專利名稱：一種檢測(cè)蟲媒腦炎病毒的新技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體而言涉及腦炎病毒的檢測(cè)方法。本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)腦炎病毒的擴(kuò)增引物和延伸引物，以及包含這些引物的試劑盒。
背景技術(shù)：
蟲媒病毒性腦炎是由嗜神經(jīng)性蟲媒病毒引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。嗜神經(jīng)性蟲媒病毒是一組以吸血昆蟲為傳播媒介的病毒，其中多種病毒可以造成急性腦炎，該疾病非常危險(xiǎn)，病死率高，會(huì)造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。嗜神經(jīng)性蟲媒病毒主要包括黃病毒屬 (Flavivirus)的日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)和圣路易腦炎病毒(St. Louts encephalitis virus, StLEV)、蝶傳腦炎病毒(tick-borne encephalitis virus, TBEV)和西尼羅病毒(West Nile virus, WNV)；甲病毒屬(Alphavirus)的東方馬腦炎病毒(eastern equine encephalomyelitis virus ;EEEV)、西方馬腦炎病毒 (western equine encephalomyelitis virus, WEEV)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine Encepha-Iomyelitis virus, VEEV)禾口彈狀病毒禾斗(Rhabdoviriade)狂犬病毒屬 (Lyssavirus)的狂犬病毒(Rabi es virus, RabV)等。蟲媒腦炎病毒致病力強(qiáng)、病情嚴(yán)重、病死率高。目前實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有以下幾種(一)特異性IgM檢測(cè)病毒感染發(fā)病早期即產(chǎn)生特異性IgM，病后2 3周達(dá)到高峰，故單份血清可做出早期診斷。( 二)常規(guī)血清學(xué)試驗(yàn)1.血凝抑制試驗(yàn)雖然敏感性較高，但特異性較低。2.補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合抗體僅存在于IgG中，病后出現(xiàn)遲，容易延誤診斷。3.中和試驗(yàn)中和試驗(yàn)特異性和敏感性都高，但操作繁雜，需用大量動(dòng)物或組織培養(yǎng)管，需時(shí)較久，不適于臨床診斷常規(guī)使用。(三)病毒分離與鑒定體外病毒培養(yǎng)一般較難，且需要周期較長(zhǎng)。敏感性低。(四)病毒RNA檢測(cè)目前較常使用RT-PCR的方法對(duì)病毒RNA進(jìn)行檢測(cè)，但是較難達(dá)到多重檢測(cè)。目前也有一些研究通過質(zhì)譜原理進(jìn)行多重的病毒檢測(cè)。原理通過在PCR擴(kuò)增引物上加入不同質(zhì)量的特異序列標(biāo)簽，通過紫外照射使質(zhì)量標(biāo)簽從產(chǎn)物上釋放，最后利用質(zhì)量光譜法進(jìn)行分析。從而通過檢測(cè)到的不同質(zhì)量標(biāo)簽來進(jìn)行鑒定病毒。但是在自動(dòng)化和高通量方面仍然存在阻礙，且操作較復(fù)雜。由于在臨床上蟲媒病毒腦炎的癥狀較相似，因此對(duì)一份樣本進(jìn)行多種病毒的同時(shí)檢測(cè)是很必要的。針對(duì)目前的蟲媒病毒腦炎的診斷現(xiàn)狀，我們希望開發(fā)一種敏感性高，特異性好，可以同時(shí)完成多重檢測(cè)的自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種能夠檢測(cè)常見蟲媒腦炎病毒的方法，所述病毒可選自以下8種蟲媒腦炎病毒日本腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、東方馬腦炎病毒、西尼羅病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、狂犬病毒、圣路易腦炎病毒和蜱傳腦炎病毒。所述方法包括如步驟1)使用擴(kuò)增引物對(duì)對(duì)樣品cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，所述擴(kuò)增引物對(duì)針對(duì)的是每種待檢測(cè)病毒基因組序列的保守區(qū)；2)以步驟1)中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，使用延伸引物通過延伸反應(yīng)，例如單堿基延伸反應(yīng)，獲得延伸產(chǎn)物，優(yōu)選延伸產(chǎn)物與所述延伸引物之間分子量差異不小于9道爾頓， 且各類型的延伸產(chǎn)物間的分子量差異不小于30道爾頓，所述延伸引物針對(duì)的是擴(kuò)增引物所擴(kuò)增序列中相對(duì)保守的區(qū)域；3)用質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)所述延伸產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)確定樣品的譜峰，通過將所述譜峰與延伸引物分子量及對(duì)應(yīng)延伸產(chǎn)物分子量信息比對(duì)(例如，使用由Sequenom公司提供的 Typer4. 0分析軟件進(jìn)行比對(duì))確定待檢測(cè)的腦炎病毒的具體類型，優(yōu)選用基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)所述延伸產(chǎn)物或純化的延伸產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，所述譜峰和所述擴(kuò)增引物對(duì)和延伸引物信息優(yōu)選被導(dǎo)入Typerf. 0分析軟件(由Sequenom公司提供)中以進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，還優(yōu)選在步驟1和步驟2)之間包括除dNTP步驟除去所述擴(kuò)增產(chǎn)物中的dNTP ；并且/或者還優(yōu)選在步驟2和步驟3)之間包括純化步驟純化所述延伸反應(yīng)的延伸產(chǎn)物以獲得純化的延伸產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，不除去擴(kuò)增產(chǎn)物中的 dNTP可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，但除去擴(kuò)增產(chǎn)物中的dNTP在優(yōu)選單堿基延伸方案中可以排除未消耗dNTP對(duì)延伸反應(yīng)的影響。并且純化延伸產(chǎn)物也不是實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所必須，但純化延伸產(chǎn)物可以有利于質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)延伸產(chǎn)物分析，從而得到更加高質(zhì)量的譜峰。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法所使用的擴(kuò)增引物對(duì)的核苷酸序列包含SEQ ID NO :1 禾口 2、SEQ ID NO 3 禾口 4、SEQ ID NO 5 禾口 6、SEQ ID NO 7 禾口 8、SEQ ID NO 9 禾口 10、 SEQ ID N0:11 和 12、SEQ ID N0:13 禾口 14 以及 SEQ ID N0:15 禾口 16 中的一對(duì)或多對(duì)。在一些實(shí)施方案中，在所述擴(kuò)增引物的5'端還包含標(biāo)簽序列，例如SEQ ID N0:25。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法所使用的延伸引物的核苷酸序列包含SEQ ID N0:17-24中的一個(gè)或多個(gè)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，樣品選自腦脊液、血清、全血、純病毒培養(yǎng)物和攜帶此類病毒媒介生物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，待檢測(cè)的蟲媒腦炎病毒選自日本腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、東方馬腦炎病毒、西尼羅病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、狂犬病毒、圣路易腦炎病毒和蜱傳腦炎病毒中的一種或多種。采用本方法解決了目前的檢測(cè)方法靈敏度低，特異性差，很難做到多重檢測(cè)，成本高，周期長(zhǎng)，自動(dòng)化程度低的缺陷。與目前的檢測(cè)方法相比，本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1)使用的試劑耗材相對(duì)簡(jiǎn)單且穩(wěn)定，不需要使用熒光染料、特殊的酶等價(jià)格昂貴的試劑；
2)反應(yīng)可以在微量體系中進(jìn)行，減少了樣品和各種消耗品的使用；3)由于質(zhì)譜技術(shù)直接檢測(cè)DNA的分子量(質(zhì)荷比)且直接確定堿基的類型(即， 不需要經(jīng)過任何形式的信號(hào)轉(zhuǎn)換)，因此，理論上只要有一個(gè)拷貝的擴(kuò)增DNA片段被擴(kuò)增即可識(shí)別，從而具有高的靈敏度；4)質(zhì)譜技術(shù)還有自動(dòng)化、高通量檢測(cè)等特點(diǎn)，因此，質(zhì)譜技術(shù)與多引物延伸技術(shù)相結(jié)合，可以在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)多種蟲媒腦炎病毒，從而大大減少了工作量，提高了檢測(cè)通量。同時(shí)，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了質(zhì)譜技術(shù)，特別是基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)(MALDI-T0F-MS)，通過設(shè)計(jì)一套全新的擴(kuò)增引物對(duì)和延伸引物，實(shí)現(xiàn)了對(duì)上述8種蟲媒腦炎病毒的檢測(cè)。其與其它現(xiàn)有方法相比，能夠同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)出8種蟲媒腦炎病毒(WNV、JEV、StLEV, TBEV, VEEV, EEEV, Rabv和TOEV)，具有高通量、自動(dòng)化、低成本的特點(diǎn)，有顯著的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)8種常見蟲媒腦炎病毒中一種或多種的擴(kuò)增引物對(duì)和/或延伸引物。在一些實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增引物的核苷酸序列包含SEQ ID N0:1和2、SEQ ID NO 3 和 4、SEQ ID NO 5 和 6、SEQ ID NO 7 和 8、SEQ ID NO 9 和 10、SEQ ID NO :11 禾口 12、 SEQ ID NO 13和14以及SEQ ID NO 15禾口 16中的一對(duì)或多對(duì)。在一些實(shí)施方案中，在所述擴(kuò)增引物的5'端還包含標(biāo)簽序列。在一些實(shí)施方案中，所述延伸引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO :17-24中的一個(gè)或多個(gè)。本發(fā)明還涉及包含用于檢測(cè)8種常見蟲媒腦炎病毒中一種或多種的擴(kuò)增引物對(duì)和/或延伸引物的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 1 禾口 2、SEQ ID N0:3 禾口 4、SEQ ID N0:5 禾口 6、SEQ ID N0:7 禾口 8、SEQ ID NO :9 禾口 10、SEQ ID NO : 11禾口 12、SEQ ID NO: 13禾口 14以及SEQ ID NO: 15禾口 16中的一對(duì)或多對(duì)。在一些實(shí)施方案中，在所述擴(kuò)增引物的5'端還包含標(biāo)簽序列。在一些實(shí)施方案中，所述延伸引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 17-24中的一個(gè)或多個(gè)。本發(fā)明中使用標(biāo)簽序列的目的僅是為了增加與標(biāo)簽序列相連的引物序列的分子量，以排除這些引物在后續(xù)試驗(yàn)的影響，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要以及通常的引物設(shè)計(jì)原則選擇使用不同的標(biāo)簽序列，而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。因此，在一些實(shí)施方案中可以使用任何可以達(dá)到上述目的，且不會(huì)與檢測(cè)目的物相互作用的標(biāo)簽序列。在一些實(shí)施方案中，上述的試劑盒中的其他試劑為用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的酶和試劑，用于延伸反應(yīng)的酶和試劑，以及/或者用于純化延伸產(chǎn)物的樹脂。所述延伸反應(yīng)優(yōu)選是單堿基延伸反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及上述的擴(kuò)增引物對(duì)和/或延伸引物用于對(duì)樣品中的蟲媒腦炎病毒進(jìn)行檢測(cè)的用途；或者上述試劑盒用于對(duì)樣品中的蟲媒腦炎病毒進(jìn)行檢測(cè)的用途。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及上述的擴(kuò)增引物對(duì)和/或延伸引物用于制備試劑盒的用途，所述試劑盒用于檢測(cè)樣品中的蟲媒腦炎病毒。以下表1和表2中分別示例性顯示了針對(duì)所述8種常見的蟲媒腦炎病毒的PCR擴(kuò)增引物，以及針對(duì)所述8種蟲媒腦炎病毒的延伸引物。表1 針對(duì)所述8種常見的蟲媒腦炎病毒的PCR擴(kuò)增引物
權(quán)利要求
1.對(duì)樣品中的蟲媒腦炎病毒進(jìn)行檢測(cè)的方法，其包括以下步驟1)使用擴(kuò)增引物對(duì)PCR擴(kuò)增樣品的CDNA，從而獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，所述擴(kuò)增引物對(duì)針對(duì)的是每種待檢測(cè)病毒基因組序列的保守區(qū)；2)以步驟1)中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，使用延伸引物通過延伸反應(yīng)獲得延伸產(chǎn)物，所述延伸引物針對(duì)的是擴(kuò)增引物所擴(kuò)增序列中相對(duì)保守的區(qū)域，所述延伸反應(yīng)優(yōu)選是單堿基延伸反應(yīng)；3)對(duì)所述延伸產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)確定樣品的譜峰，通過將所述譜峰與延伸引物分子量及對(duì)應(yīng)延伸產(chǎn)物分子量信息比對(duì)確定待檢測(cè)的腦炎病毒的具體類型。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在所述步驟1)之后和步驟2)之前還包括除去所述擴(kuò)增產(chǎn)物中的dNTP的步驟，優(yōu)選通過使用蝦堿性磷酸酶(SAP酶)處理所述擴(kuò)增產(chǎn)物來除去dNTP ；
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中在所述步驟2)之后和步驟3)之前還包括純化步驟 純化所述延伸反應(yīng)的延伸產(chǎn)物以獲得純化的延伸產(chǎn)物，優(yōu)選使用離子交換樹脂進(jìn)行純化。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中在所述步驟3)中用基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)所述延伸產(chǎn)物或所述純化的延伸產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述蟲媒腦炎病毒選自日本腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、東方馬腦炎病毒、西尼羅病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、狂犬病毒、圣路易腦炎病毒和蜱傳腦炎病毒中的一種或多種。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述擴(kuò)增引物對(duì)包含SEQID NO 1和2、SEQ ID NO 3 和 4、SEQ ID NO 5 和 6、SEQ ID NO 7 和 8、SEQ ID NO 9 和 10、SEQ ID NO 11 和 12、 SEQ ID NO 13和14以及SEQ ID NO 15和16中的一對(duì)或多對(duì)，或者5，端包含標(biāo)簽序列的 SEQ ID NO 1 禾口 2、SEQ ID NO 3 禾口 4、SEQ ID NO 5 禾口 6、SEQ ID NO 7 禾口 8、SEQ ID NO 9 和 10、SEQ ID NO :11 禾口 12、SEQ ID NO 13 禾口 14 以及 SEQ ID NO :15 和 16 中的一對(duì)或多對(duì)， 其中所述標(biāo)簽序列優(yōu)選是SEQ ID NO :25 ；并且/或者所述延伸引物包含SEQID NO 17-24 中的一個(gè)或多個(gè)。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品選自腦脊液、血清、全血、純病毒培養(yǎng)物和攜帶此類病毒媒介生物。
8.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求6中定義的擴(kuò)增引物對(duì)和/或延伸引物，或者還包含其他試劑，其中所述其他試劑優(yōu)選是用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的酶和試劑，用于延伸反應(yīng)的酶和試劑，以及/或者用于純化延伸產(chǎn)物的樹脂。
9.權(quán)利要求6中定義的擴(kuò)增引物對(duì)和/或延伸引物用于對(duì)樣品中的蟲媒腦炎病毒進(jìn)行檢測(cè)的用途；或者用于制備試劑盒的用途，所述試劑盒用于檢測(cè)樣品中的蟲媒腦炎病毒； 或者權(quán)利要求8的試劑盒用于對(duì)樣品中的蟲媒腦炎病毒進(jìn)行檢測(cè)的用途。
10.SEQ ID NO 1-16任選一項(xiàng)或SEQ ID NO 17-24任一項(xiàng)的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能夠檢測(cè)常見蟲媒腦炎病毒的方法。本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)常見蟲媒腦炎病毒的擴(kuò)增引物和延伸引物，以及包含這些引物的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102199672SQ20101059201
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者劉利成, 吳偉立, 姜永強(qiáng), 康小平, 楊銀輝, 王鵬志, 管彥芳, 陳唯軍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所, 深圳華大基因科技有限公司