專利名稱：Gfp泄露試驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種毒理學(xué)檢測(cè)方法，尤其是化妝品毒理學(xué)檢測(cè)方法，屬于毒理學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，活體兔眼刺激(Draize)試驗(yàn)廣泛用于化妝品安全性評(píng)價(jià)，但因其評(píng)分系統(tǒng)存在主觀性，同時(shí)由于大量使用試驗(yàn)動(dòng)物，因?qū)ζ湓斐蓳p害而受到各動(dòng)物保護(hù)組織的反對(duì)。 在全球化動(dòng)物保護(hù)運(yùn)動(dòng)的影響下，發(fā)達(dá)國(guó)家普遍開展了以替代、減少和優(yōu)化為核心的“3R” 運(yùn)動(dòng)。在化妝品安全性評(píng)價(jià)中，體外替代實(shí)驗(yàn)將逐步取代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。因而，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家在發(fā)展科學(xué)可靠的眼刺激試驗(yàn)離體替代方法方面進(jìn)行了大量探索，包括離體器官模型、絨毛膜尿囊膜試驗(yàn)和離體細(xì)胞試驗(yàn)等。在動(dòng)物試驗(yàn)中，至少要對(duì)角膜、結(jié)膜及虹膜三種組織的病理反應(yīng)進(jìn)行觀察并進(jìn)行評(píng)分，單一的體外方法難以完全模擬所有組織的反應(yīng)，目前尚沒(méi)有任何一種方法有充分的試驗(yàn)依據(jù)證明能完全替代動(dòng)物眼刺激性試驗(yàn)。目前研究較多的替代試驗(yàn)有雞胚絨毛膜尿囊膜試驗(yàn)、紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)、血紅蛋白變性試驗(yàn)、MTT試驗(yàn)等。這些方法在操作簡(jiǎn)便性、適用的受試物譜、特異性和準(zhǔn)確性等方面各有優(yōu)缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有試驗(yàn)方法的上述不足，本發(fā)明提供一種檢測(cè)SIRC細(xì)胞(兔眼角膜細(xì)胞)中GFP(綠色熒光蛋白)泄露率的試驗(yàn)方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是GFP泄露試驗(yàn)方法，包括下列步驟A.含有表達(dá)載體I3Shuttle-CMV-GFP的腺病毒包裝細(xì)胞的選擇293細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，SIRC細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2 (—般2 3天傳代一次)；將含有 Pshuttle-CMV-GFP目的基因的載體病毒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞中；B.腺病毒制備和滴度測(cè)定取50ml 293細(xì)胞，70%鋪滿，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，使細(xì)胞數(shù)達(dá)到105/mL，用96孔酶標(biāo)板鋪板，每孔加入100 μ L細(xì)胞懸液，共鋪10排；準(zhǔn)備10個(gè)1. 5mLEP管，每管加900 μ L的無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基，第一管加100 μ L病毒液，混勻；取100 μ L第一管的病毒液加入到第二管，按梯度稀釋法稀釋直到第九管；在上述96孔酶標(biāo)板的每行加入一個(gè)稀釋度的病毒液 100μ 1，第10排加無(wú)血清的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照；37°C、CO2溫箱孵化7-10天，觀察細(xì)胞出現(xiàn)CPE的情況；記數(shù)每排出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，計(jì)算細(xì)胞病變率(如某一濃度各孔細(xì)胞全部病變，比率為1，如無(wú)細(xì)胞病變，則比率為0)T = 101+d ^0-5VmL ；d = Log 10稀釋度(如為10倍稀釋度，d= 1)；

S =各濃度中CPE細(xì)胞病變比率之和；
根據(jù)KARBER公式計(jì)算出用于細(xì)胞感染的病毒滴度為107TCID5(1/mL ；C. GFP陽(yáng)性細(xì)胞懸液和細(xì)胞裂解液的制備取80%匯合度的細(xì)胞，用已確定滴度的Pshuttle-CMV-GFP病毒液感染，24h后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞發(fā)光情況；當(dāng)細(xì)胞GFP陽(yáng)性率達(dá)到80%以上時(shí)，收集細(xì)胞，制備成 5X 105/mL細(xì)胞懸液；細(xì)胞懸液經(jīng)反復(fù)凍融，制成細(xì)胞裂解液；D.受試物處理和熒光檢測(cè)將受試物用含牛血清白蛋白的0. lmol/L的PBS配成濃度為IO^UW和0. 1% 的溶液、懸液或懸濁液，向容積為500 μ L的EP管中加入2001 μ L細(xì)胞懸液或細(xì)胞裂解液和200 μ L受試物；對(duì)照組以含牛血清白蛋白的0. lmol/L的PBS替代受試物以計(jì)算自溶發(fā)光值；每處理組重復(fù)樣本數(shù)為3 ；在37°C搖床中孵育lOmin，加入細(xì)胞懸液的處理組以 2000r/min離心lOmin，取上清液200 μ L加入96孔酶標(biāo)板；加入細(xì)胞裂解液的處理組直接取200 μ L加入96孔酶標(biāo)板，在酶標(biāo)儀上以485nm和535nm測(cè)其發(fā)光度值；E. GFP漏出率、GFP變性率計(jì)算GFP泄漏率=[(受試物上清液發(fā)光度值-對(duì)照上清液發(fā)光度值)/對(duì)照發(fā)光度 it] X 100% ；GFP變性率=[(對(duì)照裂解液發(fā)光度值-受試物裂解液發(fā)光度值)/對(duì)照裂解液發(fā)光度值]X100%。本方法眼刺激性判定標(biāo)準(zhǔn)為將GFP變性率或GFP泄漏率中任意一項(xiàng)大于等于 25%的受試物判定為眼刺激陽(yáng)性，將GFP變性率和GFP泄漏率同時(shí)小于25%的受試物判定為眼刺激陰性。本方法以腺病毒表達(dá)載體(Pshuttle-CMV-GFP)病毒液感染SIRC細(xì)胞為例，表達(dá) GFP后制成細(xì)胞懸液和裂解液，分別與受試物孵育，檢測(cè)細(xì)胞GFP的泄漏率和變性率，分析細(xì)胞GFP泄漏率與受試物MMAS值的相關(guān)性，從而建立一種替代試驗(yàn)的方法(通過(guò)藥物對(duì)發(fā)光細(xì)胞處理替代眼刺激實(shí)驗(yàn)方法)。GFP來(lái)自發(fā)光水母，不存在于高等生物細(xì)胞，易于觀察和檢測(cè)，因此是生物醫(yī)學(xué)研究中常用的生物標(biāo)記蛋白。本方法采用化妝品常用原料處理轉(zhuǎn)GFP基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞， 測(cè)定從細(xì)胞中泄漏的GFP的含量。本發(fā)明的有益效果是，成本低，操作簡(jiǎn)便快速、適用受試物譜廣、預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性高；利用腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因具有高效率、低致病性、高滴度、以及在體內(nèi)不整合入宿主細(xì)胞染色體等優(yōu)點(diǎn)。本方法具有很好的穩(wěn)定性和可靠性。本發(fā)明僅以兔角膜上皮細(xì)胞(SIRC細(xì)胞)為例，所建立的方法也適用于Hela、h印G2、C2C12等細(xì)胞系。本發(fā)明僅以腺病毒表達(dá)載體為例，其中也包括能在細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白的其他轉(zhuǎn)基因方法，如質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒等方法。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。利用腺病毒表達(dá)載體I^shuttle-CMV-GFP病毒液感染SIRC細(xì)胞，待其表達(dá)GFP后制成細(xì)胞懸液和裂解液，分別與各種受試物不同濃度的溶液(或懸液)孵育；最后利用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞GFP的泄漏率和變性率，并分析細(xì)胞GFP泄漏率與受試物MMAS值的相關(guān)性，從
4而建立一種替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法，即檢測(cè)SIRC細(xì)胞中GFP泄漏率的試驗(yàn)方法。受試物包括 表面活性劑、酸、堿、醇、酯、酮、胺、無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)鹽類，表1給出了 18種受試物名稱及MMAS值。實(shí)施方式一受試物為乳酸將293細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，SIRC細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2 ；一般2 3天傳代一次；取80%匯合度的細(xì)胞，用T = IO7TCID5ciAiL的I^shuttIe-CMV-GFP病毒液感染，24h后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞發(fā)光情況；當(dāng)細(xì)胞GFP陽(yáng)性率達(dá)到80 %以上時(shí)，收集細(xì)胞，制備成5 X IOVmL細(xì)胞懸液； 取部分細(xì)胞懸液經(jīng)反復(fù)凍融，制成細(xì)胞裂解液；將乳酸用含牛血清白蛋白的0. lmol/L 的PBS配成濃度為10%、1 %和0. 1 %的溶液，向容積為500 μ L的EP管中加入200 μ L細(xì)胞懸液或細(xì)胞裂解液和200 μ L乳酸；對(duì)照組以含牛血清白蛋白的0. lmol/L的PBS替代乳酸；每處理組重復(fù)樣本數(shù)為3 ；在37°C搖床中孵育lOmin，以2000r/min離心lOmin，取上清液200 μ L加入96孔酶標(biāo)板；在酶標(biāo)儀上以485nm和535nm測(cè)乳酸處理組上清液發(fā)光度值、對(duì)照組上清液發(fā)光度值以及對(duì)照組發(fā)光度值分別為6626. 67,6565. 33和20194，計(jì)算得出GFP漏出率為0. 3% ；在酶標(biāo)儀上以485nm和535nm測(cè)對(duì)照組裂解液發(fā)光度值、乳酸組裂解液發(fā)光度值分別為30730和317，計(jì)算得出GFP變性率為98. 97%。說(shuō)明乳酸GFP變性為陽(yáng)性(變性率彡25% )，劃定乳酸為眼刺激陽(yáng)性。實(shí)施方式二 受試物為異丙醇將293細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，SIRC細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2 ；一般2 3天傳代一次；取80%匯合度的細(xì)胞，用T = IO7TCID5ciAiL的I^shuttIe-CMV-GFP病毒液感染，24h后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞發(fā)光情況；當(dāng)細(xì)胞GFP陽(yáng)性率達(dá)到80 %以上時(shí)，收集細(xì)胞，制備成5 X IOVmL細(xì)胞懸液； 取部分細(xì)胞懸液經(jīng)反復(fù)凍融，制成細(xì)胞裂解液；將異丙醇用含牛血清白蛋白的0. Imol/ L的PBS配成濃度為10%、1%和0. 的溶液，向容積為500yL的EP管中加入200yL細(xì)胞懸液或細(xì)胞裂解液和200yL異丙醇；對(duì)照組以含牛血清白蛋白的0. lmol/L的PBS替代異丙醇；每處理組重復(fù)樣本數(shù)為3 ；在37°C搖床中孵育lOmin，以2000r/min離心lOmin， 取上清液200 μ L加入96孔酶標(biāo)板；在酶標(biāo)儀上以485nm和535nm測(cè)異丙醇處理組上清液發(fā)光度值、對(duì)照組上清液發(fā)光度值以及對(duì)照組發(fā)光度值分別為21378. 67,3253和27214，計(jì)算得出GFP漏出率為66. 6% ；在酶標(biāo)儀上以485nm和535nm測(cè)對(duì)照組裂解液發(fā)光度值、異丙醇組裂解液發(fā)光度值分別為38882和12935. 5，計(jì)算得出GFP變性率為66. 73%。說(shuō)明異丙醇處理組GFP變性為陽(yáng)性(變性率彡25% )，劃定異丙醇為眼刺激陽(yáng)性。實(shí)施方式三受試物為甘油將293細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，SIRC細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2 ；一般2 3天傳代一次；取80%匯合度的細(xì)胞，用T = IO7TCID5ciAiL的I^shuttIe-CMV-GFP病毒液感染，24h后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞發(fā)光情況；當(dāng)細(xì)胞GFP陽(yáng)性率達(dá)到80 %以上時(shí)，收集細(xì)胞，制備成5 X IOVmL細(xì)胞懸液；取部分細(xì)胞懸液經(jīng)反復(fù)凍融，制成細(xì)胞裂解液；將甘油用含牛血清白蛋白的0. lmol/L 的PBS配成濃度為10%、1 %和0. 1 %的溶液，向容積為500 μ L的EP管中加入200 μ L細(xì)胞懸液或細(xì)胞裂解液和200 μ L甘油；對(duì)照組以含牛血清白蛋白的0. lmol/L的PBS替代甘油；每處理組重復(fù)樣本數(shù)為3 ；在37°C搖床中孵育lOmin，以2000r/min離心lOmin，取上清液200 μ L加入96孔酶標(biāo)板；在酶標(biāo)儀上以485nm和535nm測(cè)甘油處理組上清液發(fā)光度值、對(duì)照組上清液發(fā)光度值以及對(duì)照組發(fā)光度值分別為8207、8122. 67和20344. 7，計(jì)算得出GFP漏出率為0. 41 % ；在酶標(biāo)儀上以485nm和535nm測(cè)對(duì)照組裂解液發(fā)光度值、甘油組裂解液發(fā)光度值分別為30336和30971. 5，計(jì)算得出GFP變性率為0. 02%。說(shuō)明甘油處理組GFP變性為陰性(變性率<25% )，且GFP泄漏率低于25%，劃定甘油為眼刺激陰性。由于活體兔眼刺激試驗(yàn)(Draize Test)是判斷化合物眼睛刺激性的經(jīng)典方法，因此選用18種受試物的MMAS值與細(xì)胞GFP泄漏率進(jìn)行分析。酸性和堿性受試物導(dǎo)致GFP變性，其它受試物對(duì)細(xì)胞GFP泄漏的作用與受試物的MMAS值和濃度有關(guān)。濃度為5%時(shí)，大多數(shù)皿儀3值> 15的受試物對(duì)SIRC細(xì)胞的GFP的泄漏有明顯作用；而在0.5%和0. 05%濃度時(shí)僅有少數(shù)受試物(主要是表面活性劑)導(dǎo)致細(xì)胞GFP泄漏率>25%。選取GFP變性為陰性(變性率< 25% )且100%濃度的MMAS值已知的受試物，分析受試物濃度為5%時(shí)SIRC 細(xì)胞GFP泄漏率與受試物MMAS值的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0. 888，因此，將GFP變性率為陽(yáng)性(彡25% )的受試物判定為具有眼刺激性，對(duì)于GFP變性為陰性(變性率< 25% )的受試物，將GFP泄漏率25%定為“界定值”判斷受試物的眼刺激性。為了排除Draize試驗(yàn)中受試物濃度差異對(duì)相關(guān)性分析的影響，選用文獻(xiàn)報(bào)道的濃度100%時(shí)的受試物MMAS值與本試驗(yàn)得到5%濃度時(shí)的GFP泄漏率進(jìn)行相關(guān)性分析，共有11種受試物(表1中序號(hào)3-8，13， 15-18)滿足分析條件。結(jié)果表明這11種受試物100%濃度時(shí)的MMAS與本試驗(yàn)5%濃度時(shí)的GFP泄漏率的相關(guān)系數(shù)為0. 888 (ρ < 0. 001)。在GFP泄漏試驗(yàn)中，如果將GFP泄漏率 25%定為“界定值”，11種受試物全部被正確劃分，其中7種眼刺激陽(yáng)性，4種眼刺激陰性。表1
權(quán)利要求
1. 一種GFP泄露試驗(yàn)方法，其特征在于，包括下列步驟A.含有表達(dá)載體I^shuttle-CMV-GFP的腺病毒包裝細(xì)胞的選擇293細(xì)胞培養(yǎng)于10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，SIRC細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2 ；將含有I^shuttle-CMV-GFP目的基因的載體病毒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞中；B.腺病毒制備和滴度測(cè)定取50ml 293細(xì)胞，70 %鋪滿，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，使細(xì)胞數(shù)達(dá)到105/mL，用96孔酶標(biāo)板鋪板，每孔加入100 μ L細(xì)胞懸液，共鋪10排；準(zhǔn)備10個(gè)1. 5mLEP管，每管加900 μ L的無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基，第一管加100 μ L病毒液，混勻；取100 μ L第一管的病毒液加入到第二管，按梯度稀釋法稀釋直到第九管；在上述96孔酶標(biāo)板的每行加入一個(gè)稀釋度的病毒液 100μ 1，第10排加無(wú)血清的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照；37°C、CO2溫箱孵化7-10天，觀察細(xì)胞出現(xiàn)CPE的情況；記數(shù)每排出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，計(jì)算細(xì)胞病變率T = io1+d(s-°-5)/mL ；d = Log 10稀釋度；S =各濃度中CPE細(xì)胞病變比率之和；根據(jù)KARBER公式計(jì)算出用于細(xì)胞感染的病毒滴度為IO7TCID5ciAiL ；C.GFP陽(yáng)性細(xì)胞懸液和細(xì)胞裂解液的制備取80%匯合度的細(xì)胞，用已確定滴度的I^shuttle-CMV-GFP病毒液感染，24h后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞發(fā)光情況；當(dāng)細(xì)胞GFP陽(yáng)性率達(dá)到80%以上時(shí)，收集細(xì)胞，制備成5 X IO5/ mL細(xì)胞懸液；細(xì)胞懸液經(jīng)反復(fù)凍融，制成細(xì)胞裂解液；D.受試物處理和熒光檢測(cè)將受試物用含牛血清白蛋白的0. lmol/L的PBS配成濃度為IO^UW和0. 1 %的溶液、懸液或懸濁液，向容積為500 μ L的EP管中加入200 μ L細(xì)胞懸液或細(xì)胞裂解液和 200 μ L受試物；對(duì)照組以含牛血清白蛋白的0. lmol/L的PBS替代受試物以計(jì)算自溶發(fā)光值；每處理組重復(fù)樣本數(shù)為3 ；在37°C搖床中孵育lOmin，加入細(xì)胞懸液的處理組以 2000r/min離心lOmin，取上清液200 μ L加入96孔酶標(biāo)板；加入細(xì)胞裂解液的處理組直接取200 μ L加入96孔酶標(biāo)板，在酶標(biāo)儀上以485nm和535nm測(cè)其發(fā)光度值；E.GFP漏出率、GFP變性率計(jì)算GFP泄漏率=[(受試物上清液發(fā)光度值-對(duì)照上清液發(fā)光度值)/對(duì)照發(fā)光度 it] X 100% ；GFP變性率=[(對(duì)照裂解液發(fā)光度值-受試物裂解液發(fā)光度值)/對(duì)照裂解液發(fā)光度值]X100%o
全文摘要
本發(fā)明公開了一種GFP泄露試驗(yàn)方法，屬于毒理學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。該方法采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得表達(dá)GFP(綠色熒光蛋白質(zhì))的動(dòng)物細(xì)胞，然后制備細(xì)胞懸液和裂解液，分別與受試物孵育后檢測(cè)GFP的熒光值，計(jì)算細(xì)胞GFP泄漏率和變性率。通過(guò)分析細(xì)胞GFP泄漏率和變性率與受試物MMAS值的關(guān)系，建立了一種通過(guò)GFP泄漏率和變性率判斷受試物眼刺激性的替代試驗(yàn)方法。本發(fā)明所建立的檢測(cè)方法成本低，操作簡(jiǎn)便快速、適用受試物譜廣、預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好，是一種有前途的眼刺激性替代試驗(yàn)方法。利用腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因具有高效率、低致病性、高滴度、以及在體內(nèi)不整合入宿主細(xì)胞染色體等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102168081SQ201010586179
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2010年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月14日
發(fā)明者吳孟茹, 帥培強(qiáng), 張廣峰, 林琳, 譚志, 陳祥貴 申請(qǐng)人:四川出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 西華大學(xué)