專利名稱：一種鑒別日本血吸蟲的引物、相應(yīng)的試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢驗(yàn)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒別日本血吸蟲的引物、相應(yīng)的試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
日本血吸蟲病是由日本血吸蟲引起的人獸共患性寄生蟲病，呈世界性分布，造 成了很大的經(jīng)濟(jì)損失，具有重要的公共衛(wèi)生和社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義。在我國(guó)，該病主要流行于 長(zhǎng)江流域及其以南的地區(qū)，除上海、浙江、福建、廣西和廣東省達(dá)到血吸蟲病阻斷標(biāo)準(zhǔn) 夕卜，江蘇、安徽、江西、湖北、湖南、云南和四川7個(gè)省份仍較為嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計(jì)，受此 病威脅人口達(dá)6000萬(wàn)，其中僅慢性病人就達(dá)80多萬(wàn)。2004年，我國(guó)將血吸蟲病與結(jié)核 病、艾滋病一起列為最重要的三大人類傳染病。近年來，全球氣候變暖、泥石流及洪水 頻繁爆發(fā)以及實(shí)施南水北調(diào)工程所引起的水位、氣候、植被及微生物等生態(tài)環(huán)境要素變 化對(duì)血吸蟲唯一中間宿主釘螺的分布產(chǎn)生了重大影響，使得疫情有所擴(kuò)散及回升趨勢(shì)， 給血吸蟲病防治工作帶來新的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。大量研究表明中國(guó)大陸日本血吸蟲的種群遺傳結(jié)構(gòu)與時(shí)空分布有密切關(guān)系。由 于自然環(huán)境長(zhǎng)期阻隔，其種群關(guān)系大體分為山區(qū)(四川和云南)和湖沼(安徽、江西、 湖北、浙江和湖南)兩個(gè)地域類型。由于氣候、環(huán)境及中間宿主分布的變化，山區(qū)型 和湖區(qū)型日本血吸蟲的基因交流頻率逐漸增加，使得不同地區(qū)分離株的變異呈現(xiàn)不規(guī)律 性。因而，準(zhǔn)確有效的鑒別山區(qū)型和湖沼型日本血吸蟲，建立相應(yīng)的基因信息庫(kù)并依此 建立我國(guó)日本血吸蟲溯源檢測(cè)方法，將為開展血吸蟲病的分子流行病學(xué)研究和診斷，以 及新發(fā)、輸入或變異病原體的發(fā)生發(fā)展規(guī)律研究提供重要的理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可以鑒別山區(qū)型和湖沼型日本血吸蟲的引物。本發(fā)明另一目的在于提供一種含有上述鑒別山區(qū)型和湖沼型日本血吸蟲的引物 的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供一種鑒別山區(qū)型和湖沼型日本血吸蟲的檢測(cè)方法。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明通過對(duì)來自于不同流行區(qū)的日本血吸蟲分離株進(jìn)行線粒體全基因組序列測(cè)定 及初步比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)了線粒體基因組序列中存在一個(gè)微衛(wèi)星(SSR)區(qū)域能夠用于山 區(qū)型和湖沼型日本血吸蟲的鑒別。進(jìn)一步通過對(duì)不同地區(qū)蟲株的大量重測(cè)序證明了該特 異SSR位點(diǎn)的存在，其中山區(qū)型日本血吸蟲比湖沼型日本血吸蟲多一個(gè)(AG)重復(fù)。一種用于鑒別山區(qū)型和湖沼型日本血吸蟲的引物，其上游引物核苷酸序列如 SEQ ID ΝΟ:1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。一種包含上述用于鑒別山區(qū)型和湖沼型日本血吸蟲的引物的試劑盒。
上述試劑盒中，包含如下組分
(1)DNA裂解液核裂解液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液的混合溶液；
(2)PCR反應(yīng)液dATP、dTTP、dGTP、dCTP、上游引物、下游引物和MgCl2W
混合溶液；
(3)山區(qū)型日本血吸蟲DNA對(duì)照和湖沼型日本血吸蟲對(duì)照。作為一種優(yōu)選方案，上述試劑盒中，還可以添加沿V DNA聚合酶。作為一種優(yōu)選方案，上述試劑盒中，各組分的量如下所示
(1)DNA裂解液，27.5mL:為100個(gè)反應(yīng)的200 μ L核裂解液、50 μ 1 ρΗ 8.0的 0.5mol/L的EDTA、20μ1蛋白酶K禾口 5yL RNase A溶液的混合溶液；
(2)PCR 反應(yīng)液，2.5mL:為終濃度 200|_miol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP, 終濃度0.25pmol/ μ L的上游引物和下游引物，2mmol/L的MgCl2的混合溶液；
(3)山區(qū)型日本血吸蟲DNA對(duì)照ΙΟΟμ 和湖沼型日本血吸蟲DNA對(duì)照ΙΟΟμ ； (5) Taq DNA 聚合酶，5U/VL，25μ 。本發(fā)明試劑盒的使用方法包括如下步驟
(1)日本血吸蟲DNA的提?。?br> (2)PCR擴(kuò)增按照擴(kuò)增樣品數(shù)取PCR反應(yīng)液、沿^酶混合，混勻，分裝；將山區(qū) 型、湖沼型對(duì)照液分別加入一個(gè)管中，取各樣品的DNA加入對(duì)應(yīng)反應(yīng)管中；離心混勻， 置于PCR擴(kuò)增儀上反應(yīng)；
(3)PCR產(chǎn)物觀察將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物加樣于加樣于6%變性聚丙烯酰胺凝膠上，電泳后置于膠片觀察燈上觀察結(jié)果并拍照分析；
作為一種優(yōu)選方案，步驟(2)所述沿^酶按每個(gè)PCR反應(yīng)含1.25U加入。作為一種優(yōu)選方案，步驟(2)所述PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min; 94°C 變性 30sec、56°C退火 30sec、72°C延伸 30sec，35 個(gè)循環(huán)；72°C后延伸 lOmin。作為一種優(yōu)選方案，步驟(3)所述6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳條件為90V電 壓電泳3h。本發(fā)明試劑盒PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化過程為
通過對(duì)鎂離子濃度和退火溫度的調(diào)節(jié)來對(duì)PCR條件進(jìn)行優(yōu)化。Mg2+濃度梯度在 l.OmM至3.0mM之間、退火溫度在48°C至58°C之間進(jìn)行調(diào)整，以取得用PCR擴(kuò)增的最佳 Mg2+濃度和最佳退火溫度。經(jīng)試驗(yàn)確定，最佳退火溫度為56°C; MgCl2W濃度為2mM; 循環(huán)數(shù)選擇為35個(gè)循環(huán)。本發(fā)明鑒別山區(qū)型和湖沼型日本血吸蟲的檢測(cè)方法包括如下步驟
(1)日本血吸蟲DNA提??；
(2)用權(quán)利要求1所述特異性檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
(3)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)分析，條帶位置與山區(qū)型DNA對(duì) 照相一致者為山區(qū)型日本血吸蟲，條帶位置與湖沼型DNA對(duì)照相一致者為湖沼型日本血 吸蟲；
(4)PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min ； 94°C變性30sec、56°C退火30 sec、72°C延 伸30 sec, 35個(gè)循環(huán)；72°C后延伸10 min。(5) 6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳條件為90V電壓電泳3h。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
(1)本發(fā)明通過對(duì) 來自于不同流行區(qū)的日本血吸蟲分離株進(jìn)行線粒體全基因組序列 測(cè)定及比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)山區(qū)型日本血吸蟲的線粒體基因序列比湖沼型日本血吸蟲多一個(gè)
(AG)重復(fù)，可用于兩種地域型的鑒定。本申請(qǐng)人根據(jù)此差異設(shè)計(jì)鑒別山區(qū)型和湖沼型 日本血吸蟲的特異引物及PCR和聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)體系，建立了用于鑒別山區(qū)型和湖 沼型日本血吸蟲的快速、特異、敏感的檢測(cè)方法；
(2)本發(fā)明通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，研制出一種鑒別山區(qū)型和湖沼型日本 血吸蟲的PCR試劑盒，試劑盒操作簡(jiǎn)單程序化，方法特異性強(qiáng)，敏感性高，結(jié)果判定客 觀，適用于日本血吸蟲地理型鑒定與溯源檢測(cè)等臨床及科研用途。


圖1為山區(qū)、湖沼型日本血吸蟲鑒別PCR特異性電泳圖譜，其中，M為DL2000 marker ； 1 7分別為日本血吸蟲，曼氏血吸蟲，埃及血吸蟲，肝片吸蟲，大片吸蟲， 華支睪吸蟲和麝貓后睪吸蟲；8為陰性對(duì)照。圖2為山區(qū)、湖沼型日本血吸蟲鑒別PCR敏感性電泳圖譜，其中，M為DL2000 marker ； 1 10為日本血吸蟲成蟲DNA模板質(zhì)量分別為8、6、4、2、0.8、0.6、0.4、 0.2、0.1、禾口 0.08 ng; 11 為陰性對(duì)照。圖3人工感染家兔日本血吸蟲病代表性樣品鑒別PCR聚丙烯酰胺凝膠 電泳圖譜，其中，M為DL2000 marker ； 1-19分別為山區(qū)型DNA對(duì)照，云南洱 源II (SJYEIIF5)，云南巍山(SJYWMl)，四川天全(SJSTMl)，四川西昌
(SJSXF21)，四川涼山(SJSLMl)，湖沼型DNA對(duì)照，湖北武漢(SJHWM3)， 湖南長(zhǎng)沙(SJHCM3)，湖南岳陽(yáng)樓(SJHLF5)，湖南君山(SJHYFl)，湖南汨羅
(SJHMFl)，湖南常德(SJHGFl)，江蘇無(wú)錫(SJJWF2)，江西南昌(SJJNMl)， 江西樟樹(SJJZM1)，江西永修(SJJYM23)，浙江嘉善(SJZJF3)，安徽貴池 (SJAGM3)。
具體實(shí)施例方式與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果 實(shí)施例1試劑盒的組成
試劑盒內(nèi)含DNA裂解液27.5mL，其中含Nuclei lysis solution、pH8.0的0.5M的 EDTA、蛋白酶 K (20mg/mL)禾Π RNase A solution (4mg/mL) ； PCR 反應(yīng)液 100 個(gè)反應(yīng) (25 μ L/反應(yīng))，為終濃度各 200μΜ 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP,終濃度 0.25pmol/ μ L的上游引物和下游引物，2mM的MgCl2、Taq Bl 25 μ L (5U/uL)；日本血吸蟲山 區(qū)型DNA對(duì)照和湖沼型日本血吸蟲DNA對(duì)照各1支。實(shí)施例2試劑盒特異性試驗(yàn)
用經(jīng)過DNA有效性驗(yàn)證的曼氏血吸蟲、埃及血吸蟲、肝片吸蟲、大片吸蟲、華支睪 吸蟲和社貓后睪吸蟲6個(gè)對(duì)照樣品DNA各1 μ 1為模板，按照試劑盒的反應(yīng)條件進(jìn)行特異 PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。表1 PCR擴(kuò)增體系
權(quán)利要求
1.一種用于鑒別中國(guó)大陸山區(qū)型和湖沼型日本血吸蟲的引物，其特征在于上游引物 序列如SEQ ID ΝΟ:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示。
2.—種試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的用于鑒別中國(guó)大陸山區(qū)型和湖沼型 日本血吸蟲的引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于包括如下組分(1)DNA裂解液核裂解液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液的混合溶液；(2)PCR反應(yīng)液dATP、dTTP、dGTP、dCTP、上游引物、下游引物和MgCl2W 混合溶液；(3)日本血吸蟲山區(qū)型DNA對(duì)照和湖沼型DNA對(duì)照。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于包括如下組分(1)DNA裂解液，27.5mL:為100個(gè)反應(yīng)的200 μ L核裂解液、50 μ 1 ρΗ 8.0的 0.5mol/L的EDTA、20μ1蛋白酶K禾口 5yL RNase A溶液的混合溶液；(2)PCR 反應(yīng)液，2.5mL:為終濃度 200|_miol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP, 終濃度0.25pmol/ μ L的上游引物和下游引物，2mmol/L的MgCl2的混合溶液；(3)日本血吸蟲山區(qū)型DNA對(duì)照ΙΟΟμ 和湖沼型DNA對(duì)照ΙΟΟμ ；(5) Taq DNA 聚合酶，5U/VL，25μ 。
5.權(quán)利要求2 4所述試劑盒的使用方法，其特征在于包括如下步驟(1)日本血吸蟲DNA的提?。?2)PCR擴(kuò)增按照擴(kuò)增樣品數(shù)取PCR反應(yīng)液、Taq酶混合，混勻，分裝；將陽(yáng)、 陰性對(duì)照液分別加入一個(gè)管中，取各樣品的DNA加入對(duì)應(yīng)反應(yīng)管中；離心混勻，置于 PCR擴(kuò)增儀上反應(yīng)；(3)PCR產(chǎn)物觀察取擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物加樣于6%變性聚丙烯酰胺凝膠上，90V 電壓電泳3h后置于膠片觀察燈上觀察結(jié)果并拍照分析。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述試劑盒的使用方法，其特征在于步驟(2)中所述PCR擴(kuò)增 條件為94°C預(yù)變性5min; 94°C變性30sec、56°C退火30sec、72°C延伸30sec，35個(gè)循 環(huán)；72°C后延伸IOmin0
7.利用權(quán)利要求1所述引物鑒別山區(qū)型和湖沼型日本血吸蟲的方法，其特征在于所述 方法包括如下步驟(1)日本血吸蟲DNA提?。?2)用權(quán)利要求1所述特異性檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)，膠片觀察燈上觀察，條帶與山區(qū) 型DNA對(duì)照相一致的即為山區(qū)型日本血吸蟲，條帶與湖沼型日本血吸蟲相一致的即為湖 沼型日本血吸蟲；(4)PCR 擴(kuò)增條件為 94°C預(yù)變性 5 min ； 94°C變性 30 sec、56°C退火 30 sec、72°C 延伸30 sec, 35個(gè)循環(huán)；72°C后延伸10 min。
8.(5) 6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳為90V電壓下電泳3h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒別日本血吸蟲的引物、相應(yīng)的試劑盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明用于鑒別日本血吸蟲的上游引物序列如SEQIDNO:1所示，下游引物序列如SEQIDNO:2所示。本發(fā)明還建立了用于快速檢測(cè)日本血吸蟲的方法，可準(zhǔn)確區(qū)分不同類型的血吸蟲。將本發(fā)明引物制備成試劑盒，具有操作程序簡(jiǎn)單化，檢測(cè)特異性強(qiáng)，敏感度高，結(jié)果判定客觀等優(yōu)點(diǎn)，適合推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102021247SQ20101057868
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者宋慧群, 朱興全, 李娟 , 林瑞慶, 翁亞彪, 袁子國(guó), 趙光輝, 鄒豐才, 陳芬 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)