專利名稱：一種高產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌。
背景技術(shù)：
琥珀酸，又名丁二酸，是一種常見的天然有機酸，作為三羧酸循環(huán)還原端的終端產(chǎn) 物，廣泛存在于人體、動植物以及微生物中，在生物代謝中占有重要地位。琥珀酸不僅可以 作為添加劑應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)，同時亦可以作為C4平臺化合物用于合成1，4_ 丁二 醇、四氫呋喃等大宗化學(xué)品以及PBS (聚丁二酸丁二醇酯)等生物可降解材料。琥珀酸的制備方法主要包括化學(xué)合成法和生物法。相比化學(xué)法難以控制、產(chǎn) 率不高、純度低、催化劑昂貴等問題，生物法合成琥珀酸具有成本低廉，產(chǎn)率較高同時兼 具固定co2的特點，因此生物法制備琥珀酸成為今年來的研究熱點。目前生物法合成 玻拍酸的主要菌禾中包括:Anaerobiospirilium succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes>Escherichia coli>Mannheimia succiniciproducens 等。其中谷M酸棒桿 菌Corynebacteriumglutamicum因其生長迅速、培養(yǎng)條件簡單、耐受性強、發(fā)酵條件成熟， 同時由于其厭氧代謝途徑中部分酶的缺失，使得其在厭氧條件下副產(chǎn)物較少，成為最具潛 力的生產(chǎn)琥珀酸的工業(yè)菌種。但是野生谷氨酸棒桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的過程中，總是伴 隨著副產(chǎn)物L(fēng)-乳酸和乙酸，影響了發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量，增加了后續(xù)分離的負荷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株高產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌，其厭氧條件 下不產(chǎn)生副產(chǎn)物L(fēng)-乳酸。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下發(fā)明人通過低能離子束注入技術(shù)，對谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032進行誘變，經(jīng)篩選得到一株谷氨酸棒桿菌，其厭氧下可高產(chǎn)琥珀 酸，同時不產(chǎn)生副產(chǎn)物乳酸。該菌株，其分類命名為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)SA001,目前該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (簡稱CGMCC)，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究 所，郵政編碼100101，登記入冊的編號是CGMCC No. 3991，保藏日期是2010年7月2日。以 此菌作為生產(chǎn)菌株。CGMCC No. 3991菌株具有下述性質(zhì)1、菌落形態(tài)學(xué)特征在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30°C劃線培養(yǎng)呈中度生長，菌苔線狀，24h為白色，48h后稍 呈淡黃色，隨培養(yǎng)時間的延長顏色稍增深。表面濕潤、光滑，有光澤，無黏性2、生理與生化特性a.培養(yǎng)溫度28 39°C，最適溫度為30°C ；b.在pH 5.0 8. 5范圍內(nèi)生長；
c.色素產(chǎn)生情況不產(chǎn)色素；3、營養(yǎng)特征谷氨酸棒桿菌可在合成培養(yǎng)基上生長，培養(yǎng)基成分明確且價格低廉。該培養(yǎng)基碳 源一般為葡萄糖或玉米糖化液，氮源可選用玉米漿干粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素以及 (NH4)2S04等，培養(yǎng)基中還包括鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽、鎂鹽、鋅鹽、鐵鹽、錳鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽 和鹽酸鹽等常用的無機鹽類，根據(jù)不同的氮源而定，以硫酸銨或尿素為唯一氮源時需全添 加，在以玉米漿干粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏時可以少量或不加入無機鹽。利用上述高產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)琥珀酸的方法，將保藏號為 CGMCCNo. 3991的菌株活化后，在28 39°C下好氧發(fā)酵12 16h，再在28 39°C下厭氧發(fā) 酵12 36h ；其中，好氧發(fā)酵培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基碳源10 40g/L，氮源10 20g/L，無機鹽 0 3g/L，生長因子0 0. 3mg/L，其余為水，pH 5. 0 7. 5 ；其中，厭氧發(fā)酵過程中，向好氧發(fā)酵培養(yǎng)基中添加碳源30 60g/L。其中，所述的碳源為葡萄糖或玉米糖化液。其中，所述的氮源為尿素或玉米漿干粉、牛肉膏、蛋白胨或酵母膏。其中，所述的無機鹽為鉀鹽、錳鹽、鐵鹽、鎂鹽、鋅鹽、銅鹽、鈣鹽、硫酸鹽、磷酸鹽或 鹽酸鹽中的任意一種或幾種的組合。其中，所述的生長因子為生物素和維生素中的任意一種或兩種的組合。最優(yōu)選的生產(chǎn)方式為將保藏號為CGMCC No. 3991的菌株活化后，在30°C下好 氧發(fā)酵12h，好氧階段通氣lv/vm、攪拌500rpm，再在30°C下厭氧發(fā)酵36h，厭氧階段攪拌 200rpm ；其中，所述的好氧發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖20g/L，K2HP04 *3H20 1. 5g/L, KH2P040. 5g/ L, MgS04 7H20 0. 4g/L, FeS04 7H20 20mg/L, MnS04 H20 20mg/L,尿素 2. 5g/L,生物素 100 u g/L，維生素 B1200 u g/L，其余為水，pH 7 ；其中，厭氧發(fā)酵過程中，向好氧發(fā)酵培養(yǎng)基中添加碳源40g/L，分別于厭氧發(fā)酵開 初始及厭氧發(fā)酵12h時各添加20g/L。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)勢(1)與化學(xué)法相比，能耗低，污染小，使用非化石資源作為原料，無需使用貴重金屬 作為催化劑，成本低廉，過程易操控，產(chǎn)量高。(2)與原始菌相比，發(fā)酵產(chǎn)物單一，副產(chǎn)物少，產(chǎn)量高。


圖1為本發(fā)明菌株CGMCC No. 3991厭氧發(fā)酵終點的高效液相色譜有機酸檢測圖 譜。其中，標(biāo)號1的峰為琥珀酸的響應(yīng)峰。圖2為本發(fā)明的出發(fā)菌株ATCC13032厭氧發(fā)酵終點的高效液相色譜有機酸檢測圖 譜。其中，標(biāo)號1的峰為乳酸的響應(yīng)峰，2為琥珀酸的響應(yīng)峰。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1 平板培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母膏 5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂 20g/L，pH7. 0。好氧發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，K2HP04 3H20 1. 5g/L，KH2P040. 5g/L， MgS04 7H200. 4g/L，F(xiàn)eS04 7H20 20mg/L，MnS04 H20 20mg/L，尿素 2. 5g/L，生物素 100 u g/ L，維生素B1200 u g/L，初始pH7. 0。5L發(fā)酵罐裝液量3L，115°C滅菌10分鐘。分別將保藏號為ATCC13032及CGMCC No. 3991菌首先于30°C平板活化菌種，24h后 接兩環(huán)生長良好的菌體入30mL發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C，200rpm培養(yǎng)12h，然后按照3% (v/v)接 種量轉(zhuǎn)接入3L發(fā)酵培養(yǎng)基，通空氣lv/vm，轉(zhuǎn)速500rpm，30°C，好氧發(fā)酵12h后，轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā) 酵，通C020 . 2v/vm，轉(zhuǎn)速200rpm，30°C培養(yǎng)。分別于厭氧發(fā)酵初始及發(fā)酵后12h各添加20g/ L葡萄糖。發(fā)酵36h后CGMCC No.的發(fā)酵液中含有37. 2g/L琥珀酸。厭氧階段糖酸轉(zhuǎn)化率 達到93%，較ATCC13032相比，琥珀酸產(chǎn)量提高了 325%，沒有副產(chǎn)物乳酸(見圖1和圖2)。實施例2 平板培養(yǎng)基同實施例1。好氧發(fā)酵培養(yǎng)基玉米糖化液400mL/L(玉米糖化液的含糖量約為50g/L)， K2HP04 3H20 1. 5g/L, KH2P040. 5g/L, MgS04 7H20 0. 4g/L, FeS04 7H20 20mg/L, MnS04 H20 20mg/L，尿素2. 5g/L，生物素100 u g/L,維生素B1200 u g/L,初始pH7. 0。5L發(fā)酵罐裝液量 3L，115°C滅菌10分鐘。分別將保藏號為ATCC13032及CGMCC No. 3991菌首先于30°C平板活化菌種，24h后 接兩環(huán)生長良好的菌體入30mL發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C，200rpm培養(yǎng)12h，然后按照3% (v/v)接 種量轉(zhuǎn)接入3L發(fā)酵培養(yǎng)基，通空氣lv/vm，轉(zhuǎn)速500rpm，30°C，好氧發(fā)酵14h后，轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā) 酵，通C020 . 2v/vm，轉(zhuǎn)速200rpm，30°C培養(yǎng)。分別于厭氧發(fā)酵初始及發(fā)酵后12h各添加20g/ L葡萄糖。發(fā)酵36h后CGMCC No.的發(fā)酵液中含有36. 2g/L琥珀酸。厭氧階段糖酸轉(zhuǎn)化率 達到90. 5%，較ATCC13032相比，琥珀酸產(chǎn)量提高了 312%，沒有副產(chǎn)物乳酸實施例3 平板培養(yǎng)基同實施例1好氧發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖30g/L，蛋白胨5g/L，F(xiàn)eS04 7H20 20mg/L, MnS04 H2020mg/L，初始pH7. 0。5L發(fā)酵罐裝液量3L，115°C滅菌10分鐘。分別將保藏號為ATCC13032及CGMCC No. 3991菌首先于30°C平板活化菌種，24h后 接兩環(huán)生長良好的菌體入30mL發(fā)酵培養(yǎng)基，35°C，200rpm培養(yǎng)12h，然后按照3% (v/v)接 種量轉(zhuǎn)接入3L發(fā)酵培養(yǎng)基，通空氣lv/vm，轉(zhuǎn)速500rpm，30°C，好氧發(fā)酵16h后，轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā) 酵，通C020 . 2v/vm，轉(zhuǎn)速200rpm，35°C培養(yǎng)。分別于厭氧發(fā)酵初始及發(fā)酵后12h各添加20g/ L葡萄糖。發(fā)酵36h后CGMCC No.的發(fā)酵液中含有35. lg/L琥珀酸。厭氧階段糖酸轉(zhuǎn)化率 達到87. 75 %，較ATCC13032相比，琥珀酸產(chǎn)量提高了 298 %，沒有副產(chǎn)物乳酸實施例4 平板培養(yǎng)基同實施例1好氧發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，玉米漿干粉10g/L，初始pH7. 0。5L發(fā)酵罐裝液量 3L，115°C滅菌10分鐘。
分別將保藏號為ATCC13032及CGMCC No. 3991菌首先于30°C平板活化菌種，24h后 接兩環(huán)生長良好的菌體入30mL發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C，200rpm培養(yǎng)12h，然后按照3% (ν/ν)接 種量轉(zhuǎn)接入3L發(fā)酵培養(yǎng)基，通空氣lv/vm，轉(zhuǎn)速500rpm，30°C，好氧發(fā)酵16h后，轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā) 酵，通CO2O. 2v/vm，轉(zhuǎn)速200rpm，33°C培養(yǎng)。分別于厭氧發(fā)酵初始及發(fā)酵后12h各添加20g/ L葡萄糖。發(fā)酵36h后CGMCC No.的發(fā)酵液中含有35. 8g/L琥珀酸。厭氧階段糖酸轉(zhuǎn)化率 達到89. 5%，較ATCC13032相比，琥珀酸產(chǎn)量提高了 308%，沒有副產(chǎn)物乳酸。
權(quán)利要求
一種高產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌，其分類命名為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)SA001，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號是CGMCC No.3991。
2.利用權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)琥珀酸的方法，其特征在于 將保藏號為CGMCC No. 3991的菌株活化后，在28 39°C下好氧發(fā)酵12 16h，再在28 39°C下厭氧發(fā)酵12 36h;其中，好氧發(fā)酵培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基碳源10 40g/L，氮源10 20g/L，無機鹽0 3g/L，生長因子0 0. 3mg/L，其余為水，pH 5. 0 7. 5 ；其中，厭氧發(fā)酵過程中，向好氧發(fā)酵培養(yǎng)基中添加碳源30 60g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)琥珀酸的方法，其特征在于 所述的碳源為葡萄糖或玉米糖化液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)琥珀酸的方法，其特征在于 所述的氮源為尿素、硫酸銨、玉米漿干粉或酵母粉。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)琥珀酸的方法，其特征在于 所述的無機鹽為鉀鹽、錳鹽、鐵鹽、鎂鹽、鋅鹽、銅鹽、鈣鹽、硫酸鹽、磷酸鹽或鹽酸鹽中的任 意一種或幾種的組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)琥珀酸的方法，其特征在于 所述的生長因子為生物素和維生素中的任意一種或兩種的組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)琥珀酸的方法，其特征在于 將保藏號為CGMCC No. 3991的菌株活化后，在30°C下好氧發(fā)酵12h，好氧階段通氣lv/vm、攪 拌500rpm，再在30°C下厭氧發(fā)酵36h，厭氧階段攪拌200rpm ；其中，所述的好氧發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖20g/L, K2HPO4 · 3H20 1. 5g/L，KH2PO4O. 5g/L， MgSO4 · 7H20 0. 4g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 20mg/L，MnSO4 .H2O 20mg/L，尿素 2. 5g/L，生物素 100 μ g/ L，維生素B1200 μ g/L，其余為水，pH 7 ；其中，厭氧發(fā)酵過程中，向好氧發(fā)酵培養(yǎng)基中添加碳源40g/L，分別于厭氧發(fā)酵開初始 及厭氧發(fā)酵12h時各添加20g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌，其分類命名為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)SA001，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號是CGMCC No.3991。本發(fā)明還公開了利用上述高產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)琥珀酸的方法。本發(fā)明方法與化學(xué)法相比，能耗低，污染小，使用非化石資源作為原料，無需使用貴重金屬作為催化劑，成本低廉，過程易操控，產(chǎn)量高。本發(fā)明菌株與原始菌相比，發(fā)酵產(chǎn)物單一，副產(chǎn)物少，產(chǎn)量高。
文檔編號C12N1/20GK101984046SQ201010578530
公開日2011年3月9日 申請日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者嚴明, 李艷, 歐陽平凱, 許晟, 謝紅翠, 郝寧, 郝思清 申請人:南京工業(yè)大學(xué)