專利名稱：月季RcLEA編碼序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)以及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在月季中表達(dá)的 RcLEA (月季胚胎發(fā)育后期豐富蛋白，Rosa chinensis late-embryogenesis-abundant protein, RcLEA)蛋白基因的克隆，基因表達(dá)模式分析，轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建，大腸桿菌的轉(zhuǎn) 化，轉(zhuǎn)基因菌株的獲得及其非生物脅迫耐性的鑒定。
背景技術(shù)：
由于“溫室效應(yīng)”現(xiàn)象日益明顯，全球氣溫持續(xù)升高，夏季高溫已成為制約植物生 長(zhǎng)和發(fā)育的主要環(huán)境因子，植物生長(zhǎng)發(fā)育面臨高溫逆境的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。胚胎發(fā)育后期豐富蛋 白(LEA)是生物體中廣泛存在的一類與滲透調(diào)節(jié)有關(guān)的家族蛋白。研究發(fā)現(xiàn)在植物胚胎發(fā) 育晚期，LEA蛋白表達(dá)量十分豐富，而且在環(huán)境脅迫如干旱、低溫、鹽脅迫、ABA、紫外輻射和 NaHC03等條件下LEA蛋白mRNA也會(huì)大量累積，被認(rèn)為是在脅迫過(guò)程中對(duì)植物起保護(hù)作用的 物質(zhì)之一。LEA蛋白在細(xì)胞中分布廣泛，具有很高的親水性和熱穩(wěn)定性，即使在煮沸條件下 也能保持水溶狀態(tài)，起穩(wěn)定細(xì)胞膜、分子屏障、離子結(jié)合和防止氧化等作用。在沒(méi)有脅迫或激素處理的條件下，擬南芥中的一些Zi^基因表現(xiàn)出組成型表達(dá)特 性；在干旱、冷和鹽脅迫條件下，部分^擬基因可被脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)。月季RcLEA基因?yàn)?熱激誘導(dǎo)表達(dá)，但在高溫脅迫條件下，RcLEA只在耐熱月季品種中強(qiáng)表達(dá)，而在不耐熱品種 中弱表達(dá)甚至不表達(dá)，該基因的表達(dá)與否與月季品種的田間耐熱性差異觀察結(jié)果相吻合。大豆LEA蛋白Em的表達(dá)可提高大腸桿菌和轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性，自1981年Dure 等在棉花子葉中報(bào)告LEA蛋白以來(lái)，在許多植物的種子、花粉粒和受干旱脅迫的幼苗營(yíng) 養(yǎng)組織中，發(fā)現(xiàn)LEA蛋白可高水平表達(dá)，且表達(dá)水平與植物細(xì)胞的抗逆性有著密切的關(guān) 系.目前關(guān)于LEA蛋白的抗脅迫研究已經(jīng)積累了一些資料.如Cheng等將小麥PMA1959 (LEA1 )基因轉(zhuǎn)化水稻，使轉(zhuǎn)基因水稻的脫水耐鹽能力得到增強(qiáng)。利用酵母細(xì)胞與植物細(xì) 胞在一些耐鹽反應(yīng)上的相似性；Swire-Clark將小麥Em基因(LEAl)轉(zhuǎn)化酵母，證明了 單一 LEA蛋白在提高重組酵母對(duì)高濃度NaCl、KCl和低溫脅迫的耐受性中起著直接作用。 蔡丹等(2006)將大豆Em基因(LEAl)轉(zhuǎn)化大腸桿菌和煙草，證明了大豆Em蛋白的過(guò)量 表達(dá)不僅對(duì)提高重組菌耐鹽性有著直接的貢獻(xiàn)，也可提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)高鹽脅迫的耐受 性.這一結(jié)果與前人在水稻和酵母中得到的結(jié)果一致，為前人提出的假說(shuō)，即“LEA蛋白 在原核生物和真核細(xì)胞中可能采取相似的抗逆保護(hù)機(jī)制”提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，也表明大腸桿 菌異源表達(dá)體系是研究LEA蛋白耐鹽機(jī)制的簡(jiǎn)單、快捷、有效的體系.。隨著生活水平的提高，園林觀賞植物越來(lái)越受到人們關(guān)注，研究觀賞植物對(duì)溫度 逆境抗性的遺傳機(jī)制有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明研究了一種從月季中克隆的胚胎發(fā)育后期豐富蛋白基因，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后 提高轉(zhuǎn)基因菌株對(duì)高溫、低溫及其它非生物脅迫耐性的技術(shù)，應(yīng)用該技術(shù)不僅可以提高原 核生物的溫度抗性，而且預(yù)期可以提高轉(zhuǎn)基因植物的溫度抗性。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報(bào)道過(guò)本發(fā)明申請(qǐng)中提及的月季序列及其核酸序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的就是提供一種新的月季基因ID NO. 1)，該基因是一 個(gè)胚胎發(fā)育后期豐富蛋白基因。本發(fā)明的第二目的是提供這種月季胚胎發(fā)育后期豐富蛋白R(shí)cLEA編碼序列在利 用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高大腸桿菌對(duì)多種非生物脅迫耐受性的應(yīng)用。本發(fā)明一方面從月季分離出了一種DNA分子，其核苷酸序列見(jiàn)SEQ ID NO. 1所示。 它是一種胚胎發(fā)育后期豐富蛋白基因，該基因長(zhǎng)度為981bp。本發(fā)明另一方面得到了一種蛋白質(zhì)分子，它編碼具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸 序列的多肽，由3 個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為36068. 98道爾頓，pi為4. 526。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)TfcZi^mRNA表達(dá)模式的方法，其步驟如下
(1)耐熱性能差異顯著的兩個(gè)月季品種二年生嫁接苗于25°C常溫及38°C熱激處理 2. 5—3. 5小時(shí)，分別提取它們嫩葉的總RNA (植物RNAout試劑盒，市售)。(2)利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(市售)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后根據(jù)TfcZ擬的開放讀 框的第1-20,962-981的特異序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR。本發(fā)明還提供上述編碼月季胚胎發(fā)育后期豐富蛋白R(shí)cLEA在提高月季多種非生 物脅迫耐受性方面的應(yīng)用。具體是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將編碼月季胚胎發(fā)育后期豐富蛋白 RcLEA的核苷酸序列轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，使轉(zhuǎn)基因菌株耐受非生物脅迫性能增加。其步驟如 下
(1)將編碼具有月季TfcZi^基因的開放閱讀框可操作地連接于原核表達(dá)載體，形成含 有該基因的原核表達(dá)重組載體；
(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌細(xì)胞；
(3)通過(guò)篩選如抗生素篩選，PCR鑒定，獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞并最終再生轉(zhuǎn)基因菌株。轉(zhuǎn)基因 菌株耐受非生物脅迫性能增加。具體操作步驟為
(1)將TfcZi^基因的開放閱讀框可操作地連接于原核表達(dá)載體，形成含有該基因的原 核表達(dá)重組載體；
(2)將步驟(1)中的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌細(xì)胞。將含重組表達(dá)載體的大腸桿菌 在液體LB (Amp+，終濃度為100mg/L)振蕩培養(yǎng)(37°C，220rpm)至OD600=O. 6 ；加入IPTG (終 濃度為1 mmol/L)后在相同條件下振蕩培養(yǎng)2小時(shí)，0D600達(dá)1. 0，將菌液作如下處理(1) 取菌液稀釋至1000 Cell/ml，吸取其中100ml進(jìn)行涂板(LB，Amp+)，4°C，分別暗培養(yǎng)0、2、 4、6、8、12天后轉(zhuǎn)至37°C過(guò)夜暗培養(yǎng)，計(jì)算菌落數(shù)；
(3)將菌液轉(zhuǎn)至50°C搖床，220rpm分別培養(yǎng)0、1、2、3、4、5小時(shí)，菌液稀釋至1000 Cell/ml，吸取其中100ml進(jìn)行涂板(LB，Amp+)，37°C過(guò)夜暗培養(yǎng)，計(jì)算菌落數(shù)。上述步驟 (2)、(3)均以轉(zhuǎn)空載菌株作平行對(duì)照；
(4)將含有重組表達(dá)載體(Li、L2，平行樣)、轉(zhuǎn)空載(EV)BL21重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培 養(yǎng)2 h至OD6tltl達(dá)1.0，野生型BL21 (WT)菌株于LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)作平行對(duì)照；4500 rpm離心5 min,無(wú)菌水重懸菌體，調(diào)OD6tltl至1. 0 ；以接種環(huán)取菌液于含有不同抗性的LB板上由里向外劃“Z”線涂布，37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)勢(shì)；固體LB中分別加入下列試劑 以制作不同抗性的 LB 板① 100、200、300、400 mmol/L LiCl，② 400、500、550、600 mmol/L NaCl，③ 10、15、20、25 mmol/L Na2CO3,@300、350、400、450 mmol/L CdCl2, 200、300、400、 500 m mol/L H2O2。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“月季RcLEA基因的開放閱讀框”指編碼完整的月季RcLEA蛋白 的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1中第1 一 981位的核苷酸序列。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒等。在本發(fā)明中，還提供用于鑒定含重組子的大腸桿菌陽(yáng)性克隆的核酸分子，它包含 SEQ ID NO. 1所示的DNA分子中1-20個(gè)連續(xù)的核苷酸和962-981個(gè)連續(xù)核苷酸的反向互補(bǔ) 序列。在本發(fā)明中，還提供用于檢測(cè)樣品中是否存在月季TfcZi^基因核苷酸序列的方 法，它包括用前述核苷酸序列與樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后檢測(cè)是否擴(kuò)增出目的片段。樣品為 轉(zhuǎn)基因大腸桿菌菌株。表1為本發(fā)明的月季RcLEA與杏iFrunus armeniaca ) PaLEA的核苷酸序列 (GenBank Accession No. AF071894)的同源性比較(FASTA)表。表2為本發(fā)明的月季RcLEA與杏PaZ擬的氨基酸序列(GenBank Accession No. AAC24588. 1)的同源性比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字 符標(biāo)出，相似的氨基酸用“ + ”標(biāo)出。


圖1為RT-PCR鑒定月季TfcZ擬基因的表達(dá)模式。其中，NT-常溫；HT-高溫；KP-‘新 十全’、SM- ‘曼海姆宮殿’、LV- ‘賭城’。ACTIN為內(nèi)參。圖2為含重組子和空載的菌株對(duì)4°C低溫的不同耐性。圖3為含重組子和空載的菌株對(duì)50°C高溫的不同耐性。圖4為含重組子和空載的菌株及野生菌株對(duì)多種非生物脅迫的不同耐性。其中， EV是轉(zhuǎn)入空載體的菌株，WT是野生型菌株，Li、L2魏XRcLEA的菌株。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī) 條件，例如 Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(New York Co Id Spring Harbor Labortary Press, 1989)中所敘述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1月季RcLEA基因的克隆。1.將耐熱性強(qiáng)的月季品種‘曼海姆宮殿’ QSchloss mannieim )(以下簡(jiǎn)稱‘曼海 姆’)和耐熱性弱的‘新十全’ (Kordes' Perfecta)進(jìn)行38°C熱激3小時(shí)，提取葉片的可溶 性總蛋白，采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳，雙向電泳后對(duì)其中差異明顯的1個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn) 行肽質(zhì)量指紋譜的分析，并檢索不同的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定與功能預(yù)測(cè)，結(jié)合分析軟件 分析的表觀等電點(diǎn)、分子量和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果進(jìn)行綜合分析，初步認(rèn)定此蛋白質(zhì)點(diǎn)為L(zhǎng)EA。2.提取熱激處理后的‘曼海姆’嫩葉總RNA，提取試劑盒為植物RNAout (市售)，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(市售)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)古老玫瑰LEA (GenBank Accession NO.BI978651)部分同源序列設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR方法從‘曼海姆，cDNA中擴(kuò)增出一條 721bp的條帶。將PCR產(chǎn)物回收，連接到T-載體上，用SP6和T7做為通用引物進(jìn)行測(cè)序。 將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)，BLAST結(jié)果表明該序列和其他物種中相應(yīng)的胚胎發(fā) 育后期豐富蛋白基因序列高度保守。在該片段序列中設(shè)計(jì)3對(duì)反向PCR引物。3.基因組DNA的提取
取‘曼海姆’嫩葉片，研成液氮粉，立即加入預(yù)熱的提取緩沖液，65°C保溫25min，離心， 上清以等體積的氯仿/異戊醇04/1)抽提2次，以乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌兩次，最后 用TE溶解DNA ；加入RNaseA (0. 5 μ g/ml)，65°C消化RNA Ih ；用0. 8%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA 的質(zhì)量。4.用限制性內(nèi)切酶5 / I對(duì)基因組DNA進(jìn)行充分酶切，純化并回收酶切后的片段， 以T4連接酶催化片段首尾自連成環(huán)。以自連后的片段作反向PCR模板，以上述3對(duì)反向引 物進(jìn)行三輪巢式PCR，獲得一條1190bp片段，回收、純化，連接到T-載體上，測(cè)序，序列分析 后獲得基因的5’端序列。5. 3，-RACE 獲得 WcLFA 基因 3，端
用3’ -RACE反轉(zhuǎn)錄試劑盒(市售)將‘曼海姆’嫩葉總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作3’ -RACE 模板，以上述3對(duì)反式PCR引物的正向引物(5 ’ -3 ’)分別與3 ’ -RACE弓丨物AUAP配對(duì)進(jìn)行 三輪巢式PCR ；回收獲得的536bp片段，純化，連接到T-載體上，測(cè)序，序列分析后獲得基因 的3’端序列。6.全長(zhǎng)基因的克隆
根據(jù)基因5’、3’端序列設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR方法從‘曼海姆’ cDNA中擴(kuò)增出一條 981bp的條帶。將PCR產(chǎn)物回收，連接到T-載體上，用T7做為通用引物進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序 結(jié)果提交至NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)，BLAST結(jié)果表明該序列和其他物種中相應(yīng)的胚胎發(fā)育后期 豐富蛋白序列高度保守。實(shí)施例2月季ZfcZ擬基因的序列信息與同源性分析。本發(fā)明新的月季/fcZ擬基因長(zhǎng)度為981 bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO. 1。該基因編 碼的多肽由3 個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為36068. 98道爾頓，pi為4. 526。詳細(xì)序列見(jiàn) SEQ ID NO. 2。將月季TfcZ擬全長(zhǎng)基因的編碼區(qū)序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列用BLAST程序 在 Non — redundant GeneBank + EMBL+DDBJ+PDB 禾口 Non — redundant GeneBank CDS translations + PDB+SwissPort + Superdate + PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性 檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與杏/ ^/ 存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它與杏/ ^/ 基因的 mRNA編碼序列(GenBank Accession No. AF071894)有一定的同源性(見(jiàn)表1)，在氨基酸水 平上，它與杏I^aLEA蛋白的氨基酸殘基有88%的相似性(見(jiàn)表2)。由上可見(jiàn)，該月季TfcZ擬 基因與杏/ ^擬基因存在較高的同源性。實(shí)施例3月季ZfcZ擬表達(dá)模式分析。用RT — PCR的方法檢測(cè)
分別取25°C (常溫)及38°C熱激汕的‘曼海姆’、‘賭城，(Las vegas)和‘新十全’嫩 葉提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后根據(jù)ZfcZi^基因特異序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，進(jìn)行PCR。電泳之后，用相對(duì)定量軟件(天呈公司)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，常溫下，RcLEA在三個(gè)月季品種中 均不表達(dá)，熱激后在耐熱品種‘曼海姆’、‘賭城’表達(dá)而‘新十全’不表達(dá)(圖1)。實(shí)施例4月季ZfcZ擬基因在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)。含目的基因(月季TfcZ擬)表達(dá)載體的構(gòu)建
根據(jù)月季/？^擬基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增除終止子TAA之外的編碼閱讀框，并在 正、反向引物上分別引入限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)fee I和5 / I，以便構(gòu)建原核表達(dá)載體。 以實(shí)施例1中獲得的‘曼海姆’ cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將月季TfcZ擬基因正向克隆到 原核表達(dá)載體PET3M中，在保證閱讀框架的前提下，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中進(jìn)行原核表 達(dá)。實(shí)施例5月季RcLEA基因提高大腸桿菌對(duì)多種非生物脅迫的抗性。(1)低溫脅迫。將含重組表達(dá)載體的大腸桿菌在液體LB (Amp+)中培養(yǎng)，取菌液稀 釋至1000 Cell/ml，吸取其中IOOml進(jìn)行涂板(LB, Amp+)，4°C，分別暗培養(yǎng)0、2、4、6、8、12 天后轉(zhuǎn)至37°C過(guò)夜暗培養(yǎng)，計(jì)算菌落數(shù)。在各個(gè)時(shí)間段，轉(zhuǎn)ZfcZi^的菌株活力都高于轉(zhuǎn)入空 載的菌株(圖2)。(2)高溫脅迫。將菌液轉(zhuǎn)至50°C搖床，220 rpm分別培養(yǎng)0、1、2、3、4、5小時(shí)，菌液 稀釋至1000 Cell/ml，吸取其中IOOml進(jìn)行涂板(LB，Amp+)，37°C過(guò)夜暗培養(yǎng)，計(jì)算菌落數(shù)。 除處理5小時(shí)，全部死亡外，其他高溫處理后，轉(zhuǎn)TfcZ擬的菌株活力都高于轉(zhuǎn)入空載的菌株 (圖 3)。(3)將含有重組表達(dá)載體(Li、L2，平行樣)、轉(zhuǎn)空載(EV) BL21重組菌株，野生型 BL21 (WT)菌株，以接種環(huán)取菌液于含有不同脅迫的LB板上由里向外劃“Z”線涂布，37 V 過(guò)夜培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)勢(shì)；固體LB中分別加入下列試劑以制作不同脅迫的LB板①100、 200,300,400 mmol/L LiCl，② 400、500、550、600 mmol/L NaCl，③ 10、15、20、25 m mmol/L Na2CO3,④ 300、350、400、450 mmol/L CdCl2，⑤ 200、300、400、500 m mol/L H202。與野生型 和空載相比，L1、L2對(duì)這些脅迫的抗性明顯提高(圖4)。表 1
月季TfcZi^基因核苷酸序列與杏/ ^/ 基因核苷酸序列的同源性比較 F071894. 11AF071894 Prunus armeniaca late embryogenesis-like protein (LEA) mRNA,
partial cdsLength=993
Score = 910 bits (1008)， Expect =0.0
Identities = 672/784 (85%), Gaps = 0/784 (0%) Strand=Plus/Plus
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，是月季基因，長(zhǎng)度為981bp，其核苷酸序 如 SEQ ID NO. 1 所示。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，其編碼具有SEQID NO. 2所示的氨基酸 序列的多肽。
3.—種如權(quán)利要求1所述的DNA分子在提高轉(zhuǎn)基因菌株非生物脅迫耐性方面的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于具體操作步驟為(1)將編碼具有月季TfcZi^基因的開放閱讀框可操作地連接于原核表達(dá)載體，形成含 有該基因的原核表達(dá)重組載體；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌細(xì)胞；(3)通過(guò)篩選，獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞并最終再生轉(zhuǎn)基因菌株，該轉(zhuǎn)基因菌株耐受非生物脅迫性 能增加。
5.一種用于鑒定含重組子的大腸桿菌陽(yáng)性克隆的核酸分子，其特征在于，它包含SEQ ID NO. 1所示的DNA分子中1-20個(gè)連續(xù)的核苷酸和962-981個(gè)連續(xù)核苷酸的反向互補(bǔ)序 列。
6.一種用于檢測(cè)樣品中是否存在月季ZfcZi^基因核苷酸序列的方法，其特征在于它包 括用權(quán)利要求5所述核苷酸序列與樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后檢測(cè)是否擴(kuò)增出目的片段；樣品 為轉(zhuǎn)基因大腸桿菌菌株。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體提供了一種在月季中表達(dá)的RcLEA編碼序列及其在提高大腸桿菌BL21溫度耐受性的應(yīng)用。本發(fā)明包括含有上述基因的重組表達(dá)載體及表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21。本發(fā)明將所說(shuō)基因在原核生物(大腸桿菌BL21)中表達(dá)，所獲得的大腸桿菌BL21多種非生物脅迫耐性顯著提高。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102094028SQ20101059178
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者張璇, 明鳳, 胡永紅, 蔣昌華 申請(qǐng)人:上海植物園, 復(fù)旦大學(xué)