAAGCACCTGGTGTGGGCCAGCCGGGAGCTGGAA AGATTCGCCCTGAACCCCGGCCTCCR28 TGATAATCTTGGCCTTCCGTCTGGGCACGACCTTGATGTCGCTGTTGTCCTGGATCACGACGGCG CCCTCGCCCTTCCAGAGCAGCTTGGF29 TOTAGA ATGGGCGCCCGGGCCAGCATCCTGCGGGGAGGCAAGCTGGACAAATGGGAGAAG ATCCGGCTGAGACCCGGAGGCAR29 GGATCCr TCAGTCCTCATCCTGCCGGCCGGCCACGCAGTCGGCGCCGGCCATCTGCTTGCCG TAGTCCTTGATAATCTTGGCCTTCCl.F代表正向引物，R代表反向引物;2.下劃線_部分為引物與模板互補部分；3.下劃線_部分為引入的新限制性核酸內(nèi)切酶(RE)位點xba I，為引入的
新RE位點BamH I ；4.基因合成的原理及過程本合成HIV基因采用聚合酶鏈式反應(yīng)法，即PCR法。PCR法是用一對與模板DNA互補的單鏈寡聚DNA作為引物，通過“加溫變性-退火-延伸”這一周期的多次循環(huán)，使與引物互補的模板DNA引物之間的區(qū)段得到擴增。擴增的產(chǎn)物應(yīng)該包括引物序列，如果在引物的末端含有一段非互補的序列，它們也能夠被包含在擴增的產(chǎn)物序列中。因此，可以利用這種原理在一段DNA的兩端按照合成引物的序列延長該DNA片段，經(jīng)過多輪PCR即可達到合成HIV基因之目的。第一輪PCR的目的是合成該基因中間的一段DNA序列，所以設(shè)計合成一對引物Fl和R1，F(xiàn)1為正向引物，Rl為反向引物，F(xiàn)l與所要合成的基因的中間部分的有義鏈序列一致， Rl與所要合成的基因的中間部分的反義鏈序列一致，且它們的3’端互補(見引物序列的下劃線處)，因此，第一輪PCR不需要加入模板，只需要加入Taq酶緩沖液、4種dNTP、引物F1、 引物Rl、Taq酶，補加水至一定體積，按照PCR的“加溫變性-退火-延伸”的程序進行多次循環(huán)。第二輪PCR以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，引物為F2和R2，F(xiàn)2將使擴增產(chǎn)物向5’端延長，R2將使擴增產(chǎn)物向3’端延長，該輪PCR產(chǎn)物為F2與R2之間的區(qū)段。第三輪PCR以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，引物為F3和R3，其余操作過程與第二輪PCR 相同。以后與此類同，經(jīng)過四輪PCR可合成GPCINS基因。2. 3抗原修飾的結(jié)果合成的全新gagpol (GPCINS)基因序列如SEQ ID NO :5。我們對gagpol修飾前后的核苷酸序列進行了比較，為了增加gagpol抗原的表達水平，修飾前后核苷酸序列變化較大，但核苷酸長度沒有變化，為4280bp。合成后我們用 FseI限制性內(nèi)切酶切去了整合酶3’端531個堿基對，新的gagpol核苷酸長度為3730bp， 從1至3730個堿基對中修飾后堿基變化個數(shù)為994，突變率為沈.6%?；蛐揎椙昂驡ag
氨基酸序列與野生型完全一致。我們對pol基因中的protease蛋白酶活性中心進行了失活突變(Pol第336位天門冬氨酸突變?yōu)榻M氨酸)，目的是使protease失去活性，從而也消除了逆轉(zhuǎn)錄酶保持活性的可能性。另外，由于我們用FseI限制性內(nèi)切酶切去了整合酶3’端531個堿基對，從而使整合酶完全失去活性，同時，由于修飾后整合酶基因所表達的蛋白與HIV-I病毒整合酶基因所表達的蛋白有較大的區(qū)別，這一點也可以用來區(qū)分該疫苗在人體內(nèi)引起的免疫反應(yīng)與 HIV-I病毒感染引起的免疫反應(yīng)的不同。實施例2重組腺苗A-GPE的構(gòu)建1、構(gòu)建過程用于構(gòu)建重組腺苗所用的gagpol基因為實施例1中修飾過的gagpol基因，構(gòu)建重組腺苗所用的env基因為野生型env基因，腺病毒為人體內(nèi)復(fù)制缺陷型腺病毒。上述HIV-I中國流行株(區(qū)域性)的gagpol和env基因被克隆到中間質(zhì)粒pDC316 中，構(gòu)成PDC316-GPE。如圖1所示pDC316_GPE質(zhì)粒中，利用穿梭質(zhì)粒中多克隆酶切位點將修飾過的gagpol基因和野生型env基因連接到穿梭質(zhì)粒pDC316中，得到質(zhì)粒pDC316_GPE。重組穿梭質(zhì)粒pDC316-GPE全序列如SEQ ID NO 1利用Lipofection2000(INVITR0GEN產(chǎn)品)將pDC316_GPE與腺病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293細胞中。利用Cre/loxP系統(tǒng)的作用實現(xiàn)重組，產(chǎn)生重組腺病毒A-GPE。形成如圖2所示的A-GPE重組病毒。以上被感染細胞培養(yǎng)7-10天后，收集細胞，凍融裂解細胞，離心除細胞殘渣，保留上清。取一定量上清，再次感染HEK293細胞，培養(yǎng)2_3天后，篩選，重復(fù)此篩選2_3輪，得到不含野生型腺病毒的A-GPE。將此A-GPE大量感染HEK293細胞進行擴增、純化、滴度檢測。
該重組疫苗所編碼的抗原蛋白的氨基酸序列如下Gag氨基酸序列如SEQ ID NO 2Pol氨基酸序列如SEQ ID NO 3Env氨基酸序列如SEQ ID NO 4我們比較測定序列與理論序列，沒有發(fā)現(xiàn)任何突變或插入基因，表達框架正確，沒有出現(xiàn)錯位。2、重組腺苗在哺乳動物細胞中抗原表達2.1、試驗材料和儀器抗原在哺乳動物細胞中表達6孔板、CO2培養(yǎng)箱、HEK293細胞；丙烯酰胺和N， N:亞甲雙丙烯酰胺(購于Sigma公司)；底物顯色液(購于Sigma公司)；細胞裂解液=DTT0. 617g, SDS 0. 8g, IM Tris-HCl ρΗ6· 83. 2ml,甘油 4ml, bromphenol 0. 08g, H2O 12. 8ml ；(化學(xué)試劑均購于 Sigma 公司)Tris-甘氨酸電泳緩沖液:25mmol/L Tris，250mmol/L 甘氨酸(電泳級)(ρΗ8· 3)， 0. 1% SDS ；(化學(xué)試劑均購于Sigma公司)轉(zhuǎn)移緩沖液39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris 堿，0.037% SDS (電泳級)，20% 甲醇；(化學(xué)試劑均購于Sigma公司)5%脫脂奶粉溶液IOg脫脂奶粉，200ml 1 XPBST ；(化學(xué)試劑均購于Sigma公司)HIV-I人陽性抗血清廣西壯族自治區(qū)疾病控制中心提供；抗HIV-IPM蛋白單克隆抗體(美國NIH試劑中心提供)；抗Env羊抗血清美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)試劑中心提供抗體稀釋液100-150 μ 1 HIV-I人陽性抗血清(或抗Env羊抗血清、抗HIV-1PM 蛋白單克隆抗體)加入到10_15ml 3%脫脂奶粉溶液中；PBS-T 含 0. 05% TffEEN 20 的 PBS(TWEEN 20 購于 Sigma 公司)；二抗液堿性磷酸酶偶聯(lián)兔抗人IgG抗體、堿性磷酸酶偶聯(lián)兔抗鼠IgG抗體和堿性磷酸酶偶聯(lián)兔抗羊 IgG 抗體購于 Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC.2. 2、實驗方法和步驟2. 2. 1重組腺苗(A-GPE)感染HEK293細胞株①于6孔板內(nèi)每孔加入1. OX IO6個細胞，1. 5ml培養(yǎng)基，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)約24小時。②棄去培養(yǎng)液，加入不含血清的培養(yǎng)基，各孔內(nèi)以A-GPE感染培養(yǎng)的細胞，M-GPE 用量為5-10pfu/細胞，留一孔不加A-GPE做對照。輕晃混勻，37°C培養(yǎng)3小時。③補加Iml 10%血清的培養(yǎng)基，混勻。④置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48-72小時。2. 2. 2細胞裂解①棄去培養(yǎng)液，每孔以aiil PBS洗細胞。②每孔加入Iml PBS，以細胞刮將細胞刮下轉(zhuǎn)移至具塞小離心管中，1000轉(zhuǎn)/分鐘
離心5分鐘，棄去上清。③向離心管中加入細胞裂解液100 μ 1，搖勻，100°C煮沸10分鐘，11800轉(zhuǎn)/分鐘，
離心20分鐘，取上清于另一離心管中。
2. 2. 3 電泳①膠板的配制10 %聚丙烯酰胺分離膠IOml 30 %丙烯酰胺溶液3. 3ml, 1. 5mol/ LTris (pH8. 8)2. 5ml, 10% SDS 0. lml, 10%過硫酸銨 0. lml, TEMED 0. 004ml ；5%濃縮膠溶液 5ml :30%丙烯酰胺溶液 0. 83ml, 1. Omol/L Tris (pH6. 8)0. 63ml, 10% SDSO. 05ml, 10%過硫酸銨 0. 05ml, TEMED 0. 005ml。迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注濃縮膠所需空間(梳子的齒長再加1cm)。用巴斯德吸管小心地在丙烯酰胺溶液上覆蓋一層異丙醇(當丙烯酰胺濃度 >10%時)。將凝膠垂直放置于室溫下。分離膠聚合完全后(30分鐘)，傾出覆蓋層液體，用去離子水洗滌凝膠頂部數(shù)次以除去未聚合的丙烯酰胺。盡可能排去凝膠上的液體，再用紙巾的邊緣吸凈殘留液體。在已聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，立即在濃縮膠溶液中插入干凈的Telfon 梳子。小心避免混入氣泡，再加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下。濃縮膠聚合完全后(30分鐘)，小心移出Telfon梳子，立即用去離子水洗滌加樣槽以除去未聚合的丙烯酰胺。如有必要，使用注射器上的注射針頭把濃縮膠上加樣槽之間的齒弄直。把凝膠固定于電泳裝置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液，排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。②每孔加入樣品或?qū)φ掌?5μ 1，將電泳裝置與電源相接(正極應(yīng)接下槽)。凝膠上所加電壓為200V。當電泳直至溴酚藍到達分離膠底部(約需40分鐘)，然后關(guān)閉電源。③從電泳裝置上卸下玻璃板，放在紙巾上，撬開玻璃板。緊靠最左邊一孔(第一槽)凝膠下部切去一角以標注凝膠的方位。2. 2. 4免疫印跡 ①切6張Whatman 3匪濾紙和1張硝酸纖維素膜(Mi 11 ipo HAffP或相應(yīng)的濾膜)， 其大小都應(yīng)與凝膠大小完全吻合；以轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡硝酸纖維素膜、濾紙。用軟鉛筆在濾膜一角作好標記。將凝膠于去離子水中略漂洗一下。②安裝轉(zhuǎn)移裝置采用simi-dry (Biorad產(chǎn)品)方法把電泳膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。安裝方法由底層依次安裝底部電極(陽極)、3層濾紙、一張硝酸纖維素膜、凝膠、3層濾紙、 頂部電極(陰極)。凝膠左下角置于硝酸纖維素膜標記處。排除所有氣泡。③連接電源，15V轉(zhuǎn)移30分鐘，斷開電源。④卸下裝置，取出硝酸纖維素膜，放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫搖床搖1小時。⑤棄去脫脂奶粉溶液，以IXPBST 15ml，室溫搖床洗膜15分鐘。⑥分別加入稀釋的人HIV-I陽性血清(抗Env羊抗血清、抗HIV-IPM蛋白單克隆抗體)10-15ml，室溫搖床振蕩1小時，棄去陽性血清，硝酸纖維素膜以雙蒸水沖洗兩次。⑦以IXPBST 15ml，室溫洗膜三次，每次5分鐘。⑧棄去PBST，加入二抗液10 μ 1，IXPBST 20ml，室溫搖床振蕩45分鐘。⑨取出膜，棄去液體；以IXPBST洗膜，棄去洗液；再以IXPBST洗膜，搖床振搖10 分鐘。
顯色棄去液體，加入底物顯色液20ml。終止反應(yīng)顯色清晰后棄去顯色液，加水適量，振搖，棄去水，將硝酸纖維素膜取出，晾干。2. 3. 1修飾和未修飾的gagpol基因在Ad_5中表達的區(qū)別修飾的和非修飾的gagpol基因被同時重組到MVA載體中。利用相同的病毒濃度感染HEK293細胞。用以比較修飾和未修飾的gagpol基因在MVA中表達的區(qū)別。結(jié)果如圖 3所示修飾的gagpol基因在表達水平上遠遠高于未修飾的gagpol基因。所以在以后的研究中，我們始終采用修飾的gagpol基因。實施例3A-GPE的抗原性研究試驗材料和儀器、試驗方法和步驟同實施例2中2重組腺苗在哺乳動物細胞中抗原表達。結(jié)果為檢測A-GPE的抗原性是否與中國的流行毒株的抗原性一致，我們用A-GPE 感染HEK293細胞來表達HIV-I抗原，并且采用免疫印跡的方法確認上述表達的抗原是否被中國的流行(來源于廣西壯族自治區(qū)HIV-I高發(fā)區(qū))毒株抗血清在免疫印跡試驗中所識別。同時用HIV-I中國流行株(來源于廣西壯族自治區(qū)HIV-I高發(fā)區(qū))病毒抗原作為陽性對照。試驗結(jié)果如圖4所示。A-GPE所表達蛋白能夠被中國流行(區(qū)域性)的抗血清所識別并與對應(yīng)的標準病
毒抗原性一致。實施例4
藥用組合物
A-GPE與生理鹽水的滴度體積比為:109pfu/ml，每次注射 0.1ml，注射1次。
實施例5
藥用組合物
A-GPE與生理鹽水的滴度體積比為:108pfu/ml，每次注射 0.1ml，注射1次。
權(quán)利要求
1.一種含有轉(zhuǎn)錄單位的經(jīng)過重組的腺病毒，所述轉(zhuǎn)錄單位編碼人類免疫缺陷病毒-I(Hiv-I)結(jié)構(gòu)蛋白序列，該人類免疫缺陷病毒-I(HIV-I)結(jié)構(gòu)蛋白序列是具有免疫原性的人類免疫缺陷病毒-I(HIV-I)抗原，其中轉(zhuǎn)錄單位指導(dǎo)抗原的合成。
2.如權(quán)利要求1所述的含有轉(zhuǎn)錄單位的經(jīng)過重組的腺病毒，采用的腺病毒是5型復(fù)制缺陷型腺病毒(5type replication defective adenovirus，Ad_5)。
3.如權(quán)利要求1所述的含有轉(zhuǎn)錄單位的經(jīng)過重組的腺病毒，所含有的轉(zhuǎn)錄單位編碼的是人類免疫缺陷病毒-1 (HIV-I) B/C重組型的結(jié)構(gòu)蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的含有轉(zhuǎn)錄單位的經(jīng)過重組的腺病毒，其轉(zhuǎn)錄單位所編碼的結(jié)構(gòu)蛋白包括人類免疫缺陷病毒-I(HIV-I)的完整核心蛋白feg、編碼酶類蛋白的Pol和外膜蛋白Env，其各氨基酸序列分別如SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4所述。
5.如權(quán)利要求1所述的含有轉(zhuǎn)錄單位的經(jīng)過重組的腺病毒是非復(fù)制型的。
6.如權(quán)利要求5所述的含有轉(zhuǎn)錄單位的經(jīng)過重組的腺病毒，可作為一種用于預(yù)防艾滋病的非復(fù)制型重組腺病毒載體疫苗，它包含了可編碼人類免疫缺陷病毒-I(HIV-I)結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求1所述的含有轉(zhuǎn)錄單位的經(jīng)過重組的腺病毒，為AdMax包裝系統(tǒng)。通過 Cre/loxP獲得重組病毒，此過程發(fā)生在293細胞中，從而避免在細菌中重組。將克隆了如權(quán)利要求1所述的含有轉(zhuǎn)錄單位的穿梭質(zhì)粒與攜帶了腺病毒大部分基因組的包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，利用Cre/loxP系統(tǒng)的作用實現(xiàn)重組，產(chǎn)生重組腺病毒。
8.如權(quán)利要求1所述的含有轉(zhuǎn)錄單位的經(jīng)過重組的腺病毒，由穿梭質(zhì)粒PDC316-GPE 與腺病毒重組而成，穿梭質(zhì)粒PDC316-GPE包含了編碼人類免疫缺陷病毒_1 (HIV-I)結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列，穿梭質(zhì)粒PDC316-GPE的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所述，其中編碼 GagPol的核苷酸序列來源于經(jīng)過修飾的野生型人類免疫缺陷病毒-I(HIV-I) WfegPol的核苷酸序列，而編碼Env蛋白的核苷酸序列則來源于未經(jīng)修飾的野生型人類免疫缺陷病毒-1 (HIV-I)的Env的核苷酸序列。
9.一種藥用組合物，其中含有如權(quán)利要求1所述的含有轉(zhuǎn)錄單位的經(jīng)過重組的腺病毒和一種可藥用的載體。
10.一種抗原，其由如權(quán)利要求1所述的含有轉(zhuǎn)錄單位的經(jīng)過重組腺病毒表達產(chǎn)生，該表達產(chǎn)生的是人類免疫缺陷病毒-1 (Hiv-I)的蛋白Gag、Pol和 ^ην。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于預(yù)防艾滋病的復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體疫苗，它包含了可編碼人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列。本重組腺病毒疫苗所含有的轉(zhuǎn)錄單位編碼的是HIV-1B/C重組型的完整核心蛋白Gag、編碼酶類蛋白的Pol和外膜蛋白Env。此外，為了基因表達效率的提高，本重組腺病毒最終選擇的為修飾過的Gag、Pol基因及野生型的Env基因。
文檔編號C12N7/01GK102559609SQ20101057833
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者于彬, 于湘暉, 孔維, 詹楊 申請人:吉林大學(xué)