專利名稱：一種改進細胞色素p450酶家族體外表達的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及細胞色素P450酶，特別涉及一種改進細胞色素P450酶家族體外表達 的方法。
背景技術：
細胞色素P450 (CYP450)酶是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上混合功能氧化酶系統(tǒng)的末端氧化酶，是 I相反應中活性最強的代謝酶，可參與許多前致癌物和前毒素的代謝活化，生成親電性很強 的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物，引發(fā)一系列的毒性效應?，F(xiàn)有研究CYP450酶代謝活化外源化合物的 途徑主要分體內(nèi)和體外代謝兩種。體內(nèi)代謝研究以動物模型為代表，但不同種屬的動物與 人之間存在較大的差異，尤其是在代謝方面，參與化合物代謝的酶種類、酶的貢獻程度、反 應類型以及代謝產(chǎn)物等均可能不相同，把動物實驗結(jié)果外推到人體誤差高且準確性低。此 外，CYP酶的代謝底物非常廣泛，每個CYP酶都有其特異的代謝譜，開展單種代謝酶對毒物 的代謝特征研究就需要得到單一組分的CYP酶，動物體內(nèi)代謝中參與化合物代謝的酶種類 繁多，難以達到目的。隨著對CYP酶的深入認識，人們開始通過各種方法得到單一的純酶， 構建各種體外代謝系統(tǒng)，對外源化合物的體外代謝進行研究。最初，人們通過純化哺乳動物 肝或腎中的CYPs得到單一的純酶再進行研究，但CYPs家族中的各種代謝酶的性質(zhì)非常 接近，很難得到純酶，或者產(chǎn)量很低。到了 20世紀90年代，隨著分子生物學、生物化學的 飛速發(fā)展，通過在異源表達系統(tǒng)中表達得到純CYPs酶已成為得到單一純酶并進而開展化 學物體外代謝的主要方法手段。到目前為止，幾個常用的表達體系，如細菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞等系 統(tǒng)都已被用于CYP450S的表達。其中桿狀病毒昆蟲細胞(BaCul0Virus/Sf9)表達系統(tǒng)可 高效表達外源基因，且昆蟲細胞的蛋白加工和修飾方式與哺乳動物細胞相似，可實現(xiàn)較為 正確的蛋白糖基化、分泌和組織定位表達，且蛋白表達量高，可以高水平表達多種原始的 CYP450蛋白。但CYP450蛋白的異源表達除了需要有完整的細胞、亞細胞結(jié)構、正確的蛋白 糖基化、分泌和組織定位表達外，還需要有血紅素等輔助因子的參與，同時CYP450酶活性 的發(fā)揮還需要細胞色素P450氧化還原酶(P0R)、NADPH等輔酶為其提供電子，所以如何在各 種異源表達系統(tǒng)中得到高量、有酶活性的CYP450蛋白成為了化合物體外代謝的關鍵點和 難點。如前所述，CYP450S酶類需要在血紅素鐵上加入兩個電子(即被還原后)才能行使 其活性，這種電子一般由與CYP450短暫結(jié)合的蛋白作為電子供體，從輔基中傳遞而提供。 哺乳動物CYP450S作為膜結(jié)合蛋白質(zhì)，有些位于線粒體內(nèi)膜，有些位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，共有兩條不 同的電子傳遞鏈，CYP450s的位置不同電子傳遞鏈也不同，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中為CYP450提供電子 的蛋白是POR蛋白。人的POR蛋白是一種膜結(jié)合的黃素蛋白，它由相同比例的FMN和FAD黃 素蛋白組成，存在于大多數(shù)真核細胞中，是一些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的加氧酶蛋白的電子供體蛋白，它可以從NADPH為CYP450s提供電子。為系統(tǒng)研究CYP450對化合物的代謝活化作用，提高體外代謝反應效率，因此研究 CYP450和POR非常有必要。但采用經(jīng)典方法制備CYP450和POR的時，發(fā)現(xiàn)其得率很低，難 以滿足研究需求。本發(fā)明提供一種改進細胞色素P450酶家族體外表達的方法，使得CYP450 和POR能高效表達且活性較高。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于本發(fā)明提供一種改進細胞色素P450酶家族體外表 達的方法，使得CYP450和POR能高效表達且活性較高。技術方案
一種改進細胞色素P450酶家族體外表達的方法，其特征在于在步驟4所述的有關輔助 因子的 4 種條件之一① 0. 5-6 μ g/ml Hemin ；② 0. 05-0. 6mM 5-ALA ；③ 0. 01-0. 4mM Fe3+ ； ④ 0.05-0. 6mM -ALA 和 0.01-0. 4mM Fe3+混合物。最優(yōu)化的條件為 0. 2 mM 5-ALA 與 0. 02mM Fe3+混合物。具體制備方法如下(以CYP2A13和POR為例)
1、重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacl-CYPs/POR質(zhì)粒的構建與鑒定
pFastBacl-CYP2A13為本實驗室保存。雙酶消化重組質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) /POR和轉(zhuǎn)移質(zhì) 粒載體pFastBac 1，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收目的片段。用T4 DNA連接酶連 接回收的POR基因與載體pFastBac 1片段，構建重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pFastBacl-POR。經(jīng)氨 芐青霉素抗性平板篩選，獲得含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，提取菌液DNA，獲得重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì) 粒 DNA。使用雙酶切消化驗證 pFastBacl-CYP2A13 和 pFastBac 1-P0R。2、重組真核表達病毒Ac-Bacmid-CYPs/POR DNA的構建與鑒定
將已構建好的pFastBac 1-CYPs/POR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細胞，在 DHlOBac大腸桿菌的助手質(zhì)粒Helper輔助下經(jīng)Tn7轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座，將各CYPs/POR的基因片段 插入穿梭載體Bacmid中，經(jīng)卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素三抗篩選和藍白斑篩選，得到重 組 Ac-Bacmid-CYPs/POR DNA，用 PCR 反應進行驗證。3、重組真核表達病毒Ac-Bacmid-CYPs/POR的獲得
在6孔板接種9X IO5個細胞/孔，27°C貼壁lh?，F(xiàn)配桿粒DNA與Cellfectin轉(zhuǎn)染試 劑復合物對細胞進行轉(zhuǎn)染，27°C孵育5h后，加入2ml Sf-900 II SFM培養(yǎng)液(含青霉素100 IU/ml ；鏈霉素100 μ g/ml)，27°C孵育72h或直到看到病毒感染的跡象為止。收取含有目 的基因的第一代重組病毒液，再用此病毒液感染Sf9細胞，收取第二代重組病毒液，可以保 存?zhèn)溆没蚋腥維f9細胞以得到更高效價的病毒液。4、重組CYP450s/P0R蛋白的表達
使用重組病毒液感染Sf9細胞，加入不同條件的輔助因子，以表達有活性的CYP450蛋 白。感染后72小時收集細胞，超聲破碎細胞，然后差速離心分離出細胞中的微粒體蛋白，分 裝后-80°C保存?zhèn)溆?。以空載體病毒感染細胞表達的蛋白做陰性對照，進行SDS-PAGE電泳， 以免疫印跡法檢測CYP2A13和POR蛋白的表達，使用掃描儀掃描Immunoblotting條帶，用 Image J 1. 43軟件對條帶進行灰度值分析。
5、CO-差示光譜法檢測CYP450蛋白活性
采用CO差示光譜法檢測CYP450蛋白酶活性微粒體懸液用微粒體蛋白稀釋緩沖液稀 釋至lmg/ml，取Iml加入到Icm光徑的比色皿中，然后加入適量的保險粉，用封口膜封口混 勻后測定blank，緩慢通入CO 2分鐘，混勻使CO與微粒體充分接觸，然后在紫外分光光度計 的wavelength scan模式下掃描400nm至550nm處的吸收光譜，再依據(jù)相關公式計算微粒 體蛋白中CYP450蛋白的含量。6、細胞色素C分析法檢測POR蛋白活力
在Icm光徑的比色皿中加入0. 84ml的還原酶分析緩沖液，然后加入0. Iml 0. 8 mM細 胞色素C，再加入20μ1稀釋適當倍數(shù)的微粒體懸液，混勻后測定blank，然后加入50μ1 4mM 的NADPH，用封口膜封口后，迅速混勻，立即用紫外分光光度計的kinetic/time模式檢測3 分鐘內(nèi)550nm處的吸光值變化，再依據(jù)公式計算還原酶活力。有益效果
1，首次對CYP蛋白、POR蛋白及其共表達的條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同時給予 0. 02mM Fe3+和0.2mM 5-ALA處理細胞，上述蛋白表達水平及其活性最高。CYP的MOI為 5pfu/細胞、POR的MOI為2 pfu/細胞時，兩者的共表達效率最高。2，該條件的優(yōu)化和建立，為體外高效表達外源代謝酶并開展藥物和毒物的體外代 謝研究提供了重要的平臺。該條件具有一定的普適性，可適用于多種體外活性蛋白的表達。 一經(jīng)推廣，將產(chǎn)生良好的社會效益和可觀的經(jīng)濟效益。


圖1.不同條件輔助因子對CYP2A13表達的影響，其中A為Immunoblotting檢測 加入不同濃度的Hemin后CYP2A13蛋白表達差異，B為A圖經(jīng)過Image J 1. 43軟件對條 帶進行灰度值分析后的結(jié)果；C為Immunoblotting檢測加入不同濃度的5-ALA后CYP2A13 蛋白表達差異，D為C圖經(jīng)過Image J 1. 43軟件對條帶進行灰度值分析后的結(jié)果；E為 Immunoblotting檢測加入不同濃度的Fe3+后CYP2A13蛋白表達差異，F(xiàn)為E圖經(jīng)過Image J 1.43軟件對條帶進行灰度值分析后的結(jié)果；G為Immunoblotting檢測加入不同條件的輔 助因子后CYP2A13蛋白表達差異，H為G圖經(jīng)過Image J 1. 43軟件對條帶進行灰度值分析 后的結(jié)果。圖2.不同條件輔助因子對CYP2A13活性的影響，其中A為加入不同條件的輔助因 子后所表達的CYP2A13的特征吸收峰圖；B為使用Sata 7. 0軟件對CYP2A13蛋白活性進行 的統(tǒng)計分析圖。圖3.不同條件輔助因子對POR活性的影響，其中A為加入不同濃度5-ALA后POR 蛋白的活性；B為加入不同濃度的Fe3+后POR蛋白的活性；C為加入不同濃度的Hemin后POR 蛋白的活性；D為加入不同種類的輔助因子后POR蛋白的活性差異。圖4.不同病毒效價比例對CYP2A13與POR共表達的影響，其中A為加入不同 Ac-Bacmid-CYP2A13病毒效價(Μ0Ι，pfu/cell)后CYP2A13蛋白的表達；B為加入不同 Ac-Bacmid-P0R病毒效價(MOI，pfu/ce 11)后POR蛋白的表達；C為加入不同效價比例的 Ac-Bacmid-CYP2A 13和Ac-Bacmid-POR病毒后CYP2A13蛋白的表達；D為加入不同效價比例的Ac-Bacmid-CYP2A 13和Ac-Bacmid-POR病毒后POR蛋白的活性變化。
具體實施例方式實施例1
1、重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacl-CYP2A13質(zhì)粒的構建與鑒定
pFastBacl-CYP2A13為本實驗室保存。經(jīng)氨芐青霉素抗性平板篩選，獲得含重組 質(zhì)粒的大腸桿菌，提取菌液DNA，獲得重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒DNA。使用雙酶切消化驗證 pFastBacl-CYP2A13。2、重組真核表達病毒Ac-Bacmid_CYP2A13 DNA的構建與鑒定
將已構建好的pFastBacl-CYP 2A13重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細胞，在 DHlOBac大腸桿菌的助手質(zhì)粒Helper輔助下經(jīng)Tn7轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座，將各CYP2A13的基因片段 插入穿梭載體Bacmid中，經(jīng)卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素三抗篩選和藍白斑篩選，得到重 組 Ac-Bacmid-CYP2A 13 DNA,用 PCR 反應進行驗證。3、重組真核表達病毒Ac-Bacmid-CYP 2A13的獲得
在6孔板接種9 X IO5個細胞/孔，27°C貼壁lh?，F(xiàn)配桿粒DNA與Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑 復合物對細胞進行轉(zhuǎn)染，27°C孵育5h后，加入2ml Sf-900 II SFM培養(yǎng)液(含青霉素IOOu/ ml;鏈霉素100 yg/ml)，27°C孵育72h或直到看到病毒感染的跡象為止。收取含有目的基 因的第一代重組病毒液，再用此病毒液感染Sf9細胞，收取第二代重組病毒液，可以保存?zhèn)?用或感染Sf9細胞以得到更高效價的病毒液。4、重組CYP 2A13蛋白的表達
使用重組病毒液感染Sf9細胞，加入不同條件的輔助因子，以表達有活性的CYP2A13蛋 白。感染后72小時收集細胞，超聲破碎細胞，然后差速離心分離出細胞中的微粒體蛋白，分 裝后-80°C保存?zhèn)溆?。以空載體病毒感染細胞表達的蛋白做陰性對照，進行SDS-PAGE電泳， 以免疫印跡法檢測CYP2A13蛋白的表達，使用掃描儀掃描Immunoblotting條帶，用Image J 1. 43軟件對條帶進行灰度值分析。其中步驟4中輔助因子為0. 5-6 μ g/ml Hemin0實施例2
與實施例1相比除了步驟4中輔助因子為0. 05-0. 6mM 5-ALA不同外，其他皆相同。實施例3
與實施例1相比除了步驟4中輔助因子為0. 01-0. 4mM Fe3+不同夕卜，其他皆相同。實施例4
與實施例1相比除了步驟4中輔助因子為0. 05-0. 6mM -ALA和0. 01-0. 4mM Fe3+混合 物不同外，其他皆相同。實施例5
將實施例1-4所生成的重組CYP 2A13蛋白，利用CO-差示光譜法檢測CYP2A13蛋白活
性
采用CO差示光譜法檢測CYP2A13蛋白酶活性微粒體懸液用微粒體蛋白稀釋緩沖液稀 釋至lmg/ml，取Iml加入到Icm光徑的比色皿中，然后加入適量的保險粉，用封口膜封口混 勻后測定blank，緩慢通入CO 2分鐘，混勻使CO與微粒體充分接觸，然后在紫外分光光度計scan模式下掃描400nm至550nm處的吸收光譜，再依據(jù)相關公式計算微粒 體蛋白中CYP450蛋白的含量。結(jié)果CYP2A13體外表達及活性的條件優(yōu)化
為了增強昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)用于表達CYP450S的實用性，我們在進行 CYP2A13蛋白的表達時加入了 Hemin、5-ALA和/或Fe3+，觀察不同條件輔助因子對蛋白表達 水平和活性的影響。圖1所示，CYP2A13蛋白在45kD左右有條帶，說明蛋白在Bac-to-Bac系統(tǒng)中成功 表達(A，C，E，G)。經(jīng)灰度值掃描分析，在加入 1μ g/ml Hemin,0. 2mM 5-ALA 或 0· 02 mM Fe3+ 時，CYP2A13蛋白表達量比其他濃度各輔助因子高(B，D，F(xiàn))。對于單獨加入0. 2mM 5-ALA或 0. 02 mM Fe3+，同時加入 0. 2mM 5-ALA 和 0. 02mM Fe3+ 時，CYP2A13 蛋白的表達最高(圖 H)。此外，研究了不同輔助因子對CYP2A13活性的影響。結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，同時加入 0. 2mM 5-ALA和0. 02mM Fe3+時，CYP2A13蛋白的活性也明顯高于其他單獨給予的輔助因子 (圖 2)。實施例6
1、重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacl- POR質(zhì)粒的構建與鑒定
雙酶消化重組質(zhì)粒pcDNA3. l(+)/P0R和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pFastBac 1，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠 電泳分離后，回收目的片段。用T4 DNA連接酶連接回收的POR基因與載體pFastBac 1片段， 構建重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pFastBacl-POR。經(jīng)氨芐青霉素抗性平板篩選，獲得含重組質(zhì)粒的大 腸桿菌，提取菌液DNA，獲得重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒DNA。使用雙酶切消化驗證pFastBac 1-P0R。2、重組真核表達病毒Ac-Bacmid- POR DNA的構建與鑒定
將已構建好的pFastBacl- POR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細胞，在 DHlOBac大腸桿菌的助手質(zhì)粒Helper輔助下經(jīng)Tn7轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座，將各POR的基因片段插 入穿梭載體Bacmid中，經(jīng)卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素三抗篩選和藍白斑篩選，得到重組 Ac-Bacmid- POR DNA，用PCR反應進行驗證。3、重組真核表達病毒Ac-Bacmid- POR的獲得
在6孔板接種9 X IO5個細胞/孔，27°C貼壁lh?，F(xiàn)配桿粒DNA與Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑 復合物對細胞進行轉(zhuǎn)染，27°C孵育5h后，加入2ml Sf-900 II SFM培養(yǎng)液(含青霉素IOOu/ ml;鏈霉素100 118/1111)，271孵育7211或直到看到病毒感染的跡象為止。收取含有目的基 因的第一代重組病毒液，再用此病毒液感染Sf9細胞，收取第二代重組病毒液，可以保存?zhèn)?用或感染Sf9細胞以得到更高效價的病毒液。4、重組POR蛋白的表達
使用重組病毒液感染Sf9細胞，加入不同條件的輔助因子，以表達有活性的POR蛋白。 感染后72小時收集細胞，超聲破碎細胞，然后差速離心分離出細胞中的微粒體蛋白，分裝 后-80°C保存?zhèn)溆?。其中步驟4中輔助因子為0. 5-6 μ g/ml Hemin0實施例7
與實施例6相比除了步驟4中輔助因子為0. 05-0. 6mM 5-ALA不同外，其他皆相同。實施例8
與實施例6相比除了步驟4中輔助因子為0.01-0. 4mM Fe3+不同夕卜，其他皆相同。
8
實施例9
與實施例6相比除了步驟4中輔助因子為0. 05-0. 6mM -ALA和0. 01-0. 4mM Fe3+混合 物不同外，其他皆相同。實施例10
將實施例6-9所生成的重組POR蛋白，利用細胞色素C分析法檢測POR蛋白活力 在Icm光徑的比色皿中加入0. 84ml的還原酶分析緩沖液，然后加入0. Iml 0. 8 mM細 胞色素C，再加入20μ1稀釋適當倍數(shù)的微粒體懸液，混勻后測定blank，然后加入50μ1 4mM 的NADPH，用封口膜封口后，迅速混勻，立即用紫外分光光度計的kinetic/time模式檢測3 分鐘內(nèi)550nm處的吸光值變化，再依據(jù)公式計算還原酶活力。結(jié)果P0R蛋白表達及活性的條件優(yōu)化
比較了不同濃度的Hemin、5-ALA、Fe3+對POR表達活性的影響，如圖3所示，在加入 0. 5 μ g/ml Hemin,0. 2mM 5-ALA或0. 02 mM Fe3+時，POR蛋白表達活性比其他濃度各輔助 因子高(圖3. A，B，C)。相對單獨加入0. 2mM 5-ALA或0. 02 mM Fe3+，同時加入0. 2mM 5-ALA 和0. 02mM Fe3+時，POR蛋白的表達活性最高(圖3. D)。實施例11
將實施例1步驟1-3獲得的重組真核表達病毒Ac-Bacmid-CYP 2A13，在輔助因子為 0. 05-0. 6mM -ALA和0. 01-0. 4mM Fe3+混合物時，通過加入MOI為1-5 pfu/細胞，按實施例 1步驟4的方法表達CYP2A13蛋白，并運用免疫印跡法進行鑒定。實施例12
將實施例6步驟1-3獲得的重組真核表達病毒Ac-Bacmi d-POR，在輔助因子為 0. 05-0. 6mM -ALA和0. 01-0. 4mM Fe3+混合物時，通過加入MOI為1-6 pfu/細胞，按實施例 6步驟4的方法表達POR蛋白，并運用免疫印跡法進行鑒定。實施例13
在輔助因子為0. 05-0. 6mM -ALA和0. 01-0. 4mM Fe3+混合物時，將實施例1步驟1-3 獲得的重組真核表達病毒Ac-Bacmid-CYP 2A13和實施例6步驟1_3獲得的重組真核表達 病毒Ac-Bacmid-POR，按照CYP2A13-M0I和POR-MOI的比例為5/0-5/6進行配比，按實施例 1步驟4的方法聯(lián)合表達CYP2A13蛋白和POR蛋白。運用免疫印跡法進行鑒定CYP2A13蛋 白，運用實施例10的方法測定POR蛋白活力。結(jié)果CYP2A13和POR蛋白共表達的條件優(yōu)化
在直徑為15cm的平皿中接種3X IO7/皿的Sf9細胞，待細胞貼壁后分別加入不同MOI 的CYP2A13和POR病毒，加入0. 02mM Fe3+禾口 0. 2mM 5-ALA，27 °C培養(yǎng)，以表達有活性的 CYP450蛋白和POR蛋白。圖4A和B所示，經(jīng)免疫印跡檢測，發(fā)現(xiàn)在分子量72 kD和45 kD位置顯示有目的 蛋白表達，當CYP2A13 MOI為5pfu/細胞、POR MOI為2 pfu/細胞時，CYP2A13和POR蛋白 表達最高。選擇CYP2A13 MOI為5pfu/細胞，用不同MOI的POR病毒在Sf9細胞中共表達 CYP2A13和POR蛋白。結(jié)果顯示不同MOI的POR病毒對CYP2A13蛋白表達未有影響(圖4. C)。雖然POR活性在相同條件下較單獨表達的要低，但隨著共表達中POR的MOI的升高出 現(xiàn)遞增趨勢，在MOI為6pfu/細胞時，已基本達到了較高水平，完全可滿足體外代謝活性分 析的要求(圖4. D)。
權利要求
1.一種改進細胞色素P450酶家族體外表達的方法，其特征在于在步驟D所述的輔助 因子為如下任意一種① 0. 5-6 μ g/ml Hemin ；② 0. 05-0. 6mM 5-ALA ；③ 0. 01-0. 4mM Fe3+ ； ④ 0. 05-0. 6mM -ALA 和 0. 01-0. 4mM Fe3+ 混合物；具體制備方法如下A、重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacl-CYPs/POR質(zhì)粒的構建與鑒定雙酶消化重組質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) /POR和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pFastBac 1，經(jīng)1%瓊脂糖 凝膠電泳分離后，回收目的片段；用T4 DNA連接酶連接回收的POR基因與載體pFastBac 1片段，構建重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒PFastBacl-POR ；經(jīng)氨芐青霉素抗性平板篩選，獲得含 重組質(zhì)粒的大腸桿菌，提取菌液DNA，獲得重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒DNA ；使用雙酶切消化驗證 pFastBacl-CYP2A13 禾口 pFastBacl-POR ；B、重組真核表達病毒Ac-Bacmid-CYPs/PORDNA的構建與鑒定將已構建好的pFastBac 1-CYPs/POR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細胞，在 DHlOBac大腸桿菌的助手質(zhì)粒Helper輔助下經(jīng)Tn7轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座，將各CYPs/POR的基因片段 插入穿梭載體Bacmid中，經(jīng)卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素三抗篩選和藍白斑篩選，得到重 組 Ac-Bacmid-CYPs/POR DNA，用 PCR 反應進行驗證；C、重組真核表達病毒Ac-Bacmid-CYPs/P0R的獲得在6孔板接種9 X IO5個細胞/孔，27°C貼壁Ih ；現(xiàn)配桿粒DNA與Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑 復合物對細胞進行轉(zhuǎn)染，27°C孵育證后，加入anl Sf-900 II SFM培養(yǎng)液含青霉素100 IU/ ml ；鏈霉素100 μ g/ml，27°C孵育7 或直到看到病毒感染的跡象為止；收取含有目的基因 的第一代重組病毒液，再用此病毒液感染Sf9細胞，收取第二代重組病毒液，可以保存?zhèn)溆?或感染Sf9細胞以得到更高效價的病毒液；D、重組CYP450s/P0R蛋白的表達使用重組病毒液感染Sf9細胞，加入輔助因子，以表達有活性的CYP450蛋白；感染后 72小時收集細胞，超聲破碎細胞，然后差速離心分離出細胞中的微粒體蛋白，分裝后-80°C 保存?zhèn)溆茫灰钥蛰d體病毒感染細胞表達的蛋白做陰性對照，進行SDS-PAGE電泳，以免疫印 跡法檢測CYP2A13和POR蛋白的表達，使用掃描儀掃描Immunoblotting條帶，用Image J 1. 43軟件對條帶進行灰度值分析；E、CO-差示光譜法檢測CYP450蛋白活性采用CO差示光譜法檢測CYP450蛋白酶活性微粒體懸液用微粒體蛋白稀釋緩沖液稀 釋至lmg/ml，取Iml加入到Icm光徑的比色皿中，然后加入適量的保險粉，用封口膜封口混 勻后測定blank，緩慢通入CO 2分鐘，混勻使CO與微粒體充分接觸，然后在紫外分光光度計 的wavelength scan模式下掃描400nm至550nm處的吸收光譜，再依據(jù)相關公式計算微粒 體蛋白中CYP450蛋白的含量；F、細胞色素C分析法檢測POR蛋白活力在Icm光徑的比色皿中加入0. 84ml的還原酶分析緩沖液，然后加入0. Iml 0. 8 mM細 胞色素C，再加入20μ1稀釋適當倍數(shù)的微粒體懸液，混勻后測定blank，然后加入50μ1 4mM 的NADPH，用封口膜封口后，迅速混勻，立即用紫外分光光度計的kinetic/time模式檢測3 分鐘內(nèi)550nm處的吸光值變化，再依據(jù)公式計算還原酶活力。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種改進細胞色素P450酶家族體外表達的方法，其特征在于步驟D所述的輔助因子為0. 2 mM 5-ALA與0. 02mM Fe3+混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及細胞色素P450酶，特別涉及一種改進細胞色素P450酶家族體外表達的方法。一種改進細胞色素P450酶家族體外表達的方法，其特征在于在步驟D所述的輔助因子為如下任意一種①0.5-6μg/mlHemin；②0.05-0.6mM5-ALA；③0.01-0.4mMFe3+；④0.05-0.6mM-ALA和0.01-0.4mMFe3+混合物，首次對CYP蛋白、POR蛋白及其共表達的條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同時給予0.02mMFe3+和0.2mM5-ALA處理細胞，上述蛋白表達水平及其活性最高。CYP的MOI為5pfu/細胞、POR的MOI為2pfu/細胞時，兩者的共表達效率最高。
文檔編號C12Q1/26GK102094000SQ20101058835
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權日2010年12月15日
發(fā)明者王守林, 陸慧媛 申請人:南京醫(yī)科大學