專利名稱：豬ERp44基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種豬ERp44基因啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的克隆及功能驗(yàn)證。
背景技術(shù)：
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白44(ERp44)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)分泌蛋白的正確合成與分泌。ERp44可滯留細(xì)胞內(nèi)的ER01，影響PDI氧化形成ニ硫鍵。此タト，ERp44還能與免疫球蛋白M亞基、脂聯(lián)素和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)形成ニ硫鍵，從而調(diào)節(jié)其分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)。ERp44在蛋白質(zhì)的滯留和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的成熟控制中發(fā)揮重要作用，它能與IP3R1結(jié)合，調(diào)節(jié)其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的加工和 Ca2+濃度依賴的分泌調(diào)節(jié)(Higo et al.，200 。脂聯(lián)素是由脂肪組織特異分泌的可調(diào)節(jié)胰島素敏感性和能量代謝平衡的重要脂肪細(xì)胞因子。體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中的脂聯(lián)素以高分子量、 低分子量和三聚體等三種主要的形式存在(Sim et al.，2009)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，ERp44、 EROl-La和GGA能調(diào)控脂聯(lián)素的合成與分泌，而PPAR γ激動(dòng)劑能増加脂聯(lián)素的分泌(Wang et al.，2007)，這表明ERp44基因可能受到PPARγ的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，但其分子機(jī)制尚不明確。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。提供ー種豬ERp44基因(GenBank注冊(cè)號(hào)NM_001137629)5’上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，確定豬ERp44基因的啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，對(duì)研究ERp44在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其與脂聯(lián)素分泌調(diào)節(jié)的關(guān)聯(lián)具有重要意義，有助于從分子水平闡明脂聯(lián)素的系統(tǒng)生理功能，為治療肥胖和胰島素抵抗提供相關(guān)理論基石出。本發(fā)明的另ー個(gè)目的在于提供含有上述基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的載體。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下申請(qǐng)人:通過克隆技術(shù)，從豬基因組獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白ERp44基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示的1 1562位(即豬ERp44基因的-1562 -1 位)。為了獲得本發(fā)明的ERp44基因的表達(dá)調(diào)控元件，對(duì)豬ERp44基因的啟動(dòng)子區(qū)的5’ 端逐步缺失，插入到pGL3-BasiC載體，得到一系列表達(dá)質(zhì)粒，利用螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)這些質(zhì)粒在豬腎細(xì)胞系IBRS2和小鼠成纖維細(xì)胞系NIH/3T3中的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示，在序列表SEQ ID NO 1所示序列的246 1091位為主要轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控區(qū)域(即豬 ERp44 基因的-1317 -472 位)。對(duì)SEQ ID NO 1所示序列的M6-1091位為主要轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控區(qū)域的序列分析顯示該取段序列中包含ー個(gè)PPRE位點(diǎn)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO=I所示的559 582位的DNA片段(即豬ERp44基因的-1004 -981位)。本發(fā)明針對(duì)該P(yáng)PRE位點(diǎn)進(jìn)行了刪除或突變，檢測(cè)其對(duì)ERp44基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果顯示，上述PPRE位點(diǎn)是PPAR γ 調(diào)控ERp44基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控元件，PPARy可與該位點(diǎn)結(jié)合抑制ERp44基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)脂聯(lián)素的分泌。本發(fā)明首次鑒定了豬ERp44基因啟動(dòng)子關(guān)鍵調(diào)控元件，對(duì)于研究ERp44基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制和脂聯(lián)素分泌調(diào)節(jié)具有重要意義。


圖1為豬ERp44基因啟動(dòng)子5’逐步缺失質(zhì)粒在NIH/3T3和IBRS2細(xì)胞內(nèi)的熒光素酶活性分析。圖1中(A)為豬ERp44基因啟動(dòng)子不同截短的結(jié)構(gòu)示意圖；(B)為豬ERp44 基因啟動(dòng)子不同截短的活性分析。熒光素酶載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到NIH/3T3和IBRS2細(xì)胞內(nèi)， pGL3-Basic作為對(duì)照，含有CMV啟動(dòng)子的海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒作為內(nèi)參，反應(yīng)轉(zhuǎn)染的效率；(C)為不同物種ERp44基因啟動(dòng)子內(nèi)保守的PPRE位點(diǎn)分析。結(jié)果顯示，-1317 -472 位的啟動(dòng)子截短載體具有最大的啟動(dòng)子活性，而這ー個(gè)區(qū)域正好含有推測(cè)的在多物種中高度保守的PPRE結(jié)合位點(diǎn)(-1004 -981)，說明PPAR γ可能在調(diào)節(jié)ERp44的轉(zhuǎn)錄活性中起作用。圖2為PPRE位點(diǎn)缺失時(shí)PPAR γ對(duì)豬ERp44基因啟動(dòng)子活性的影響。圖 2 中ERp44 啟動(dòng)子截短 pGL3_ERp44 (-1317/+180)和 pGL3_ERp44 (-472/+180) 與pcPPAR Y (或?qū)φ誴cDNA3. 1)共轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞，4 后檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染PPARy后顯著的降低了 pGL-ERp44(-1317/+180)的熒光素酶活性，而 pGL-ERp44 (-472/+180)的活性沒有變化，說明豬ERp44啟動(dòng)子-1004 -981位的PPRE結(jié)合位點(diǎn)是PPAR γ調(diào)控ERp44基因轉(zhuǎn)錄必需的調(diào)控元件。圖3為PPRE位點(diǎn)突變時(shí)PPAR γ對(duì)豬ERp44基因啟動(dòng)子活性的影響。圖3中野生和突變型的ERp44啟動(dòng)子分別于PPARy共轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞，檢測(cè)啟動(dòng)子活性。保守的PPRE位點(diǎn)如圖所示。結(jié)果顯示，突變PPRE位點(diǎn)后的ERp44啟動(dòng)子活性不再受PPAR γ的抑制，進(jìn)ー步證實(shí)了 ERp44的啟動(dòng)子受到PPAR γ的調(diào)控作用。圖4為不同濃度PPAR γ對(duì)豬ERp44基因啟動(dòng)子活性的影響。圖 4 中，分別用 0. 1、0. 5 和 2μ g 的 pcPPAR γ 與 pGL3_ERp44 (-1317/+180)共轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞，檢測(cè)啟動(dòng)子活性。pcDNA3. I(EV)空質(zhì)粒作為對(duì)照。結(jié)果顯示，PPARy對(duì) ERp44啟動(dòng)子活性的影響呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，濃度越大時(shí)對(duì)ERp44的啟動(dòng)子的抑制效果也越顯
-W-
書O圖5為PPAR γ抑制劑GW9662對(duì)豬ERp44基因啟動(dòng)子活性的影響。圖5中，NIH/3T3細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pGL3(-1317/+180)和pcPPAR γ后，分別用或者不用 50ymol/L GW9662處理細(xì)胞，24h后檢測(cè)啟動(dòng)子活性。pcDNA3. 1 (EV)空質(zhì)粒作為對(duì)照。結(jié)果顯示，PPAR γ抑制劑GW9662可顯著抵消PPAR γ對(duì)ERp44啟動(dòng)子活性的抑制作用。圖6為豬ERp44基因啟動(dòng)子的PPRE位點(diǎn)與PPAR γ的結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析。圖6中(A)為在IBRS2細(xì)胞和豬脂肪組織中進(jìn)行ChIP檢測(cè)；⑶為用10 μ mol/ L的羅格列酮處理IBRS2細(xì)胞24h后，進(jìn)行ChIP檢測(cè)?？?cè)旧|(zhì)作為陽性對(duì)照進(jìn)行PCR input ；用IgG沉淀的染色質(zhì)作為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，IBRS2和豬脂肪組織內(nèi)PPARy都能結(jié)合到ERp44的啟動(dòng)子區(qū)域上。另外，IBRS2細(xì)胞用10 μ mol/L的羅格列酮處理后，能増加 PPARy的結(jié)合能力。圖7為PPAR γ通過抑制ERp44的轉(zhuǎn)錄增加脂聯(lián)素分泌的分析。
圖7中(A)為脂聯(lián)素穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞用不同濃度(ΙΟμπιοΙ/L and 50ymol/L)的PPAR γ激動(dòng)劑羅格列酮處理，1 后，換成無血清培養(yǎng)液，;Bh后，收集培養(yǎng)液進(jìn)行Wfestern blot。(B)為用定量PCR檢測(cè)ERp44 mRNA的表達(dá)變化。DMSO處理組作為對(duì)照。結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)的ERp44表達(dá)受到抑制，而脂聯(lián)素的分泌顯著提高。圖8為豬ERp44基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)構(gòu)示意圖。圖8中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)標(biāo)記為+1(陰影部分)；翻譯起始位點(diǎn)加粗顯示(五角星)。 推測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)用下劃線突出顯示，相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子在橫線下方標(biāo)記出來。推測(cè)的PPRE位點(diǎn)用陰影標(biāo)記出。啟動(dòng)子截短所用的引物用方框標(biāo)記。染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP) 試驗(yàn)所用的擴(kuò)增引物也在圖中用下劃線標(biāo)記。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1豬ERp44基因啟動(dòng)子的克隆和雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建以豬肝臟總DNA為模板，利用上游引物5，-GTAGCTGGTGTTCAGGAAATG-3，和下游引物5，-AGTGAGGTCGGGTAAGGATAG-3，擴(kuò)增豬ERp44基因啟動(dòng)子序列，得到序列表SEQ ID NO 1 所示的序列，序列長度為1742bp。PCR反應(yīng)體系如下總體積為50μ 1，其中基因組模板DNA 為20ng，2XGC緩沖液I 25 μ L，dNTP終濃度為300 μ mol/L，引物終濃度為0. 3ymol/L, IU LA Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性45s，56°C退火45s，72°C 延伸2min，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。擴(kuò)增到的片段進(jìn)行TA克隆后測(cè)序驗(yàn)證。根據(jù)擴(kuò)增到的豬ERp44基因啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)或者突變位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得不同截短和含有突變位點(diǎn)的啟動(dòng)子區(qū)段，反應(yīng)條件同上。將產(chǎn)物分別回收后通過MluI和XhoI雙酶切，插入到pGL3-BasiC載體(Promega)中，測(cè)序驗(yàn)證。用于豬 ERp44基因啟動(dòng)子載體構(gòu)建的引物見表1所示。表1用于豬ERp44基因啟動(dòng)子載體構(gòu)建的引物設(shè)計(jì)
權(quán)利要求
1.一種克隆的豬ERP44基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其核苷酸序列選自下組(1)SEQID NO 1所示的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中發(fā)生ー處或多處缺失突變或替換突變的功能的等價(jià)物。
2.如權(quán)利要求1所述的豬ERp44基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其特征在于含有至少ー 個(gè)控制ERp44基因表達(dá)的調(diào)控元件，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1中1-1562位所示。
3.如權(quán)利要求2所述的豬ERp44基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其特征在于所述調(diào)控元件的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1中M6-1091位所示。
4.ー種含有熒光素酶報(bào)告基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體，其特征在干，它還含有如權(quán)利要求1，2和3所述的豬ERp44基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
全文摘要
本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬ERp44基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的克隆及功能驗(yàn)證。首次鑒定了豬ERp44基因啟動(dòng)子區(qū)，并將5’端逐步缺失和部分調(diào)控元件被改變的啟動(dòng)子序列插入報(bào)告基因上游，構(gòu)建了一系列真核表達(dá)質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)，確定了豬ERp44基因啟動(dòng)子區(qū)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子PPARγ可結(jié)合到ERp44基因啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)控位點(diǎn)，通過抑制ERp44基因的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)脂肪細(xì)胞因子脂聯(lián)素的分泌。本發(fā)明對(duì)研究ERp44在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及脂聯(lián)素的分泌調(diào)節(jié)具有重要意義，有助于從分子水平闡明脂聯(lián)素的系統(tǒng)生理功能，為治療肥胖和胰島素抵抗提供相關(guān)理論基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102533753SQ201010583790
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者周磊, 楊在清, 陳小冬, 雷霆, 龍勤強(qiáng) 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)