專利名稱：快速檢測16、18型人乳頭瘤病毒的熒光定量pcr試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種引起人類宮頸癌及宮頸上皮內高度病變的病原體基因檢測技術， 尤其涉及一種快速檢測16、18型人乳頭瘤病毒熒光定量PCR(聚合酶鏈式反應)試劑盒，適 用于16、18型人乳頭瘤病毒的定性定量檢測。
背景技術：
人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一類嚴重危害人類健康、引起人類 多種疾病的常見病原體。該病毒是一種雙鏈的小DNA病毒，具有7900個堿基對，屬于乳多 空病毒科，目前已鑒定出超過200種亞型，有M種可以感染生殖道黏膜。HPV是乳頭瘤病毒 中最具多樣性的一類，約30種不同型HPV可以感染生殖系統(tǒng)的上皮細胞，命名為“生殖型” 的HPV。根據HPV致癌的危險性把HPV分為低危型和高危型，其中HPV16型和HPV18型是最 常見的、具有代表性的高危型，60 %以上的宮頸病變和宮頸癌中檢測到HPV16或HPV18的感 染。HPV主要通過直接或間接接觸污染物品或性傳播感染人類，病毒侵入人體后，停留于感 染部位的皮膚和粘膜中，不產生病毒血癥。近年研究資料證明HPV與宮頸癌、喉癌、舌癌等發(fā)生有關。如HPV16、18等型與宮 頸癌的發(fā)生關系密切。宮頸癌是世界范圍女性第二大惡性腫瘤，也是目前為止最可靠的已 知為病毒起源的惡性腫瘤之一，發(fā)展中國家的發(fā)生率是發(fā)達國家6倍。近年來，由于宮頸癌 病因學研究的突破，研究已確認宮頸癌是感染性疾病，并確立人乳頭瘤病毒(HPV)感染是 宮頸癌的主要病因，99. 7%的宮頸癌都可檢測到高危HPV的DNA，HPV陰性者幾乎不會發(fā)生 宮頸癌(99% NPV)。特別是近年由于HPV感染增加，現有的防治措施缺乏力度，患者明顯年 輕化。HPV感染持續(xù)存在最終致宮頸癌變，故宮頸癌是可預防的特殊癌癥。因此建立有效的 HPV核酸檢測技術對該類患者監(jiān)控和診斷，跟蹤宮頸病變治療的預后，對宮頸癌的預防和早 期診斷治療有著十分重要的意義。近年來發(fā)展起來的熒光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR, FQ-PCR) 技術以其靈敏度高、速度快、特異性強等優(yōu)點在基因表達水平分析(Development and evaluation of a PCR and mass spectroscopy (PCR-MS)-based method for quantitative, type-specific detection of human papillomavirus[J]. Journal of Virological Methods 160(2009)78-84 ；Comparison between the Hybrid Capture 2 and the hpVIR real-time PCR for detection of human papillomavirus in women with ASCUS or low grade dysplasia. [J]. Journal of Clinical Virology 45(2009)85-89) 禾口 定量檢測(Detection and quantitation of HPV in genital and oral tissues and fluids by real time PCR[J]. Virology Journal 2010，7 194 ；Evaluation of a Prototype Real-Time PCR Assay for Carcinogenic Human Papillomavirus (HPV) Detection and Simultaneous HPV Genotype 16 (HPV16)and HPV18 Genotyping. [J]. journal of cl inicai microbiology OCT 2009,47 :103344-3347)等方面得到廣泛應用， 并且已經成為當前病毒核酸定量的主要方法，國內目前已有關于丙肝、乙肝、淋球菌、支原體、衣原體、艾滋病、結核定量檢測的試劑盒上市。臨床檢測上傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和血清學方法具有靈敏度低、特異性差、假陽性、耗時費 力等缺點；常規(guī)PCR法雖然有簡便、快速、靈敏的優(yōu)勢，但是有不能精確定量和PCR后處理產 生污染導致的假陽性等問題；因此隳待開發(fā)精確、靈敏、快速和無污染的臨床檢驗方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現有技術存在的缺點和不足，提供一種快速檢測16、18型 人乳頭瘤病毒的熒光定量PCR試劑盒。本發(fā)明采用以下技術方案一、PCR 試劑盒該試劑盒包括DNA裂解液、熒光定量PCR反應液、HPV16&18標準陽性模板 PMD18-T-HPV16&18和陰性質控標準品；所述的熒光定量PCR反應液含有16、18型人乳頭瘤病毒特異性引物對和熒光探 針16、18型人乳頭瘤病毒的正向引物為5' -SWGYWGCAGCAYTATATTGG-3‘，16、18 型人乳頭瘤病毒的反向引物為 5' -ATGTTGTAffffAYWGTWWGTCTTTG-3‘，其中正向引物可向5’和3’端方向各延伸10個堿基，反向引物可向5’和3’端方 向各延伸10個堿基；熒光探針序列為5' -CAYTCWGGYGTGTCTCC-3'，該熒光探針序列可向5，和3，端 方向各延伸10個堿基，熒光探針5'端標記報告熒光基團FAM，3'端標記不發(fā)光的淬滅基 團標記Eclipse，可以大大減少背景噪音的干擾；所述的HPV16&18標準陽性模板PMD18-T-HPV16&18是含有16、18型人乳頭瘤病毒 高度保守基因-El基因的101個堿基對的核苷酸片段構成的PMD18-T載體，該載體在大腸 桿菌DH5a中增殖。具體地說a) DNA 裂解液DNA 裂解液包含50mmol/L NaOH，IOmmo 1/L Tris-HCl, pH 8. 0，體積分數為 Triton X-100，體積分數為 NP-40,0. 5mmol/L EDTA pH 8. 0。b)熒光定量PCR反應液熒光定量PCR反應液包含PCR IOXbuffer 5. 0 μ 1，10 μ mol/L的正向引物和反 向引物各 1.5 μ l,5ymol/L 的熒光探針 1.5 μ l,25mmol/L ^ MgCl212. 5 μ l,10mmol/L 的 dNTPs 1. 0μ 1,2. 5U/y 1 的 Taq DNA 聚合酶 1. 0μ 1，無菌雙蒸水 ^μ 1。c)HPV16&18標準陽性模板HPV16&18標準陽性模板PMD18-T-HPV16&18是含有16、18型人乳頭瘤病毒高度保 守基因-El基因的101個堿基對的核苷酸片段構成的PMDlS-TCm-T重組質粒，該重組質粒 轉化大腸桿菌DH5ci增殖后用堿裂解法提取，經DNA純化試劑盒純化，用分光光度計測A260 定量并稀釋至IO9拷貝/ml，-20°C保存。貯存濃度為IO9拷貝/ml，使用前進行10倍梯度的 系列稀釋。d)陰性質控標準品
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陰性質控標準品為無菌雙蒸水。本試劑盒的工作原理在本發(fā)明提供的快速定量檢測16、18型人乳頭瘤病毒熒光定量PCR試劑盒中，有 標記了熒光基團的特異性熒光探針，在探針完整時，兩基團在空間結構上距離相互靠近， 5'端報告基團產生的熒光因為熒光共振能量轉移(FRET)而被3'端淬滅基團淬滅，故體 系中沒有熒光信號的變化。在PCR退火和延伸過程中，探針與模板特異性結合，隨著引物 的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5' -3'外切活性對探針進行切割釋放出報告基團，這樣 破壞了兩基團之間的熒光共振能量轉移(FRET)，報告基團所釋放的熒光可以被內置在定量 檢測儀內的熒光計檢測，熒光量的增加與PCR產物的積累量呈比例關系。對16、18型人乳 頭瘤病毒的定量可通過與標準品的循環(huán)域值(CtJhreshold Cycle)相比較得出。Ct值是 PCR過程中，熒光量的積累超過基底熒光量的循環(huán)個數，Ct值與起始模數呈一定比例關系， Ct值越小，起始模板數越多，相反，Ct值越大，起始模板數越少。利用陽性梯度標準模板的 Ct值制成標準曲線，再根據待測樣品的Ct值可準確測出該樣品的起始拷貝數。在本發(fā)明提供的檢測16、18型人乳頭瘤病毒熒光定量PCR試劑盒中，針對16、18 型人乳頭瘤病毒檢測中的特殊性，對不同的靶片段進行反應體系，如引物和探針濃度、Mg2+ 濃度、退火溫度等的優(yōu)化，并將FQ-PCR技術(熒光定量PCR技術)和定量檢測系統(tǒng)相結合， 將其用于16、18型人乳頭瘤病毒定量檢測。通過優(yōu)化方案，反復實驗，建立了檢測16、18型 人乳頭瘤病毒熒光定量PCR方法，并研制出檢測16、18型人乳頭瘤病毒熒光定量PCR試劑 盒，該試劑盒的靈敏度可在每個反應體系中檢出10拷貝，可以滿足快速診斷16、18型人乳 頭瘤病毒的要求。二、本發(fā)明的使用方法包括下列步驟①對貯存濃度為IO9拷貝/ml標準陽性模板PMD18-T-HPV16&18進行10倍的系列 稀釋，制備陽性標準品，用紫外分光光度計測定A260對標準品定量；②用DNA裂解液從待測標本中提取HPV16&18DNA ；③分別取②步中的DNA和同樣量的系列稀釋的①步中的兩種陽性標準品加入到 含Taq DNA聚合酶和熒光定量反應液的PCR反應體系中用熒光定量檢測儀進行PCR檢測；④通過比較待測樣品和相應標準品的循環(huán)域值Ct值，對待測樣品的起始拷貝數
進行定量。本發(fā)明與現有技術相比具有以下優(yōu)點和效果1、定量準確；2、檢測速度快，僅1. 5小時，加上樣品DNA的提取制備，共僅需2小時；3、特異性好，靈敏度高；4、使用步驟簡單，可重復性高；5、可同時進行高通量的樣品檢測。本試劑盒可對16、18型人乳頭瘤病毒進行快速定性定量檢測，并可替代一直沿用 的傳統(tǒng)的培養(yǎng)法。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。
應當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍。 下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學出版社，1992，分子克隆實驗指南(第二版)；D. L.斯佩克特等，科學出版社，2001，細胞實驗指南；呂鴻聲，科學出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。1、實施例一試劑盒組成與配制a、DNA提取試劑(裂解液)50mmol/L NaOH, 10mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0，體積分數為 TritonX-100，體積 分數為 NP-40,0. 5mmol/L EDTA pH 8. 0。b、熒光 PCR IOXBuffer 組成500mM KClUOOmM Tris-HCl (PH9. 025°C ) U. 0% Triton X-100。c、熒光定量PCR反應液包含PCR IOXbuffer 5. 0 μ 1，10 μ mol/L的正向引物和 反向引物各 1. 5 μ l,5ymol/L 的熒光探針 1. 5 μ l,25mmol/L ^ MgCl212. 5 μ l,10mmol/L 的 dNTPs 1. 0μ 1,2. 5U/y 1 的 Taq DNA 聚合酶 1. 0μ 1，無菌雙蒸水 ^μ 1。d、標準陽性模板貯存液濃度為IO9拷貝/ml標準陽性模板PMD18-T-HPV16&18。e、陰性質控標準品為無菌雙蒸水。實施例2 使用試劑盒快速檢測16、18型人乳頭瘤病毒a、在標本試管中加入Iml無菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，轉至1.5ml離心管中， IOOOOrpm離心lOmin，再重復洗滌1次。沉淀直接加50 μ 1 DNA提取液充分混勻，沸水浴 IOmin, IOOOOrpm離心2min,取上清液5 μ 1做PCR反應；b、將陽性標準模板(試劑d)系列稀釋為IO8拷貝/ml、107拷貝/ml、106拷貝/ml、 IO5 拷貝 /ml、IO4 拷貝 /ml、IO3 拷貝 /ml ；C、分別取熒光定量PCR反應液(試劑c)各45 μ 1，取第a)步所得HPV16&18DNA 和第b)步稀釋的HPV16&18陽性標準模板各5 μ 1，并設陰性對照，分別加入不同的PCR反 應管，在熒光定量檢測儀上平行做PCR檢測；循環(huán)條件為94°C預變性300s ；94°C 10s, 58°C 40s，擴增40個循環(huán)。把熒光檢測的程序設置在每個循環(huán)的第二步結束時進行，所用熒 光為FAM，其吸收波長494nm，發(fā)射波長522nm。循環(huán)結束后，運用儀器自帶軟件，讀取待檢樣品拷貝數。結果為HPV16&18標準陽 性模板IO8拷貝/ml、IO7拷貝/ml、IO6拷貝/ml、IO5拷貝/ml、IO4拷貝/ml、IO3拷貝/ml的 Ct 值分別為 17. 52，20. 64，24. 43，27. 88,30. 69 和 34. 42 ；陰性對照為 0 或 40 ；反復重復試驗3次，得到Ct值進行統(tǒng)計學分析P > 0. 05，數據差異無顯著意義，說 明其不同批次之間的檢測結果具有可比性，具有良好的重復性。從上述實例可以說明，熒光定量PCR方法定量重復性好，定量準確，而且，熒光定 量PCR檢測試劑盒對樣品的檢測僅需2個小時就能完成，而傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)法約需1周左 右才能完成，因此使用該試劑盒可以大大縮短檢測時間。該試劑盒的操作只需1人即可完成整個定量操作過程，一次可檢測32-384個(由 定量檢測儀的型號決定)樣品，這樣也減少了人力資源的浪費。
權利要求
1.一種快速檢測16、18型人乳頭瘤病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒包括DNA裂解液、熒光定量PCR反應液、HPV16&18標準陽性模板 PMD18-T-HPV16&18和陰性質控標準品；所述的熒光定量PCR反應液含有16、18型人乳頭瘤病毒特異性引物對和熒光探針16、18型人乳頭瘤病毒的正向引物為5' -SWGYWGCAGCAYTATATTGG-3 ‘，反向引物為 5 ‘ -ATGTTGTAWffAYWGTffffGTCTTTG-3 ‘，其中正向引物可向5，和3，端方向各延伸10個堿 基，反向引物可向5’和3’端方向各延伸10個堿基；熒光探針序列為5' -CAYTCWGGYGTGTCTCC-3'，該熒光探針序列可向5’和3’端方向 各延伸10個堿基，熒光探針5'端標記報告熒光基團FAM，3'端標記不發(fā)光的淬滅基團標 記Eclipse，可以大大減少背景噪音的干擾；所述的HPV16&18標準陽性模板PMD18-T-HPV16&18是含有16、18型人乳頭瘤病毒高度 保守基因-El基因的101個堿基對的核苷酸片段構成的PMD18-T載體，該載體在大腸桿菌 DH5a中增殖。
2.按權利要求1所述的PCR試劑盒，其特征在于DNA裂解液包含50mmol/L NaOH, 10mmol/L Tris_HCl，pH 8. 0，體積分數為 1 % Triton X-100，體積分數 為 NP-40,0. 5mmol/L EDTA pH 8. 0。
3.按權利要求1所述的PCR試劑盒，其特征在于熒光定量PCR反應液包含PCR IOXbuffer 5. 0 μ 1，10 μ mol/L的正向引物和反向引物各1. 5 μ 1，5 μ mol/L的熒 光探針 1.5 μ l，25mmol/L 的MgCl212. 5μ 1，10mmol/L 的 dNTPs 1.0 μ 1,2. 5U/μ 1 的 Taq DNA 聚合酶1. 0 μ 1，無菌雙蒸水沈μ 1。
4.按權利要求1所述的PCR試劑盒，其特征在于HPV16&18標準陽性模板 PMD18-T-HPV16&18包含的El基因的核苷酸序列為SffGYWGCAGCAYTATATTGGTATARAACAGGffATATCAAATATTAGTGAAGTRffffKGGAGACACRCCWGARTG GATACAAAGACffffACffRTffffTACAACAT ；S :C 或 G :A 或 T ;Y :C 或 T ;R :A 或 G ;K :T 或 G。
5.按權利要求1所述的PCR試劑盒，其特征在于陰性質控標準品為無菌雙蒸水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測16、18型人乳頭瘤病毒熒光定量PCR試劑盒，涉及一種引起人類宮頸癌及宮頸上皮內高度病變的病原體基因檢測技術。該試劑盒包括DNA裂解液、熒光定量PCR反應液、HPV16&18標準陽性模板PMD18-T-HPV16&18和陰性質控標準品；所述的熒光定量PCR反應液含有16、18型人乳頭瘤病毒特異性引物對和熒光探針。本發(fā)明定量準確；檢測速度快；特異性好，靈敏度高；使用步驟簡單，可重復性高；可同時進行高通量的樣品檢測。本試劑盒可對16、18型人乳頭瘤病毒進行快速定性定量檢測，并可替代一直沿用的傳統(tǒng)的培養(yǎng)法。
文檔編號C12Q1/70GK102108423SQ20101059266
公開日2011年6月29日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權日2010年12月17日
發(fā)明者唐景峰, 楊敬鏡, 汪曉莉, 王業(yè)富, 王維旭 申請人:武漢百泰基因工程有限公司