專利名稱：植物病原菌誘導(dǎo)型乙烯響應(yīng)因子基因啟動子序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是用分子生物學(xué)技術(shù)獲得一種新的植物病原菌誘導(dǎo)表達(dá)的啟動子序列及 其在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物的生長發(fā)育和生命周期是不同的基因在時間和空間上有序表達(dá)的結(jié)果。高等 植物基因表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，受多種順式作用元件和反式作用因子的相互作 用。植物起始啟動子是RNA聚合酶識別并與之結(jié)合，從而起始基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，通 常位于基因上游，包括CAAT box和TATA box,分別依賴DNA的RNA聚合酶的識別和結(jié)合位 點。從轉(zhuǎn)錄起始點到CAAT box附近的這一段區(qū)域通常稱為基礎(chǔ)啟動子。在啟動子上游的 5/遠(yuǎn)上游區(qū)有增強(qiáng)或阻遏基因表達(dá)的序列和對激素或外界脅迫有應(yīng)答作用的序列，這些序 列決定了基因在特定時空條件下表達(dá)，統(tǒng)稱為順式作用元件，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是通過其與轉(zhuǎn)錄因 子之間的相互作用來實現(xiàn)的。根據(jù)啟動子的作用方式及其功能，可將其分為3類組成型啟動子，即基因的表達(dá) 不受時空限制和某種物質(zhì)的誘導(dǎo)而在植物中表達(dá)出來、組織特異性啟動子，即其基因的表 達(dá)分布在植物的某個組織或器官中和誘導(dǎo)性啟動子。誘導(dǎo)性啟動子是在某些特定的物理或 化學(xué)信號的刺激下，可以大幅度提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平。與組成型啟動子相比，它具有獨 特的優(yōu)點它可根據(jù)需要在植物特定的發(fā)育階段、組織器官或生長環(huán)境下，讓其接受誘導(dǎo)信 號當(dāng)植物處在脅迫條件下，外源基因才高效表達(dá)，而在正常條件下，外源基因表達(dá)很弱或 根本不表達(dá)，這樣有利于轉(zhuǎn)基因植物的生長，又可以提高植物的抗逆性。一般而言，誘導(dǎo)性 啟動子的活性受物理、化學(xué)及逆境脅迫等信號的誘導(dǎo)，啟動子區(qū)包含光、ABA、熱、干旱、鹽、 低溫、病原菌等響應(yīng)元件。當(dāng)植物受到真菌、細(xì)菌、病毒等病原微生物侵染時，植物體內(nèi)相關(guān) 保護(hù)蛋白基因被激活，從而消除有害代謝產(chǎn)物對植物自身的傷害，調(diào)控這類保護(hù)蛋白基因 表達(dá)的啟動子即生物脅迫誘導(dǎo)性啟動子。誘導(dǎo)性啟動子在轉(zhuǎn)錄水平上參與調(diào)控下游相應(yīng)基 因的表達(dá)，從而使植物能夠抵御外界環(huán)境脅迫，因此，對植物啟動子的研究有助于了解基因 轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)模式及其調(diào)控機(jī)制，并應(yīng)用于基因工程中提高或改進(jìn)外源目的基因的表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決目前分子抗病育種過程中，因使用組成型啟動子，使得外源 基因持續(xù)表達(dá)，而破壞了植物的新陳代謝，阻礙植物的正常生長發(fā)育問題，提供一種新的植 物病原菌誘導(dǎo)型啟動子序列及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種新的植物病原菌誘導(dǎo)的乙烯響應(yīng)因子基因(VpERF4)啟動子， 其啟動子核苷酸全長序列為158;3bp ；同時提供了植物病原菌誘導(dǎo)型啟動子的應(yīng)用，即利用 獲得的病原菌誘導(dǎo)型啟動子，構(gòu)建獲得“啟動子-目的基因”的載體，將其瞬時轉(zhuǎn)化植物，病 原菌誘導(dǎo)可以激活下游目的基因的表達(dá)，其目的基因是提高植物抗病性的基因。本發(fā)明利用誘導(dǎo)性啟動子代替組成型啟動子，可以獲得病原菌誘導(dǎo)的特異表達(dá)的啟動子；利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將其導(dǎo)入到植物基因組中，可以實現(xiàn)對目的基因的定向操作，獲 得病原菌誘導(dǎo)表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植株；這不僅可以實現(xiàn)目的基因在特定逆境情況下的 表達(dá)，而且為植物抗病基因的應(yīng)用提供強(qiáng)有力的工具。


附圖1是本發(fā)明中國野生華東葡萄株系“白河-35_l”VpERF4基因的表達(dá)方式圖， 描述中國野生華東葡萄株系“白河-35-1，，在接種葡萄白粉菌0，6，12，24，48，72，96小時， VpERF4基因的表達(dá)方式，采用半定量PCR的方法，葡萄Actin基因作為內(nèi)參。附圖2是本發(fā)明煙草葉片的GUS染色圖，描述煙草赤星病病原菌孢子接種兩天后， VpERF4啟動子-GUS瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片的GUS染色結(jié)果，對照噴施清水，瞬時轉(zhuǎn)染噴施煙草 赤星病病原菌孢子。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述實施例一中國野生華東葡萄‘白河-35-1’在葡萄白粉病誘導(dǎo)下VpERF4基因的 表達(dá)及VpERF4基因啟動子的克隆a.葡萄白粉病誘導(dǎo)材料的處理葡萄白粉病壓片法接種中國野生華東葡萄‘白河-35-1’葉片，接種后于0，6，12， 24,48,72,96,120h剪取葉片，立刻放入液氮中，于_80°C保存?zhèn)溆?；b.中國野生華東葡萄葉片總RNA的提取參照張今今等2003《果樹學(xué)報》“葡萄總RNA提取方法研究”所提出的改進(jìn)的SDS/ 酚法，提取中國野生華東葡萄葉片的總RNA ；c.半定量 RT-PCR，c. 1所用引物如下目的基因 VpERF4 上游引物5，-GGACTAAAATCACTTGCCCCATCT-3，下游引物5，-TCTTTGCTCCCTGCTCTCCCCATC-3，內(nèi)參基因 Actin:上游引物5，-TCCTGTGGACAATGGATGGA-3，下游引物5，-CTTGCATCCCTCAGCACCTT-3，
c. 2半定量RT-PCR試驗流程，c. 2. 1對提取的總RNA進(jìn)行DNAase消化，去除含有的基因組DNA，電泳檢測確保 RNA樣品中DNA已去除干凈，c. 2. 2取1 μ gRNA,采用Promega公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，c. 2. 3將反轉(zhuǎn)錄20 μ 1產(chǎn)物稀釋5倍，取1 μ 1作為模板，按如下反應(yīng)體系和程序進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，PCR體系cDNA模板1 μ 1，上游弓丨物1 μ 1，下游弓丨物1 μ l，2XTaq Plus PCRMasterMix 10 μ 1, DD-H2O 7 μ 1，總計 20 μ 1，PCR 反應(yīng)程序94°C變性:3min ；94°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 30s，27 個循 環(huán)；72°C 10min，4°C保溫，c. 3半定量PCR結(jié)果，中國野生華東葡萄VpERF4基因未接種葡萄白粉菌時，表達(dá)量比較低，或基本上不表達(dá)，接種后，表達(dá)量升高，12小時達(dá)到最高峰，而后降低，96小時恢復(fù) 至未接種狀態(tài)，c. 4PCR擴(kuò)增目的片段根據(jù)已知的中國野生華東葡萄VpERF4基因和葡萄基因組 序列設(shè)計啟動子特異引物，其上游引物中引入BamH I酶切位點，下游引物中引入Nco I酶 切位點上游引物5，-GGGGGATCCAACATCTGCGTCATGCCA-3，下游引物5，-GGGCCATGGGGCCTGTTGTTCTTCTCC-3，PCR反應(yīng)體系DNA模板1 μ 1，上游引物1 μ 1，下游引物1 μ 1，10XLA PCRBuffer (Mg2+) 2. 5 μ 1, Takara LA Taq 0· 25 μ 1，Dntp Mixture 4 μ 1，DD_H2015. 25 μ 1，總 計 25 μ 1，PCR 反應(yīng)程序94°C 變性 5min ；94°C 變性 30s，60°C 退火 30s，72°C 延伸 循環(huán)，72°C 10min，4°C保溫，取反應(yīng)產(chǎn)物10 μ 1用1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果，c. 5目的DNA片段的回收和克隆，c. 5. 1目的基因DNA片段的回收目的基因DNA片段從瓊脂糖凝膠上的回收用天 根生化科技有限公司普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行，c. 5. 2回收片段與克隆載體pGEM-T-easy的連接反應(yīng)連接反應(yīng)按照Promega公 司pGEM-T-easy載體試劑盒說明進(jìn)行操作，連接反應(yīng)體系2XRapid Ligation Buffer 2· 5 μ 1，pGEM-T-easy Vector 0· 5 μ 1，回收 DNA 片段 1· 5 μ 1，T4DNA Ligase 0. 5 μ 1，總計 5 μ 1，混勻反應(yīng)物，短暫離心，4°C，12小時，c. 6轉(zhuǎn)化和陽性克隆的鑒定用于轉(zhuǎn)化的大腸桿菌為天根生化科技有限公司，型 號CB104-01的ToplO菌株，連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化在無菌條件下操作，挑取轉(zhuǎn)化平板上的白色菌 落于LB液體培養(yǎng)，采用天根生化科技有限公司的離心柱型高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì) 粒作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)生1583bp的VpERF4基因的啟動子， 即為含有VpERF4基因啟動子的陽性克隆，c. 7測序驗證經(jīng)過鑒定的陽性克隆，進(jìn)行DNA測序，其啟動子核酸序列為158;3bp。實施例二 “VpERF4啟動子-GUS”植物表達(dá)載體構(gòu)建及瞬時轉(zhuǎn)化煙草，病原菌誘導(dǎo) 特異表達(dá)，a.酶切載體質(zhì)粒pCAMBIA1301和含有VpERF4啟動子的T載體質(zhì)粒，回收相應(yīng)的 DNA片段，b.將上述兩片段在連接酶催化下于16°C，連接12小時，連接體系T4 DNALigase 2. 5 μ 1，T4DNA Ligase Buffer 0. 5 μ l，pCAMBIA1301 載體回收片段 1. 5μ l,VpERF4 啟動子 回收片0. 5μ 1，總計5μ 1 ；c.轉(zhuǎn)化和陽性克隆的鑒定，用于轉(zhuǎn)化的大腸桿菌為天根生化科技有限公司，型號CB104_01的ToplO菌株，感 受態(tài)細(xì)胞的制備和連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化均在無菌條件下操作，挑取轉(zhuǎn)化平板上的白色菌落于LB 液體培養(yǎng)，采用天根生化科技有限公司的離心柱型高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒作為模 板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測陽性克??；d.將從陽性克隆中提取的質(zhì)粒，采用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化GV3101，獲得工程化農(nóng)桿菌，用于植物的瞬時轉(zhuǎn)化；e.挑取含有VpERF4啟動子的工程菌單菌落于液體LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)12小時， 用MES溶液重懸，調(diào)整OD值為0. 3，用Iml的無針頭的注射器將菌液注入生長4周后的煙 草葉片中，用塑料薄膜覆蓋保濕，附MES溶液成分5mg L—1葡萄糖，500mM MES, pH5. 5,20mM MgS04, IOOuM 乙酰丁香酮；f.瞬轉(zhuǎn)一天后，用濃度為IX IO5個/毫升的煙草赤星病孢子液噴施轉(zhuǎn)染葉片表 面，28°C培養(yǎng)；g.接種煙草赤星病兩天后利用組織化學(xué)染色法檢測轉(zhuǎn)基因煙草葉片中GUS報告 基因的表達(dá)，瞬轉(zhuǎn)葉片于X-GLUC溶液中抽真空15分鐘，37°C放置12小時，而后75%的酒精 脫色，染色結(jié)果噴施清水的瞬轉(zhuǎn)煙草葉片，染色后呈白色，GUS基因未表達(dá)，而噴施煙草黑 星病菌孢子的瞬轉(zhuǎn)葉片呈現(xiàn)藍(lán)色，煙草赤星病誘導(dǎo)了 GUS基因的表達(dá)。
權(quán)利要求
1.植物病原菌誘導(dǎo)型乙烯響應(yīng)因子基因啟動子序列，其特征是啟動子核苷酸全長序列 為 1583bp。
2.如權(quán)利要求1所述的植物病原菌誘導(dǎo)型乙烯響應(yīng)因子基因啟動子序列，其特征在 于病原菌誘導(dǎo)型乙烯響應(yīng)因子基因啟動子核苷酸全長序列1583bp 5 ‘ AACATCTGCG ‘TCATGCCACCCGGAAATCCAACCACCTTTATCACCTCTTTGTATATATCTCTTTGTTGCCTTGTTTTTAGTCACCGGGATGACGTGACCCAAGCCTAAGTGTGTTTGCTATAATTTGCCATCGTATTCGGCCTAAATTGCAGAATTACCCTTCATCAAACAAATTTATTAAGAATTTGCTTTTGTTATTATTTATTTTTTGTACTTTAAAATAGAAAGGAAATTCAAATGCGTTTATGTTAAAATCGGGTTTTATTTTATTTATCTCTTTAATCCCCTTTTGTACTCCATTTAATTTAAAAATATTAAATTTATTGTCATATGTATTTATAATAACCCCTTTTGAATTTCTCATCATCAAGCTTGTGAAAAGATAAAAAAAAGTCTTGTGCCCCAATTGTGCCCAAGCCCATTTGAGAGGGAATTTAAGTGGTTTGAGTCGAAACCCCTCAATGCACGACATGTCCATATATGCATTTTGCGTAAGGTTTTTAATTGCTGAATTTAAAGATAGGTCGTCAACCCCTTTCTACGCCGAGTTTGATTATTGAAAAGGACAAATCTATTTTAGTCATATTGCTATCATGCCTCAACCAAATCCAHGGTTCCTTTTTTTGGTTATTTGTTTTGGGATTCGTCAATTCTAGTTTTAGTCTTATTCTTTGAGACCTATTTTTTTAACAATATATATAACCCTTACCTAGTATAAGATTATCTATGCATAAAGACTTTTGTTAAAAGAATTTTTTCAACCTTTAGATGAAGCTTAGTTCATTCTACGGATCTTTCACTAAAGTCTAGCAAACTCTATGAGTTTATTACAAAAGCATTGAAAGTAAATATATATAAAATGAATGGTATTTACTTTAATGACATAATGAACACATGTCTTCACGGTAATTCTAGAGCTTTTATGACATATTTACTAAGGCTTTTTTTAAAAAAAAAAAACCAAATGAAAAAAAAAGAA0CCATAACAATAATGAAAATAAAAGGAAATGAAAAATAGAGTTGAGAATCTTTCGAAGTATTCGAAAACCCAATACTACGGCAGATGCAAATAAGAATATTTTCAACATTTTATAGGGCAGGTAACTTGTCGGAGTTAATTAAACCCAATATCTACGGTGGAAGAAAGAAGCAAACAAATAATAAGCCAAGTGCGCAGGGGCGTGAGGACAATGACCCACATGGAAACTCACTGCCGTTAAACAAATAAATTAATCTTTTTAGGCATTTCCCAACCTAAGATATGCGGATAAGCAGATCTTTATGCATTAGAGTACCAAAATTATGTATATGGGCCCTTTTATATGATGTTTGGTAGTGCAATGGTGTAATATGATGGAAAAGCAAGGGCAAAGCTTTTGATAAATGAGTAGAAAACACATGCCCCTGCCCCCACGATTTTTCACACTTTCCTATTTCCCCCATGACTTCTCCACAAGTCCACATATGCCAAAGTTAAATACTAGGATAGAACCACCCATCACAAACTTCTAAGCTTCATAATCACAAGGCTCAGCGTCCTCAGAGAGGAGAAGAAGAAGAAGAAGGAGA AGAACAACAG GCC
3.如權(quán)利要求1所述的植物病原菌誘導(dǎo)型乙烯響應(yīng)因子基因啟動子應(yīng)用，其特征在 于利用獲得的病原菌誘導(dǎo)型啟動子，構(gòu)建獲得“啟動子-目的基因”的載體，將其瞬時轉(zhuǎn)化 植物，病原菌誘導(dǎo)可以激活下游目的基因的表達(dá)，其目的基因是提高植物抗病性的基因。
4.如權(quán)利要求3所述植物病原菌誘導(dǎo)型乙烯響應(yīng)因子基因啟動子應(yīng)用，其特征在于， 利用該啟動子構(gòu)建獲得“VpERF4的啟動子-GUS”載體，瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片，接種煙草赤星 病，該啟動子能夠驅(qū)動GUS報告基因的特異表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種植物病原菌誘導(dǎo)型乙烯響應(yīng)因子基因啟動子序列，其核酸全長序列為1583bp，將其瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片，煙草赤星病誘導(dǎo)可以激活GUS基因的表達(dá)。應(yīng)用本發(fā)明的啟動子，構(gòu)建獲得“啟動子-目的基因”載體，利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將其導(dǎo)入到植物中，可以實現(xiàn)對目的基因的定向操作，獲得病原菌誘導(dǎo)表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植株；這不僅可以實現(xiàn)目的基因在特定逆境情況下的表達(dá)，而且為植物抗病基因的應(yīng)用提供強(qiáng)有力的工具。
文檔編號C12N15/82GK102121006SQ20101058258
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者朱自果, 李慧娥, 王躍進(jìn) 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)