專利名稱：一種分離馬鈴薯晚疫病菌的改進(jìn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于應(yīng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種分離馬鈴薯晚疫病菌的改進(jìn) 方法。
背景技術(shù)：
由晚疫病菌力ora i/7/^iaas)引起的馬鈴薯晚疫病是一種毀滅性病 害，在我國各地均有發(fā)生和流行，近年來晚疫病在世界各地再次大流行，引起了廣大植病工 作者的高度重視。在植物病害防治研究工作中常進(jìn)行的病原菌致病性測定、交配型測定、抗 藥性監(jiān)測、生理小種鑒定、室內(nèi)藥劑篩選、病原菌群體遺傳變異分析、無毒基因多態(tài)性分析 以及抗病育種等都需要用到病原菌菌種，因此病原菌的分離培養(yǎng)是這些研究工作的基礎(chǔ)。 但是由于采集的晚疫病病樣難以保存，并且晚疫病菌是一種寄生性很強(qiáng)的卵菌，在人工培 養(yǎng)基上生長緩慢，很容易被其它真菌或細(xì)菌的生長所抑制，因此，其分離培養(yǎng)十分困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種分離馬鈴薯晚疫病菌的改進(jìn)方法，該方法對馬鈴薯晚 疫病菌分離成功率達(dá)到98%，可有效地分離出晚疫病菌純菌種。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種分離馬鈴薯晚疫病菌的改進(jìn)方法包括以下步 驟
1、選擇性培養(yǎng)基的制備取50g黑麥種子在適量去離子水中浸泡2Γ36h，搗碎機(jī)搗 碎，55飛0°C水浴廣2 h，經(jīng)四層紗布過濾去渣，過濾液補(bǔ)水至1L，加入瓊脂粉15g，121°C高 壓蒸汽滅菌，即為黑麥培養(yǎng)基。待黑麥培養(yǎng)基冷卻至50°C左右，加入利福平15-20mg/L、氨 卞青霉素4(T60mg/L，混勻，倒平板即為選擇性培養(yǎng)基；
2、樣品采集采集病葉或病薯，裝入一次塑料手套或自封袋中，每個(gè)采集袋只裝一個(gè)病 組織，袋口密封好，置于冰盒或冰瓶內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室或用健康感病薯塊夾病葉帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn) 行分離；
3、薯片夾心分離法將健康感病薯塊清洗干凈并晾干，浸入75%酒精3 5秒，取出燒 干，切成厚4飛mm的薯片，剪取采集的病組織一小塊置于兩薯片中間，放置于已消毒的空培 養(yǎng)皿里，16 20°C、12 h光照/12 h黑暗循環(huán)培養(yǎng)，待在薯片上長出霉層，直接挑取霉層置于 選擇性培養(yǎng)基上；
4、菌種的純化將分離出的晚疫病菌落邊緣單菌絲尖端連同培養(yǎng)基一起切下，置于不 加抗生素的黑麥培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明方法適用于馬鈴薯晚疫病菌高效的分離和鑒定，對于農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)領(lǐng)域中馬鈴薯晚疫病的防治具有重要的實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下 的技術(shù)優(yōu)勢和積極效果
1、分離效率高本發(fā)明方法已經(jīng)對源于中國福建、黑龍江、河北、內(nèi)蒙古、云南、甘肅、吉 林七省(區(qū))馬鈴薯晚疫病病葉或病薯進(jìn)行分離，成功率達(dá)到98%，因此分離效率高具有充分的保證；
2、適用性好直接分離法要求病標(biāo)樣必須新鮮，并且是在田間濕度很大的情況上采集 到的，因?yàn)檫@樣才能長出霉層，一般要求是發(fā)病前期的病葉或病薯，并且能當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室 進(jìn)行分離，發(fā)病后期的病組織容易腐生其它雜菌，采用該方法分離的成功率幾乎為零；保濕 分離法要求所采集的病標(biāo)樣最好是發(fā)病早期或是中期的，發(fā)病后期的病樣用此方法分離的 成功率較低；而薯片夾心分離法分離的成功率最高，不管是什么樣的病標(biāo)樣(發(fā)病后期、不 新鮮的標(biāo)本或比較遠(yuǎn)的地區(qū)所采集的標(biāo)本)，采用此方法均能分離到病原菌；
3、成本降低與前人報(bào)道的薯片夾葉分離法相比，選擇性培養(yǎng)基中所加的抗生素種 類減少(由氨卞青霉素200mg/L、利福平20mg/L和五氯硝基苯67mg/L減為氨卞青霉素 4(T60mg/L和利福平15 20mg/L)，由于從感病薯塊侵染出的晚疫病菌雜菌較少，因此選擇 性培養(yǎng)基中所加的抗生素種類可相應(yīng)減少，所加的量也可相應(yīng)降低；此外，薯塊下方由前人 報(bào)道的濾紙保濕改為不需要濾紙保濕，也降低了成本。


圖1馬鈴薯晚疫病病葉癥狀； 圖2薯片夾心分離方法；
圖3分離純化的馬鈴薯晚疫病菌； 圖4馬鈴薯晚疫病菌產(chǎn)生的孢子囊。具體實(shí)施例為了更充分地公開本發(fā)明的一種分離馬鈴薯晚疫病菌的改進(jìn)方法， 下面結(jié)合實(shí)例加以說明。、黑麥培養(yǎng)基的制備將黑麥50g加適量去離子水浸泡36 h，勻漿機(jī)搗碎，60°C水 浴2 h，四層紗布過濾，上清液補(bǔ)水至1L，加入瓊脂15 g，121°C高壓蒸汽滅菌20 min。選擇性培養(yǎng)基的制備在冷卻至50°C左右的黑麥培養(yǎng)基中加入氨卞青霉素 4(T60mg/L、利福平15 20mg/L，利福平用二甲基亞砜或95%已醇溶解；
2、樣品采集采集福建、黑龍江、河北、內(nèi)蒙古、云南、甘肅、吉林七省(區(qū))馬鈴薯晚疫病 病葉或病薯，對于晚疫病發(fā)病早中期、新鮮或比較近地區(qū)采集的病標(biāo)樣可裝入一次塑料手 套，每只手套只裝一個(gè)病組織，密封好，置于冰盒或冰瓶內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離；而對于發(fā) 病后期、不新鮮或比較遠(yuǎn)的地區(qū)所采集的標(biāo)樣，用健康感病薯塊(費(fèi)爾瑞它)夾病葉帶回實(shí) 驗(yàn)室進(jìn)行分離；
3、薯片夾心分離法將健康感病薯塊(費(fèi)爾瑞它)清洗干凈并晾干，浸入75%酒精3飛 秒，取出燒干，切成厚4飛mm的薯片，剪取采集的病組織一小塊置于兩薯片中間，放置于已 消毒的空培養(yǎng)皿里，16 20°C、12h光照/12h黑暗循環(huán)培養(yǎng)，待在薯片上長出霉層，直接挑取 霉層置于選擇性培養(yǎng)基上；
4、菌種的純化將分離出的晚疫病菌落邊緣單菌絲尖端連同培養(yǎng)基一起切下，置于不 加抗生素的黑麥培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。采用本發(fā)明的改進(jìn)方法，均能從采自福建、黑龍江、河北、內(nèi)蒙古、云南、甘肅、吉林 七省(區(qū))馬鈴薯晚疫病病葉或病薯中分離出晚疫病菌株，因此本方法是有效分離晚疫病菌 的優(yōu)良方法。實(shí)施例11、選擇性培養(yǎng)基的制備取50g黑麥種子在適量去離子水中浸泡24h，搗碎機(jī)搗碎， 60°C水浴lh，經(jīng)四層紗布過濾去渣，過濾液補(bǔ)水至1L，加入瓊脂粉15g，121°C高壓蒸汽滅 菌，即為黑麥培養(yǎng)基。待黑麥培養(yǎng)基冷卻至50°C左右，加入利福平20mg/L、氨卞青霉素 50mg/L，混勻，倒平板即為選擇性培養(yǎng)基；
2、樣品采集采集病葉或病薯，裝入一次塑料手套或自封袋中，每個(gè)采集袋只裝一個(gè)病 組織，袋口密封好，置于冰盒或冰瓶內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室或用健康感病薯塊夾病葉帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn) 行分離；
3、薯片夾心分離法將健康感病薯塊清洗干凈并晾干，浸入75%酒精3秒，取出燒干， 切成厚5mm的薯片，剪取采集的病組織一小塊置于兩薯片中間，放置于已消毒的空培養(yǎng)皿 里，18°C、12 h光照/12 h黑暗循環(huán)培養(yǎng)，待在薯片上長出霉層，直接挑取霉層置于選擇性培
養(yǎng)基上；
4、菌種的純化將分離出的晚疫病菌落邊緣單菌絲尖端連同培養(yǎng)基一起切下，置于不 加抗生素的黑麥培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。實(shí)施例2
1、選擇性培養(yǎng)基的制備取50g黑麥種子在適量去離子水中浸泡36h，搗碎機(jī)搗碎， 55°C水浴2 h，經(jīng)四層紗布過濾去渣，過濾液補(bǔ)水至1L，加入瓊脂粉15g，121°C高壓蒸汽 滅菌，即為黑麥培養(yǎng)基。待黑麥培養(yǎng)基冷卻至50°C左右，加入利福平15mg/L、氨卞青霉素 60mg/L，混勻，倒平板即為選擇性培養(yǎng)基；
2、樣品采集采集病葉或病薯，裝入一次塑料手套或自封袋中，每個(gè)采集袋只裝一個(gè)病 組織，袋口密封好，置于冰盒或冰瓶內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室或用健康感病薯塊夾病葉帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn) 行分離；
3、薯片夾心分離法將健康感病薯塊清洗干凈并晾干，浸入75%酒精5秒，取出燒干， 切成厚4飛mm的薯片，剪取采集的病組織一小塊置于兩薯片中間，放置于已消毒的空培養(yǎng) 皿里，16°C、12 h光照/12 h黑暗循環(huán)培養(yǎng)，待在薯片上長出霉層，直接挑取霉層置于選擇性
培養(yǎng)基上；
4、菌種的純化將分離出的晚疫病菌落邊緣單菌絲尖端連同培養(yǎng)基一起切下，置于不 加抗生素的黑麥培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。實(shí)施例3
1、選擇性培養(yǎng)基的制備取50g黑麥種子在適量去離子水中浸泡30h，搗碎機(jī)搗碎， 58°C水浴1. 5h，經(jīng)四層紗布過濾去渣，過濾液補(bǔ)水至1L，加入瓊脂粉15g，121°C高壓蒸汽 滅菌，即為黑麥培養(yǎng)基。待黑麥培養(yǎng)基冷卻至50°C左右，加入利福平18mg/L、氨卞青霉素 40mg/L，混勻，倒平板即為選擇性培養(yǎng)基；
2、樣品采集采集病葉或病薯，裝入一次塑料手套或自封袋中，每個(gè)采集袋只裝一個(gè)病 組織，袋口密封好，置于冰盒或冰瓶內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室或用健康感病薯塊夾病葉帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn) 行分離；
3、薯片夾心分離法將健康感病薯塊清洗干凈并晾干，浸入75%酒精4秒，取出燒干， 切成厚4飛mm的薯片，剪取采集的病組織一小塊置于兩薯片中間，放置于已消毒的空培養(yǎng) 皿里，20°C、12 h光照/12 h黑暗培養(yǎng)，待在薯片上長出霉層，直接挑取霉層置于選擇性培養(yǎng) 基上；4、菌種的純化將分離出的晚疫病菌落邊緣單菌絲尖端連同培養(yǎng)基一起切下，置于不 加抗生素的黑麥培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
一種分離馬鈴薯晚疫病菌的改進(jìn)方法，包括選擇性培養(yǎng)基的制備、樣品采集、薯片夾心分離法、菌種的純化四個(gè)步驟，其特征在于1)、選擇性培養(yǎng)基的制備在黑麥培養(yǎng)基中加入利福平，加入量為15 20mg/L，氨卞青霉素，加入量為40~60mg/L，混勻，倒平板即為選擇性培養(yǎng)基；2)、樣品采集對于晚疫病發(fā)病早中期、新鮮或比較近地區(qū)采集的病標(biāo)樣可裝入一次塑料手套或自封袋中，每只采集袋只裝一個(gè)病組織，袋口密封好，置于冰盒或冰瓶內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離，而對于發(fā)病后期、不新鮮或比較遠(yuǎn)的地區(qū)所采集的標(biāo)樣，用健康感病薯塊夾病葉帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離；3)、薯片夾心分離法將健康感病薯塊清洗干凈并晾干，浸入75％酒精3~5秒，取出燒干，切成厚4~6mm的薯片，剪取采集的病組織一小塊置于兩薯片中間，放置于已消毒的空培養(yǎng)皿里，16~20℃、12h光照/12h黑暗循環(huán)培養(yǎng)，待在薯片上長出霉層，直接挑取霉層置于選擇性培養(yǎng)基上；4)、菌種的純化將分離出的晚疫病菌落邊緣單菌絲尖端連同培養(yǎng)基一起切下，置于不加抗生素的黑麥培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，即可獲得純培養(yǎng)物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分離馬鈴薯晚疫病菌的改進(jìn)方法，該方法包括選擇性培養(yǎng)基的制備、樣品采集、薯片夾心分離法、菌種的純化四個(gè)步驟，本發(fā)明方法與一般方法相比，具有分離效率高、適用性好、成本降低等優(yōu)點(diǎn)，是有效分離馬鈴薯晚疫病菌的優(yōu)良方法。
文檔編號(hào)C12N1/14GK101985603SQ20101058254
公開日2011年3月16日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者蘭成忠, 李本金, 翁啟勇, 陳慶河, 陳昌盛 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所