專利名稱：快速檢測(cè)人腸道病毒71型的熒光定量pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種引起人類多種疾病病原體基因檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及一種快速檢測(cè) 人腸道病毒71型熒光定量PCR試劑盒，適用于人腸道病毒71型的定性定量檢測(cè)。
背景技術(shù)：
人腸道病毒71 型(Enterovirus 71,EV71)屬于小 RNA 病毒科(Picornaradae)腸 道病毒屬(Enterovirus)，同一屬的病毒還有脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒和?？刹《镜?。 這類病毒通過在人體的消化道組織中侵襲與繁殖后經(jīng)過血液循環(huán)傳播，而最終導(dǎo)致多種臨 床病征。EV71最初于1969年由khmidt等從美國(guó)加利福尼亞州1名9個(gè)月大的腦炎患兒 的腦脊液中分離出，1972年定出血清型，并于1974年首次報(bào)道。自報(bào)道以來，該病毒在世界 范圍內(nèi)引起十多次爆發(fā)與流行，因而受到了人們的廣泛關(guān)注。EV71感染多呈隱性，顯性表現(xiàn) 輕微者可導(dǎo)致手足口病、腹瀉、皮疹、無菌性腦膜炎、腦炎、心肌炎，嚴(yán)重者可表現(xiàn)為急性弛 緩性癱瘓、全腦炎、肺水腫或出血等，最終可導(dǎo)致死亡。因此，準(zhǔn)確及時(shí)地診斷EV71對(duì)指導(dǎo)臨床治療、評(píng)估疾病的發(fā)展和預(yù)后具有重大意 義。近年來發(fā)展起來的熒光定量PCR(FluorescenceQuantitative PCR，F(xiàn)Q_PCR)技術(shù) 以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在基因表達(dá)水平分析(Eng Lee Tan,Li Li Gaynor Yong，Rapid detection of Enterovirus 71 by real-time TaqManRT-PCR[J]. Journal of Clinical Virology 42(2008)203-206 ；)和定量檢測(cè)(Singh S，Chow VTK，Wioon MC，Chan KP，Poh CL(2002)Direct detection of enterovirus 71(EV71)in clinical specimens from a hand， foot and mouth disease outbreak in Singapore by reverse transcription-PCR with universal enterovirus and EV71_specific primers. J Clin Microbiol 40 :2823-2827 ；Tan ELiChow VTK，Kumarasinghe GiLin RTPiMackay IMiSloots TP， Poh CL(2006)Specific detection of Enterovirus 71 directly from clinical specimens using real-time RT-PCR hybridization probe assay. Mol Cell Probes 20: 135-140.)等方面得到廣泛應(yīng)用，并且已經(jīng)成為當(dāng)前病毒核酸定量的主要方法，國(guó)內(nèi)目前已 有關(guān)于丙肝、乙肝、淋球菌、支原體、衣原體、艾滋病和結(jié)核定量檢測(cè)的試劑盒上市。臨床檢測(cè)上傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和血清學(xué)方法具有靈敏度低、特異性差、假陽(yáng)性、耗時(shí)費(fèi) 力等缺點(diǎn)；常規(guī)PCR法雖然有簡(jiǎn)便、快速、靈敏的優(yōu)勢(shì)，但是有不能精確定量和PCR后處理 產(chǎn)生污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性等問題；因此隳待開發(fā)一種精確、靈敏、快速和無污染的臨床檢驗(yàn)方 法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，提供一種快速檢測(cè)人腸道病 毒71型的熒光定量PCR試劑盒。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
一、PCR 試劑盒該試劑盒包括RNA提取液(即TRIZOL核酸抽提試劑)、熒光定量PCR反應(yīng)液、EV71 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-EV71和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；1、熒光定量PCR反應(yīng)液含有人腸道病毒71型特異性引物對(duì)和熒光探針，1)人腸道病毒71型(EV71)正向引物為5 ‘ -GCCCAATYACAGCCTATYATAATAGC-3 ‘，反向引物為5 ‘ -TACARTCTGCCYACCCTARTCTC-3 ‘，其中正向引物可向5，和3，端 方向各延伸10個(gè)堿基，反向引物可向5’和3’端方向各延伸10個(gè)堿基；2)熒光探針序列為5' -CTAGCGGCAGCCCAAA-3'，該熒光探針序列可向5’和3’端 方向各延伸10個(gè)堿基，熒光探針5'端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記不發(fā)光的淬滅基 團(tuán)標(biāo)記Eclipse，可以大大減少背景噪音的干擾。2、EV71標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-EV71是含有人腸道病毒71型VPl基因片段的IM 個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段構(gòu)成的PMD18-T載體，該載體可在大腸桿菌DH5 α中增殖。3、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品該陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無菌雙蒸水，用于陰性對(duì)照。二、PCR試劑盒的制備和檢測(cè)方法PCR試劑盒的制備和檢測(cè)方法包括下列步驟①配制RNA提取液； ②配制熒光定量PCR反應(yīng)液；③配制EV71標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-EV71 ；④配制陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品；⑤配制陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；⑥判斷未知樣本的陰陽(yáng)性用RNA提取液提取未知檢測(cè)樣本得到RNA，后再取EV71陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品和陰性質(zhì) 控標(biāo)準(zhǔn)品分別加入裝有熒光定量PCR反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中，然后置于PCR熒光定量?jī)x中 進(jìn)行反應(yīng)；其中，以陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)曲線作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)曲線作為 陰性對(duì)照，以陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)曲線判斷陽(yáng)性樣本的濃度，從而判斷未知樣本的陰陽(yáng)性 及濃度。本試劑盒的工作原理在本發(fā)明提供的快速定量檢測(cè)人腸道病毒71型熒光定量PCR試劑盒中，有標(biāo)記了 熒光基團(tuán)的特異性熒光探針，在探針完整時(shí)，兩基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠近，5'端報(bào) 告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光因?yàn)闊晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移(FRET)而被3'端淬滅基團(tuán)淬滅，故體系中沒有 熒光信號(hào)的變化。在PCR退火和延伸過程中，探針與模板特異性結(jié)合，隨著引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5' -3'外切活性對(duì)探針進(jìn)行切割釋放出報(bào)告基團(tuán)，這樣破壞了兩基團(tuán) 之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，報(bào)告基團(tuán)所釋放的熒光可以被內(nèi)置在定量檢測(cè)儀內(nèi)的熒 光計(jì)檢測(cè)，熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系。對(duì)人腸道病毒71型的定量可通 過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中，熒光量 的積累超過基底熒光量的循環(huán)個(gè)數(shù)，Ct值與起始模數(shù)呈一定比例關(guān)系，Ct值越小，起始模 板數(shù)越多，相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽(yáng)性梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值可準(zhǔn)確測(cè)出該樣品的起始拷貝數(shù)。在本發(fā)明提供的檢測(cè)人腸道病毒71型熒光定量PCR試劑盒中，針對(duì)人腸道病毒71 型檢測(cè)中的特殊性，對(duì)不同的靶片段進(jìn)行反應(yīng)體系，如引物和探針濃度、Mg2+濃度、退火溫度 等的優(yōu)化，并將FQ-PCR技術(shù)(熒光定量PCR技術(shù))和定量檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，將其用于人腸道 病毒71型定量檢測(cè)。通過優(yōu)化方案，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，建立了檢測(cè)人腸道病毒71型熒光定量PCR 方法，并研制出檢測(cè)人腸道病毒71型熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個(gè)反 應(yīng)體系中檢出10拷貝，可以滿足快速診斷人腸道病毒71型的要求。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果1、定量準(zhǔn)確；2、檢測(cè)速度快，僅2小時(shí)，加上樣品DNA的提取制備，共僅需2. 5小時(shí)；3、特異性好，靈敏度高；4、可鑒定區(qū)別檢測(cè)人腸道病毒71型；5、使用步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高。本試劑盒可對(duì)人腸道病毒71型進(jìn)行快速定性定量檢測(cè)，并可替代一直沿用的傳 統(tǒng)的培養(yǎng)法。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步說明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克 等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社， 2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。一、關(guān)于制備和檢測(cè)方法的實(shí)施例①配制RNA提取液即TRIZOL核酸抽提試劑。②配制熒光定量PCR反應(yīng)液a、熒光 PCR IOXBuffer 組成500mM KClUOOmM Tris-HCl (PH9. 025°C ) U. 0% Triton X-IOO ；b、熒光定量PCR反應(yīng)液PCR IOXbuffer 5. 0 μ 1，10 μ mol/L的正向引物和反向 引物各 1. 0μ l,5ymol/L 的熒光探針 1. 0μ l,25mmol/L 的 MgCl25 μ 1,2. 5 μ mol/L 的 dNTPs 2. 0μ 1，5υ/μ 1 的 Taq DNA 聚合酶 0. 5μ 1，40υ/μ 1 的 RNA 酶抑制劑 0. 5 μ 1，lOU/μ 1 的 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1. 0 μ 1，RNase Free dH20 33 μ 1。③配制EV71標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-EV71濃度為IO9拷貝/ml標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-EV71。④將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板系列稀釋為IO8拷貝/ml、107拷貝/ml、106拷貝/ml、105拷貝/ ml、IO4 拷貝 /ml、IO3 拷貝 /ml。⑤配制陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品 該陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無菌雙蒸水。
二、關(guān)于試劑盒的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)
1、使用試劑盒快速檢測(cè)人腸道病毒71型①RNA的提取血清、皰疹液等液體樣本各100μ 1，加入200 μ IRNA裂解液及 100 μ 1氯仿，劇烈振蕩混勻30s后在冰上靜置^iin ；4°C 12000rpm離心15min ；取上清加入 等量體積的異丙醇，混勻，室溫放置15min ；4°C 12000rpm離心15min ；用75%乙醇洗滌沉 淀，室溫12000rpm離心IOmin ；室溫晾干，備用(如需保存RNA，則加入DEPC處理水，-20°C 保存)。②對(duì)貯存濃度為IO9拷貝/ml標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-EV71進(jìn)行10倍的系列稀釋， 制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A26tl對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品定量。將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板系列稀釋為 IO8 拷貝 /ml、IO7 拷貝 /ml、IO6 拷貝 /ml、IO5 拷貝 /ml、IO4 拷貝 /ml、IO3 拷貝 /ml。③分別取熒光定量PCR反應(yīng)液各45 μ 1，?、俨襟E所得EV71RNA和②步驟稀釋的 EV71陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板各5μ 1，并設(shè)陰性對(duì)照，分別加入不同的PCR反應(yīng)管，在熒光定量檢測(cè)儀 上平行做PCR檢測(cè)。循環(huán)條件為42°C逆轉(zhuǎn)錄45min ；95°C預(yù)變性!Min ；95°C 20s, 45°C 25s， 72°C 30s擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0把熒光檢測(cè)的程序設(shè)置在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí) 進(jìn)行，所用熒光為FAM，其吸收波長(zhǎng)494nm，發(fā)射波長(zhǎng)522nm。④通過比較待測(cè)樣品和相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值Ct值，對(duì)待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)
進(jìn)行定量。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶軟件，讀取待檢樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為 EV71標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板IO8拷貝/ml、IO7拷貝/ml、IO6拷貝/ml、IO5拷貝/ml、IO4拷貝/ml、IO3 拷貝 /ml 的 Ct 值分別為 17. 52，20. 64，24. 43，27. 88，30. 69，34. 42 ；陰性對(duì)照為 0 或 40 ；反復(fù)重復(fù)試驗(yàn)3次，得到Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P > 0. 05，數(shù)據(jù)差異無顯著意義，說 明其不同批次之間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。從上述實(shí)例可以說明，熒光定量PCR方法定量重復(fù)性好，定量準(zhǔn)確，而且，熒光定 量PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品的檢測(cè)僅需2. 5個(gè)小時(shí)就能完成，而傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)法約需1周 左右才能完成，因此，使用該試劑盒可以大大縮短檢測(cè)時(shí)間。該試劑盒的操作只需1人即可完成整個(gè)定量操作過程，一次可檢測(cè)32-384個(gè)(由 定量檢測(cè)儀的型號(hào)決定)樣品，這樣也減少了人力資源的浪費(fèi)。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測(cè)人腸道病毒71型熒光定量PCR試劑盒，其特征在于包括RNA提取液、熒光定量PCR反應(yīng)液、EV71標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-EV71和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品 ；所述的熒光定量PCR反應(yīng)液含有人腸道病毒71型特異性引物對(duì)和熒光探針； 正向引物為 5 ‘ -GCCCAATYACAGCCTATYATAATAGC-3 ‘， 反向引物為 5 ‘ -TACARTCTGCCYACCCTARTCTC-3 ‘，其中正向引物可向5’和3’端方向各延伸10個(gè)堿基，反向引物可向5’和3’端方向各 延伸10個(gè)堿基；熒光探針序列為5' -CTAGCGGCAGCCCAAA-3'，該熒光探針序列可向5’和3’端方向 各延伸10個(gè)堿基，熒光探針5'端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記不發(fā)光的淬滅基團(tuán)標(biāo) 記Eclipse，可以大大減少背景噪音的干擾，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-EV71是含有人腸道病 毒71型VPl基因的IM個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段構(gòu)成的PMD18-T載體，該載體可在大腸桿菌 DH5a中增殖。
2.按權(quán)利要求1所述的PCR試劑盒，其特征在于EV71標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-EV71包 含的VPl基因片段的核苷酸序列為GCCCAATACAGCCTATATAATAGCACTAGCGGCAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAAATTGTGCAAGGATGCT AGTGATATCCTGCAGACGGGCACCATCCAGGGAGATAGGGTGGCAGATGTA。
3.按權(quán)利要求1所述的PCR試劑盒，其特征在于陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為 無菌雙蒸水。
4.按權(quán)利要求1所述的PCR試劑盒的制備方法，其特征在于包括下列步驟①配制RNA提取液；②配制熒光定量PCR反應(yīng)液；③配制EV71標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMDl8-T-EV71；④配制陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品；⑤配制陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；⑥判斷未知樣本的陰陽(yáng)性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)人腸道病毒71型的熒光定量PCR試劑盒，涉及一種引起人類多種疾病病原體基因檢測(cè)技術(shù)，適用于人腸道病毒71型定性定量檢測(cè)。該試劑盒包括RNA提取液、熒光定量PCR反應(yīng)液、EV71標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-EV71和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；所述的熒光定量PCR反應(yīng)液含有人腸道病毒71型特異性引物對(duì)和熒光探針。本發(fā)明定量準(zhǔn)確；檢測(cè)速度快；特異性好，靈敏度高；可鑒定區(qū)別檢測(cè)人腸道病毒71型；使用步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高。本試劑盒可對(duì)人腸道病毒71型進(jìn)行快速定性定量檢測(cè)，并可替代一直沿用的傳統(tǒng)的培養(yǎng)法。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102108422SQ201010592659
公開日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者唐景峰, 楊敬鏡, 汪曉莉, 王業(yè)富, 王維旭 申請(qǐng)人:武漢百泰基因工程有限公司