專利名稱：藍耳病rt-lamp檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種藍耳病RT-LAMP檢測方法及檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
豬藍耳病主要是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus, PRRSV)感染引起的疾病，1990 1991年藍耳病在歐洲爆發(fā)，引起超過100萬頭豬死亡，1991年荷蘭人ffenswort等首次從病豬體內(nèi)分離出該病毒。 藍耳病豬死亡率一般為50%，甚至90% 95%，主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)和木乃伊胎，而仔豬主要有咳嗽、呼吸困難等癥狀。藍耳病是OIE規(guī)定的B類動物傳染病，集約化養(yǎng)殖場一旦感染，難以凈化，自美國1987年首次報道以來，藍耳病已蔓延到全球，每年都造成巨大的經(jīng)濟損失，對世界各國的養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成了嚴重的威脅，快速、特異、敏感的檢測PRRSV 對養(yǎng)豬業(yè)有效控制PRRSV具著重要的意義。國內(nèi)外學者已經(jīng)建立了多種檢測藍耳病的方法。間接免疫熒光試驗、免疫過氧化物酶單層試驗等免疫學檢測方法，檢疫周期長、操作繁瑣、確診困難，因而不利于準確、 快速、高效的監(jiān)控PRRSV的疫情。隨著現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展，已有多種分子診斷技術(shù)應用于藍耳病的檢測，如RT - PCR、基因芯片技術(shù)、核酸序列依賴性擴增(NASBA )、實時熒光 RT-PCR、錯配擴增突變試驗(MAMA)等，但這些方法均需要昂貴的專用儀器和試劑，不適合在基層實驗室推廣應用，而新型核酸擴增技術(shù)——環(huán)介導等溫擴增(LAMP)與其它檢測方法相比，具有簡便、快速、特異等優(yōu)勢，不需PCR儀，在水浴鍋中即可完成擴增，特別適合于基層實驗室推廣使用。目前來說還沒有建立了一種方便在野外及基層實驗室進行藍耳病檢測的簡便、快速、特異的RT-PCR檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種簡便、快速、特異的藍耳病RT-PCR檢測方法及檢測試劑盒。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明涉及的藍耳病RT-LAMP檢測方法，包括以下步驟
A 取待檢樣品提取核酸，進行反轉(zhuǎn)錄以得到cDNA ；
B 以所述cDNA為模板，用外引物(B3、F3)和內(nèi)引物(FIP、BIP)在反應體系中進行恒溫擴增；所述外引物(B3、F3)和內(nèi)引物(FIP、BIP)的序列分別如下 B3 5' -ATGCTGAGGGTGATGCTGT-3‘ F3 5' -CATTTCCCTCTAGCGACTGA-3‘
FIP :5’ -GCCCTGATTGAAGGCAGTCTGGACTTTACCCCTAGTGAGCGG-3’ BIP :5’ -ACCCTGTCAGATTCAGGGAGGATCAGACGCACAGTATGTTGC-3’ ； C 在擴增產(chǎn)物中加入顯色劑根據(jù)顏色變化來判定結(jié)果；或者取擴增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測方法來判定結(jié)果。
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經(jīng)過優(yōu)化設計，所述反應體系中的外引物(B3、F3)的濃度均為ΙΟμΜ，內(nèi)引物(FIP、 BIP)的濃度均為80μΜ。經(jīng)過優(yōu)化設計，在步驟B中恒溫擴增的反應條件為63°C lh，82°C終止反應。在步驟C結(jié)果判定步驟中加入的顯色劑為STOR Green I，判定方法為反應結(jié)束后，分別在各反應管中加入2 μ L 3 μ L SYBR Green I，混勻后觀察顏色變化，當陽性對照管顯示淡綠色，陰性對照管顯示淡橘紅色時，顯示淡綠色的管判為陽性，顯示淡橘紅色的管判為陰性。本發(fā)明所涉及的檢測試劑盒中RT-LAMP反應體系為10 X ThermoPol Buffer 2. 5μ1, Bst DNA聚合酶1. Ομ ，ΙΟμΜ的外引物Β3 μ ，ΙΟμΜ的外引物F3 μ1，80μΜ的內(nèi)引物 BIP μ1,80μΜ 的內(nèi)引物 FIP μ ，15ngAU 的 cDNA μ ，5M 的 Betaine 5Pl，DEPC 水補至25μ ；其中該反應體系中還含有Mg2+ 3 15mM，dNTP 0. 2 1. 2mM。所述反應體系中Mg2+和dNTP的具體優(yōu)選濃度分別為7. 5mM、0. 4mM。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明針對N基因的6個區(qū)域設計2對特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(即Bst DNA polymerase)在等溫條件(63°C左右)保溫lh，即可完成核酸擴增反應，從核酸提取開始，整個實驗僅需2.證。相比其他PCR檢測方法，本方法不需要模板的熱變性、長時間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程，因此不需要復雜儀器，僅用一臺普通恒溫水浴鍋，反應結(jié)束后，通過肉眼觀察就能快速、簡便、高效、高特異性、高敏感性地檢測藍耳病病毒，為野外、現(xiàn)場和基層部門藍耳病的檢測提供了一種快速、簡便、敏感性高、特異好的新方法。


圖1是不同dNTP濃度RT-LAMP電泳其中 M:50bp lader marker ；1 6 :0. 2 mM、0. 4 mM、0. 6 mM、0. 8 mM、l. 0 mM、l. 2 mM ； 7 空白對照；
圖2是不同Mg2+濃度RT-LAMP電泳其中M:50bp lader marker ;1 10:3 mM>4. 5 mM、6 mM>7. 5 mM、9 mM>10. 5 mM、12 mM、 13. 5 mM、15mM ；
圖3是不同溫度RT-LAMP電泳其中 M:50bp lader marker ； 1 10 泳道59°C、60°C、61°C、62°C、63°C、64°C、65°C、 66°C、67°C、68°C ；
圖4是不同反應時間RT-LAMP電泳其中 M:50bp lader marker ； 1 10 泳道5min、10min、20min、30min、40min、50min、 60min、70min、80min、90min ；
圖5是PRRSV RT-LAMP特異性顯色劑試驗結(jié)果；
其中 ASIV ；B:PRV ；C:TGEV ；D:PCV2 ；Ε:FMDV ；F:PRRSV VR ；GPRRSV LV ；H:HP -PRRSV ； 圖6是PRRSV RT-LAMP特異性電泳試驗結(jié)果；
其中M:50bp ladder marker ；1: SIV ；2: PRV ；3: TGEV ；4: PCV2 ；5:FMDV ；6:PRRSV VR ； 7: PRRSV LV ；8: HP -PRRSV ；
圖7是PRRSV RT-LAMP敏感性試驗；其中 M:50bp ladder marker ；1 9 泳道100 10-8 倍稀釋的 PRRSV RNA ； 圖8是PRRSV RT-PCR敏感性試驗；
其中 M:DNA marker DL-2000 ；1 9 泳道100 10-8 倍稀釋的 PRRSV RNA。
具體實施例方式下面就對本發(fā)明的具體構(gòu)建步驟作進一步詳細闡述，主要包括以下幾個步驟
1、RT-LAMP弓丨物的設計及合成
引物設計是建立LAMP方法的核心，它與PCR引物有一定相似性，如引物GC最適含量為40% 60%，以及盡量避免在3’端形成互補的發(fā)卡結(jié)構(gòu)等要求，但也存在差異，LAMP弓丨物設計時要遵循以下幾點原則F2引物的5’端到B2引物的5’端的距離，最好控制在120到 180bp，F(xiàn)2引物和F3引物之間以及B2引物與B3引物之間的距離應該在20bp以內(nèi)；引物的 Tm值正常情況或者富含GC區(qū)域為60到65°C，富含AT區(qū)域為55到60°C，同時引物Tm值應滿足 F3/B3<F2/B2<F1/B1，F(xiàn)2>60°C，B2<65°C ；Flc 和 Blc 引物 5，端以及 F2/B2，F(xiàn)3/B3 引物 3’端的6個堿基的自由能應該小于一 ^cal/mol ；擴增的靶序列長度最好不要超過300bp (Notomi等，2000)。其中，末端穩(wěn)定性和擴增片段大小是最重要的兩個參數(shù)。PRRSV分為歐洲型(以LV株為代表)和美洲型(以VR-2332株為代表)，它們的N基因編碼區(qū)0RF7均較為保守，本發(fā)明利用這一特點進行PRRSV LAMP檢測引物設計，首先應用 MegAlign軟件分析N基因編碼區(qū)0RF7基因序列，尋找最為保守的區(qū)域，然后根據(jù)LAMP引物設計原則，用I^rimer EXplore3.0在保守區(qū)域設計2對引物，擴增目的片段長度為211bp， 引物序列如下
PRRSV B3 5’ -ATGCTGAGGGTGATGCTGT-3’19bp
PRRSV F3 5， -CATTTCCCTCTAGCGACTGA-3，20bp
PRRSV FIP 5’ -GCCCTGATTGAAGGCAGTCTGGACTTTACCCCTAGTGAGCGG-3’ 42bp PRRSV BIP 5’ -ACCCTGTCAGATTCAGGGAGGATCAGACGCACAGTATGTTGC-3’ 42bp
2、病毒RNA提取及PRRSVRNA的反轉(zhuǎn)錄
病毒RNA提取按照RNA純化試劑Trizol說明書進行，以PRRSV美洲株的RNA為模板，用通用引物進行反轉(zhuǎn)錄(20 μ L反應體系)通用引物1 μ L，5 Xbuffer 4 μ L，10 XdNTP 2 μ L， 抑制劑1 μ L，模板RNA 11 μ L，以上組份混勻，置室溫5min后加入1 μ L反轉(zhuǎn)錄酶，然后按以下反應參數(shù)進行反轉(zhuǎn)錄42°C lh, 72°C lOmin，冰浴lmin。3、PRRSV RT-LAMP反應體系的建立、反應條件的優(yōu)化
采用矩陣法分別對Mg2+濃度、dNTP濃度、反應溫度及反應時間進行優(yōu)化篩選試驗，優(yōu)化篩選試驗的其它條件完全一致，反應的梯度變化如下=MgCl2終濃度從3. Ommol/L開始，以 1. 5mmol/L遞增，直到15mmol/L ；dNTPs終濃度從0. 2mmol/L開始，以0. 2mmol/L遞增，直到 1. 2mmol/L ；反應溫度從59°C開始，以1°C遞增，直到68°C ；反應時間從5min開始，以IOmin 遞增，直到90min，反應條件優(yōu)化結(jié)果見圖1、圖2、圖3、圖4。經(jīng)優(yōu)化，確定了適合于PRRSV的RT-LAMP檢測總體積為25μ 的最佳反應體系 IOXThermoPol Buffer 2. 5μ1, Bst DNA 聚合酶 Ι.ΟμΙ，Mg2+ 7. 5mM, dNTP 0. 4mM，引物 B3 (10μΜ) μ , F3 (10μΜ) μ , BIP (80μΜ) μ , FIP (80μΜ) μ ，模板 cDNA (15ngM) μ , Betaine (5M)5Pl，DEPC水補至25μ ，最佳反應條件為63°C lh，82°C終止反應。反應結(jié)束后，分別在各反應管中加入2 μ L 3 μ L SYBR Green I，混勻后觀察顏色變化，當陽性對照管顯示淡綠色，陰性對照管顯示淡橘紅色時，顯示淡綠色的管判為陽性，顯示淡橘紅色的管判為陰性；或取5 μ L產(chǎn)物用2. 5%的瓊脂糖進行電泳檢測，當陽性對照在211bp處出現(xiàn)目的條帶，陰性對照在211bp處未出現(xiàn)目的條帶時，在211bp處出現(xiàn)目的條帶的樣品判為陽性， 在211bp處未出現(xiàn)目的條帶的樣品判為陰性。4、特異性試驗
分別以 SIV、PRV, TGEV, PCV2、FMDV, PRRSV VR、PRRSV LV 及 HP-PRRSV 的核酸為模板， 按優(yōu)化后的RT-LAMP體系和反應條件進行恒溫擴增，擴增結(jié)束后按2. 2的方法進行判定， PRRSV VR,PRRSV LV及HP-PRRSV反應管均顯示淡綠色，且電泳后于211bp處有特異性條帶出現(xiàn)，檢測結(jié)果為陽性(試驗結(jié)果見圖5)；而SIV、PRV、TGEV、PCV2及FMDV反應管均顯示淡橘紅色，且電泳后于211bp處無特異性條帶出現(xiàn)，檢測結(jié)果為陰性(試驗結(jié)果見圖6)。5、敏感性試驗
取濃度為15ng/ μ 1的PRRSV RNA進行10倍梯度稀釋后作為模板，按優(yōu)化后的RT-LAMP 體系和反應條件進行恒溫擴增，同時對各稀釋度進行常規(guī)RT-PCR，擴增結(jié)束后按瓊脂糖電泳方法進行判定，RT-LAMP可以檢測至IJ 1. 5Χ ΙΟ、/ μ 1，即0. 015pg/ μ 1的RNA (圖7)，而 RT-PCR 僅檢測到 1. 5Χ 10_5ng/ μ 1 的 RNA，即 0. 15pg/ μ 1 的 RNA (圖 8)。綜上所述，本發(fā)明內(nèi)引物是影響LAMP反應效率的主要因素，內(nèi)引物濃度越高，同一時間內(nèi)開始的合成反應就越多，擴增效率就越高。內(nèi)、外引物濃度的最適比例為6:1 10:1，在此范圍內(nèi)都能取得很好的擴增效果，經(jīng)篩選實驗，本研究內(nèi)、外引物的最佳濃度分別為80μΜ和ΙΟμΜ。Bst酶也是影響反應效率的關(guān)鍵，但通常所用8U的酶(25 μ L體系)已經(jīng)完全滿足了合成的需要，提高其濃度對擴增效率沒有太大促進作用，本方法所用的Bst DNA Polymerase為5U。鎂離子是穩(wěn)定堿基形成時的中間體，它對LAMP的影響方式與PCR 的相同，濃度太高或太低都使反應無法進行或時間延長，經(jīng)篩選本方法的最佳Mg2+濃度為 7. 5mMo反應溫度對LAMP的影響方式與PCR不同，它不作用于DNA而作用于Bst酶。雖然溫度降到58°C，反應仍能進行，但此時酶的活性很弱，反應效率極低。本研究發(fā)現(xiàn)，62°C、 63°C、64°C、67°C、68°C均能擴增出較好的條帶，說明在Bst酶活性范圍內(nèi)溫度對LAMP的影響不大，但經(jīng)反復實驗表明，本方法的最適溫度為63°C。LAMP通過獨特的引物反轉(zhuǎn)設計，對自身進行鏈置換擴增，不需要模板的熱變性、退火、長時間溫度循環(huán)等過程，通常保溫幾十分鐘，即可完成。擴增效率極高，可在15 60分鐘內(nèi)擴增109 1010倍，通常反應時間不會超過1個小時。本研究結(jié)果表明，保溫60min 后即可擴增出較好的目的帶，而保溫70min、80min和90min后的檢測結(jié)果與保溫60min無顯著的區(qū)別，因此本方法選擇了 60min的保溫時間。LAMP方法具有高特異性和高敏感性的特點，4條引物分別針對6個不同的區(qū)域， 任何一個不匹配反應就無法進行，幾乎不可能出現(xiàn)非特異性擴增的情況；一般能檢測到10 拷貝以下的樣品，對于低濃度的病毒數(shù)量或無癥狀的病毒攜帶者的檢測敏感性較常規(guī)PCR 高。試驗結(jié)果表明，本發(fā)明建立的PRRSV RT-LAMP檢測方法可特異性的檢測PRRSV，具有良好的特異性。能檢測到0. 015pg/ μ 1的PRRSV RNA,而RT-PCR僅能檢測到0. 15pg/ μ 1的 RNA,是常規(guī)RT-PCR的10倍，具有較高的敏感性。
本發(fā)明建立的方法成本低廉，只需要一個恒溫水浴鍋就能進行，也不需要其他昂貴的耗材。RT-LAMP產(chǎn)物檢測有傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測法、白色沉淀檢測法和STOR Green I綠色熒光檢測法等三種方法，本發(fā)明選用了綠色熒光檢測法，該方法最為簡便、快速和可靠，用肉眼即可對結(jié)果進行判定，完全可以滿足野夕卜、現(xiàn)場和基層部門藍耳病病毒檢測的需要。
權(quán)利要求
1.一種藍耳病RT-LAMP檢測方法，其特征在于，包括以下步驟A 取待檢樣品提取核酸，進行反轉(zhuǎn)錄以得到cDNA ；B 以所述cDNA為模板，用外引物(B3、F3 )和內(nèi)引物(FIP、BIP )在反應體系中進行恒溫擴增；所述外引物(B3、F3)和內(nèi)引物(FIP、BIP)的序列分別如下B3 5' -ATGCTGAGGGTGATGCTGT-3‘F3 5' -CATTTCCCTCTAGCGACTGA-3‘FIP :5’ -GCCCTGATTGAAGGCAGTCTGGACTTTACCCCTAGTGAGCGG-3’BIP :5’ -ACCCTGTCAGATTCAGGGAGGATCAGACGCACAGTATGTTGC-3’ ；C 在擴增產(chǎn)物中加入顯色劑根據(jù)顏色變化來判定結(jié)果；或者取擴增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測方法來判定結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藍耳病RT-LAMP檢測方法，其特征在于，所述反應體系中的外引物(B3、F3)的濃度均為ΙΟμΜ,內(nèi)引物(FIP、BIP)的濃度均為80μΜ。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藍耳病RT-LAMP檢測方法，其特征在于，在步驟B中恒溫擴增的反應條件為63°C lh，82°C終止反應。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藍耳病RT-LAMP檢測方法，其特征在于，在步驟C結(jié)果判定步驟中加入的顯色劑為STOR Green I，判定方法為反應結(jié)束后，分別在各反應管中加入 2 μ L 3 μ L SYBR Green I，混勻后觀察顏色變化，當陽性對照管顯示淡綠色，陰性對照管顯示淡橘紅色時，顯示淡綠色的管判為陽性，顯示淡橘紅色的管判為陰性。
5.一種用于權(quán)利要求1所述的藍耳病RT-LAMP檢測方法的檢測試劑盒，其特征在于， 所述檢測試劑盒中RT-LAMP反應體系為10 X ThermoPol Buffer 2. 5μ1, Bst DNA聚合酶 1.0μ1，10μΜ的外引物Β3 μ ，ΙΟμΜ的外引物F3 μ ，80μΜ的內(nèi)引物BIP μ1，80μΜ的內(nèi)引物 FIP lPl，15ngAa 的 cDNA μ1，5Μ 的 Betaine 5μ1，DEPC 水補至 25μ ；其中該反應體系中還含有 Mg2+ 3 15mM, dNTP 0. 2 1. 2mM。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述反應體系中Mg2+和dNTP的濃度分別為7. 5mM、0. 4mM。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種簡便、快速、特異的藍耳病RT-PCR檢測方法及檢測試劑盒。本發(fā)明應用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(RT-LAMP)，在PRRSV核衣殼蛋白(N蛋白)ORF7基因保守序列的6個區(qū)域設計2對特異引物，經(jīng)反應體系、反應條件優(yōu)化及敏感性和特異性試驗，建立了藍耳病病毒(PRRSV)RT-LAMP檢測方法。研究結(jié)果表明，該檢測方法不需要復雜儀器，僅用一臺普通恒溫水浴鍋，在等溫條件(63℃)保溫1h，即可完成核酸擴增反應，加入核酸染料SYBRGreenⅠ后，用肉眼即可對試驗結(jié)果進行準確判定，為野外、現(xiàn)場和基層部門藍耳病的檢測提供了一種廉價、簡便、快速、敏感性高、特異性好的新方法。
文檔編號C12Q1/70GK102277445SQ20101058303
公開日2011年12月14日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者廖明, 廖秀云, 徐海聶, 楊素, 沙才華 申請人:中華人民共和國珠海出入境檢驗檢疫局