專利名稱：一種新型谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶及其應(yīng)用，屬于蛋白質(zhì)工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(Transglutaminase，簡稱TGase，EC 2. 3. 2. 13)，又稱轉(zhuǎn)谷氨酰 胺酶，是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的酶。它具有多種催化功能，既可以使蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子 間交聯(lián)，也可以使蛋白質(zhì)和氨基酸連接還可以水解蛋白質(zhì)分子內(nèi)的谷氨酰胺，從而改變蛋 白質(zhì)本身以及其所附著細(xì)胞和組織等的結(jié)構(gòu)和功能，提高蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值，被譽(yù)為“21 世紀(jì)超級(jí)粘合劑”。成為目前食品加工領(lǐng)域最受關(guān)注和應(yīng)用最為廣泛的酶制劑。此外，在生 物醫(yī)藥，組織工程，紡織和皮革處理等多個(gè)領(lǐng)域也有著潛在應(yīng)用。鏈霉菌產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶是目前唯一可以商業(yè)化的能夠交聯(lián)蛋白的酶制劑。日本 的天野公司已經(jīng)將該酶推向了市場，獲得了巨大的利潤，而我國還處于研究階段。鏈霉菌谷 氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶是以酶原的形式分泌到細(xì)胞外部，在多種蛋白酶的作用下活化而成的。由于 鏈霉菌產(chǎn)酶和活化機(jī)理較為復(fù)雜，目前靠菌種的選育和發(fā)酵條件以及過程的優(yōu)化等傳統(tǒng)手 段來提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的產(chǎn)量還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到商業(yè)化的生產(chǎn)需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠活化酶原的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述新型谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的應(yīng)用方法，是將新型酶用 于谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的活化。所述新型谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的制備方法如下1)將發(fā)酵液去除菌體得到的上清液經(jīng)過硫酸銨分級(jí)沉淀，收集蛋白沉淀溶解后進(jìn) 行透析；2)將透析后的酶液加入到用pH 7. 5的Tris-HCl平衡好的陰離子交換柱Hitrap Q HP中，用Ο-lmol/L氯化鈉線形梯度洗脫，收集活性部分；3)將收集的活性部分用硫酸銨濃縮，將濃縮后的酶液加入Superdex 7510/300GL 層析柱中，用0. 15mol/L氯化鈉洗脫并收集活性部分；4)將收集到的活性部分加入到用pH 8. 5的TriS-HCl平衡好的陰離子交換柱 Hitrap Q HP中，用0-0. 4mol/L氯化鈉進(jìn)行線性梯度洗脫，收集洗脫時(shí)間20-30min的活性 部分。本發(fā)明所述發(fā)酵液是指以吸水鏈霉菌(Sti^ptomyces hygroscopicus) WSH03-13 作為出發(fā)菌株，10 %的接種量接菌至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，200r/min培養(yǎng)60h，得到含谷氨 酰胺轉(zhuǎn)胺酶的發(fā)酵液。吸水鏈霉菌(Sti^ptomyces hygroscopicus)WSH03-13已在中國專 利ZL03152956. 9公開，授權(quán)公告號(hào)CN 1208452C,授權(quán)公告日2005年6月四日。本發(fā)明通過對(duì)吸水鏈霉菌WSH03-13的發(fā)酵液的分離純化發(fā)現(xiàn)了一種新型谷氨酰 胺轉(zhuǎn)胺酶，該酶具有能夠活化酶原的特性，可用于將谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的酶原直接轉(zhuǎn)化成活性酶，解決了酶原向酶轉(zhuǎn)化過程中的問題，縮短了發(fā)酵時(shí)間，提高了發(fā)酵產(chǎn)量。


圖1.谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶分離純化全過程的SDS-PAGE電泳圖1、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、發(fā)酵上清液；3、鹽析后的酶液；4、第一次離子交換后的酶 液；5、Superdex 75凝膠過濾后的酶液；6、谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶A ；7、谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶B圖2. TGase B和酶原(ftO-TGase)混合物隨時(shí)間的酶活變化曲線圖3. TGase B和酶原(ftO-TGase)混合物隨時(shí)間的SDS-PAGE電泳分析1 分子量標(biāo)準(zhǔn)；2-9 分別為培養(yǎng)0h，0. 5h，lh，2h，4h，6h，8h，10h的混合物
具體實(shí)施例方式材料和檢測方法吸水鏈霉菌Gti^ptomyces hygroscopicus)WSH03-13，已在中國專利 ZL03152956. 9公開，授權(quán)公告號(hào)CN 1208452C,授權(quán)公告日2005年6月四日發(fā)酵培養(yǎng)基糊精20g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，CaCl2lg/L, MgS042g/L, K2HP042g/L, KH2P042g/L (pH 7. 0)。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活力測定方法以L-谷氨酸-Y -單羥肟酸為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 恒溫水浴鍋調(diào)到37°C，將底物(Z-Gln-Gly和羥胺)和待測樣品(40 μ L)放入水浴鍋預(yù)熱 lOmin，在樣品中加入100 μ L底物，反應(yīng)lOmin，然后加40 μ L終止劑(三氯乙酸和三氯化 鐵)終止反應(yīng)。取出樣品，SOOOXg離心5min，在562nm下用蛋白核酸定量測定儀比色測定 酶活。酶活力單位定義該酶在37°C時(shí)每分鐘催化底物生成lymol L-谷氨酸-γ-單羥 肟酸所需要的酶量。實(shí)施例1 將吸水鏈霉菌(Sti^ptomyceshygroscopicus)WSH03-13 以 10% 的接種量接菌 至發(fā)酵培養(yǎng)基中，300C，200r/min培養(yǎng)60h，發(fā)酵結(jié)束后測定谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活力為2. 5U/ mg0實(shí)施例2 (1)硫酸銨沉淀將吸水鏈霉菌Sti^ptomyces hygroscopicus發(fā)酵液離心去除菌體后，上清液中 加入硫酸銨粉末，至飽和度為50%，緩慢攪拌使其完全溶解。調(diào)節(jié)pH值，使酶液的pH保持 在7. 5，靜置半小時(shí)后IOOOOXg低溫離心lOmin，收集上清液繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度為 80%，4°C靜置數(shù)小時(shí)后，低溫離心收集蛋白沉淀。將沉淀溶解在20mmol/L Tris-HCl pH 7. 5的緩沖液中并且4°C透析數(shù)小時(shí)；(2)第一次離子交換層析將透析后的酶液加入到預(yù)先用20mmol/L Tris-HCl pH 7. 5的緩沖液平衡好的陰 離子交換柱Hitrap Q HP中。用含Ο-lmol/L氯化鈉的相同緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速 為lmL/min，檢測波長為280nm，收集有活性的部分。(3)凝膠過濾層析將收集到的全部活性部分用硫酸銨(飽和度80% )濃縮并用少量Tris-HCl pH7. 5緩沖液溶解，將濃縮后的酶液加入到預(yù)先用20mmol/L Tris-HCl pH 7. 5緩沖液平衡好 的Superdex 7510/300GL層析柱中，用含0. 15mol/L氯化鈉的相同緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為 0. 4mL/min，檢測波長為^Onm，收集有活性的部分；(4)第二次離子交換層析將收集到的活性部分經(jīng)20mmol/L Tris-HCl pH 8. 5的緩沖液透析后再次加入到 預(yù)先用20mmol/L Tris-HCl pH 8. 5緩沖液平衡好的Hitrap Q HP離子柱中，用含0-0. 4mol/ L氯化鈉的相同緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集洗脫時(shí)間22-27min的溶液，即為所制備的
新型谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶分離純化全過程的SDS-PAGE電泳圖見圖1。實(shí)施例3 =TGase B對(duì)酶原的活化作用將純化后的酶原Zhang D X，Wang M, Do G C, et al. J. Agric. Food Chem.，2008， 56(9) :3403-3408(0. 40mg/mL)和 TGase B(0. 45mg/mL)以 5 1 (ν/ν)的比例混合后，置 于37°C水浴鍋中培養(yǎng)，分別在不同時(shí)間點(diǎn)Oh，0. 5h，Ih，2h，4h，6h，他，IOh取樣，立即測酶活 (見圖2)，將各時(shí)間點(diǎn)的樣品走SDS-PAGE電泳(見圖3)。用20mmol/LpH 8. 5Tris_HCl緩 沖液以相同的比例分別稀釋純化后的酶原和TGase B，然后按上述相同的條件處理，作為對(duì) 照。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種新型谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，其特征是能夠?qū)⒐劝滨０忿D(zhuǎn)胺酶酶原活化為成熟酶。
2.權(quán)利要求1所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，其特征是從吸水鏈霉菌(Sti^ptomyces hygroscopicus)發(fā)酵液中純化得到。
3.權(quán)利要求2所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，其特征是純化步驟如下1)將吸水鏈霉菌(Sti^ptomyceshygroscopicus)WSH03-13去除菌體得到的上清液經(jīng) 過硫酸銨分級(jí)沉淀，收集的蛋白沉淀溶解后進(jìn)行透析；2)將透析后的酶液加入到用pH7. 5的Tris-HCl平衡好的陰離子交換柱Hitrap Q HP 中，用O-lmol/L氯化鈉線性梯度洗脫，收集活性部分；3)將收集的活性部分用硫酸銨濃縮，將濃縮后的酶液加入Superdex7510/300GL層析 柱中，用0. 15mol/L氯化鈉洗脫并收集活性部分；4)將收集到的活性部分加入到用pH8. 5的Tris-HCl平衡好的陰離子交換柱Hitrap Q HP中，用0-0. 4mol/L氯化鈉進(jìn)行線性梯度洗脫，收集洗脫時(shí)間22-27min的活性部分。
4.應(yīng)用權(quán)利要求1所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活化谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶及其應(yīng)用，屬于蛋白質(zhì)工程技術(shù)領(lǐng)域。通過對(duì)吸水鏈霉菌發(fā)酵液進(jìn)行純化得到了一種能夠活化谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的新型酶，該酶可用于將谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原直接轉(zhuǎn)化成活性酶，解決了酶原向酶轉(zhuǎn)化的問題，縮短了發(fā)酵時(shí)間，提高了發(fā)酵產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12N9/10GK102120989SQ20101058205
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者周哲敏, 楊曉燕 申請(qǐng)人:江南大學(xué)