專利名稱：一種快速促進(jìn)生長的高脂小球藻培養(yǎng)液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速促進(jìn)生長的高脂小球藻培養(yǎng)液及其 制備方法。
背景技術(shù)：
小球藻(Chlorella)為綠藻門小球藻屬普生性單細(xì)胞綠藻，是一種球形單細(xì)胞淡水藻 類，直徑3 8微米，是地球上最早的生命之一，出現(xiàn)在20多億年前，基因始終沒有變化， 是一種高效的光合植物，以光合自養(yǎng)生長繁殖，分布極廣。它是一種最低等、最古老的植物， 它繁殖快，含油率高，是生物燃料的重要來源。小球藻含豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、食用纖 維、維生素、微量元素和活性代謝產(chǎn)物，具有防治消化性潰瘍、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、抗輻射、抗 病原微生物、防治貧血、降血脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化等保健和藥理作用，可供人們安全食用。 小球藻是目前已發(fā)現(xiàn)的最接近人類需要的天然均衡的營養(yǎng)食品。由于含有豐富的蛋白質(zhì)、 藻多糖、胡蘿卜素、Y-亞麻酸等營養(yǎng)物質(zhì)外，還富含有排除腸、腎、肺和血液中有害物 質(zhì)的葉綠素，特別是含有促生長因子(CGF)，可以明顯延緩衰老，活化人體細(xì)胞，修復(fù)受損基 因。據(jù)稱，在日本，小球藻系列產(chǎn)品已連續(xù)20年在所有保健品銷售中名列第一。小球藻在不同培養(yǎng)條件下可以產(chǎn)生10% 30%細(xì)胞干重的脂類，可以用于轉(zhuǎn)化 為脂肪酸甲脂即生產(chǎn)生物柴油。另外，小球藻具備降解有機(jī)污染物，高效吸附重金屬和吸收 氮磷等功能，在生物能源和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用開發(fā)前景，是一種極其重要的微 藻資源。通常使用SE培養(yǎng)基(SE Medium)和Pr培養(yǎng)基(Pr Medium)，也可以使用BG-11培 養(yǎng)基(BG-11 Medium)培養(yǎng)。小球藻自養(yǎng)培養(yǎng)主要指利用光能將無機(jī)碳轉(zhuǎn)化為碳水化合物的 過程，光照可以采用太陽光或人工光源，無機(jī)碳源豐要包括碳酸鹽或C02。小球藻最適培養(yǎng) 溫度25 V 35°C，最適pH6. 5 7. 5，最適光照強(qiáng)度2000 5000lux，除此之外，還需要在 培養(yǎng)基中提供氮源、磷源、鎂和鐵及微量元素等。目前，小球藻自養(yǎng)培養(yǎng)的技術(shù)已經(jīng)成熟，但 存在的問題是在小球藻細(xì)胞增加到一定濃度后阻擋光線進(jìn)入培養(yǎng)物，因此限制了小球藻的 光合作用，導(dǎo)致培養(yǎng)的小球藻生物量低。1953年，Lewin首先發(fā)現(xiàn)了一些藻類能利用有機(jī)物 作為唯一的碳源和能源進(jìn)行異養(yǎng)生長，從而引起了單胞藻類培養(yǎng)的一次重要革命。近年來 特別是通過異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)的研究與探索，大幅度提高了小球藻的生長速度，使小球藻 異養(yǎng)培養(yǎng)的上產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)成為可能。Endo和Shirota榆測(cè)了小球藻利用包括糖、有機(jī)酸和 醇類等60多種有機(jī)碳源的能力，結(jié)果表明，葡萄糖、乙酸和乙醇等可作為唯一碳源支持小 球藻的生長。異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻細(xì)胞分裂很快，使更多能量用于呼吸代謝，限制了細(xì)胞物質(zhì)的 合成，導(dǎo)致其蛋白和色素含量下降。但與自養(yǎng)相比，異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻的脂肪含量明顯增加， 有利于提取其中的脂類轉(zhuǎn)化生物柴油。Barbier發(fā)現(xiàn)某些生長素可提高小球藻蛋白含量，其 機(jī)制是藻細(xì)胞核中的生長素受體與添加的外源生長素結(jié)合，形成“生長素——受體”復(fù)合物識(shí)別基因的啟動(dòng)了，使小球藻表達(dá)蛋白含量的能力提高。李師翁發(fā)現(xiàn)，乙酸鈉和萘乙酸使小 球藻內(nèi)蛋白質(zhì)含量由對(duì)照的43. 4%提高到46. 9%和52. 5%，另外，碳酸濃度的增加也有助 于提高小球藻葉綠素含量。嚴(yán)美姣報(bào)道白光對(duì)小球藻的生長有促進(jìn)作用，而紅光和藍(lán)光可 以提高小球藻葉綠素含量。Sansawa等對(duì)小球藻進(jìn)行異養(yǎng)同步培養(yǎng)，使藻細(xì)胞內(nèi)的蛋白和葉 綠素含量是非同步培養(yǎng)的2 3倍，說明通過異養(yǎng)培養(yǎng)的控制同樣可以獲得高品質(zhì)的小球 藻。
隨著地球主要不可再生資源石油的日益枯竭，對(duì)人類的生存和可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重 威脅。因此利用微細(xì)藻類固定CO2產(chǎn)生的脂類轉(zhuǎn)化生物柴油，就達(dá)到高效減排產(chǎn)能的目的。 繆曉玲發(fā)現(xiàn)通過異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻的脂類含量達(dá)細(xì)胞干重的55%，是自養(yǎng)培養(yǎng)藻脂類含量 14%的4倍，異養(yǎng)藻細(xì)胞轉(zhuǎn)化的生物油熱值高達(dá)41MJ / kg，分別是木材生物油和自養(yǎng)藻生 物油的2倍和1. 4倍。由于異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻所需的碳源是與人類糧食資源發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)的葡萄 糖，因此首先采用異養(yǎng)培養(yǎng)獲得超高細(xì)胞濃度小球藻，然后轉(zhuǎn)變?yōu)榘尊B(yǎng)培養(yǎng)方式固定C02， 一方面可以緩解CO2減排的壓力，另一方面可以獲得大量小球藻細(xì)胞用于提取其中脂類轉(zhuǎn) 化生物柴油。除此之外，微藻可以直接降解有機(jī)污染物、高效吸附重金屬和吸收氮磷，為廢 水的資源化處理提供一種新的思路。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種快速促進(jìn)生長 的高脂小球藻培養(yǎng)液及其制備方法的技術(shù)方案，其生產(chǎn)成本低，操作方便，促進(jìn)小球藻脂類 含量效果好，培養(yǎng)得到藻類純度高。所述的一種快速促進(jìn)生長的高脂小球藻培養(yǎng)液，其特征在于含有重量百分含量 的以下物質(zhì)竹醋液1_8%、主要養(yǎng)分4-15%、微量養(yǎng)分0. 2-2. 5%、土壤提取液0-1. 5%、水 78-94%，所述的主要養(yǎng)分為硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硝酸鉀、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鉀、氯化 鈉中的一種或一種以上混合物，所述的微量養(yǎng)分為氯化鐵、硼酸、硫酸銅、硫酸錳、硫酸鋅、 鉬酸銨中的一種或一種以上混合物。所述的一種快速促進(jìn)生長的高脂小球藻培養(yǎng)液，其特征在于所述竹醋液的含量為 2-7%，優(yōu)選為 3-5%。所述的一種快速促進(jìn)生長的高脂小球藻培養(yǎng)液，其特征在于所述主要養(yǎng)分的含量 為6-12%，優(yōu)選為7-10%。所述的一種快速促進(jìn)生長的高脂小球藻培養(yǎng)液，其特征在于所述微量養(yǎng)分的含量 為 0. 5-2. 0%，優(yōu)選為 0. 8-1. 5%O所述的一種快速促進(jìn)生長的高脂小球藻培養(yǎng)液，其特征在于所述土壤提取液的含 量為 0. 2-1. 0%,優(yōu)選 0. 4-0. 8%O所述的一種快速促進(jìn)生長的高脂小球藻培養(yǎng)液，其特征在于所述水的含量為 82-90%，優(yōu)選 85-88%。所述一種快速促進(jìn)生長的高脂小球藻培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于包括以下步 驟
1)取未施過肥的土壤500g置于容器中，加入蒸餾水IOOOml，瓶口用透氣塞封口，在水 浴中沸水加熱2-4小時(shí)，然后冷卻4-6小時(shí)，在無菌條件下三成紗布過濾，取上清液，再將滅過菌的蒸餾水加入上清液中至總體積1000ml，即為土壤提取液，3-6°C保存?zhèn)溆茫?br> 2)在反應(yīng)釜中投入竹醋液1_8%，主要養(yǎng)分4-15%，微量養(yǎng)分0. 2-2. 5%，土壤提取液 0-1. 5%，水78-94%，攪拌均勻即成最終產(chǎn)品。所述的竹醋液是竹材加工剩余物經(jīng)高溫?zé)峤獾玫降母碑a(chǎn)物，可從市場(chǎng)上直接購得。上述一種快速促進(jìn)生長的高脂小球藻培養(yǎng)液，通過添加竹醋液作增效成分，大大 提高了藻類固定CO2產(chǎn)生的脂類含量，其制備方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，操作方便，促進(jìn)小球藻 脂類含量效果好，在同等情況下，培養(yǎng)得到藻類純度很高，大幅度降低了對(duì)小球藻大規(guī)模開 發(fā)利用的培養(yǎng)成本。本申請(qǐng)文件中涉及的百分含量，除另有說明外，均為重量百分含量。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例和培養(yǎng)試驗(yàn)，進(jìn)一步說明本發(fā)明的有益效果。實(shí)施例1
向1000L攪拌釜內(nèi)投入30kg竹醋液，再加入15kg硝酸鈉、20kg硝酸鉀、15kg磷酸二氫 鉀和15kg氯化鈉，然后加入Ikg氯化鐵、Ikg硼酸、Ikg硫酸銅、Ikg硫酸錳、0. 5kg硫酸鋅和 0. 5kg鉬酸銨，攪拌均勻，再加入900kg水，攪拌至所有物質(zhì)溶解，即成最終產(chǎn)品。實(shí)施例2
向1000L攪拌釜內(nèi)投入50kg竹醋液，再加入25kg硝酸鉀、25kg硫酸鎂、25kg氯化鈣和 25kg氯化鈉，然后加入IOkg氯化鐵、5kg硼酸和5kg硫酸銅，攪拌均勻，加入IOkg 土壤提取 液，再加入820kg水，攪拌至所有物質(zhì)溶解，即成最終產(chǎn)品。實(shí)施例3
向1000L攪拌釜內(nèi)投入38kg竹醋液，再加入17kg硝酸鈉、17kg磷酸氫二鉀、17kg氯化 鈣、17kg磷酸二氫鉀和17kg氯化鈉，然后加入2kg硫酸銅、2kg硫酸錳、2kg硫酸鋅和2kg鉬 酸銨，攪拌均勻，加入2kg 土壤提取液，再加入867kg水，攪拌至所有物質(zhì)溶解，即成最終產(chǎn)
P
BFI ο實(shí)施例4
向1000L攪拌釜內(nèi)投入35kg竹醋液，再加入16kg磷酸氫二鉀、16kg硝酸鉀、16kg硫 酸鎂、16kg氯化鈣和16kg磷酸二氫鉀，然后加入5kg氯化鐵、5kg硫酸銅、2. 5kg硫酸錳和 2. 5kg鉬酸銨，攪拌均勻，加入4kg 土壤提取液，再加入866kg水，攪拌至所有物質(zhì)溶解，即成 最終廣品。實(shí)施例5
向1000L攪拌釜內(nèi)投入40kg竹醋液，再加入5kg硝酸鈉、IOkg磷酸氫二鉀、30kg硝酸 鉀和30kg硫酸鎂，然后加入2. 5kg硼酸、2. 5kg硫酸銅、2. 5kg硫酸錳和2. 5kg硫酸鋅，攪拌 均勻，加入Ikg 土壤提取液，再加入874kg水，攪拌至所有物質(zhì)溶解，即成最終產(chǎn)品。實(shí)施例6
向1000L攪拌釜內(nèi)投入48kg竹醋液，再加入IOkg硝酸鈉、IOkg磷酸氫二鉀、IOkg硝酸 鉀、IOkg硫酸鎂、IOkg氯化鈣、IOkg磷酸二氫鉀和IOkg氯化鈉，然后加入3kg氯化鐵、3kg 硼酸、3kg硫酸銅、3kg硫酸錳、3kg硫酸鋅和3kg鉬酸銨，攪拌均勻，加入8kg 土壤提取液，再加入856kg水，攪拌至所有物質(zhì)溶解，即成最終產(chǎn)品。以下通過試驗(yàn)說明培養(yǎng)液的促進(jìn)生長效果，試驗(yàn)結(jié)果見表1。表1 實(shí)施例1-6對(duì)小球藻生物量(0D680nm)的影響
CK是指除與實(shí)施例培養(yǎng)基中沒有竹醋液外，其余成分均相同，即CKl的培養(yǎng)基沒有竹 醋液而實(shí)施例1有竹醋液，其余成分和含量均相同，CK2與實(shí)施例2，CK3與實(shí)施例3，CK4與 實(shí)施例4，CK5與實(shí)施例5，CK6與實(shí)施例6，同樣理解。從上表1可見，含有竹醋液的培養(yǎng)基 具有明顯促進(jìn)小球藻生長的作用。
權(quán)利要求
1.一種快速促進(jìn)生長的高脂小球藻培養(yǎng)液，其特征在于含有重量百分含量的以下物 質(zhì)竹醋液1-8%、主要養(yǎng)分4-15%、微量養(yǎng)分0. 2-2. 5%、土壤提取液0-1. 5%、水78_94%，所述 的主要養(yǎng)分為硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硝酸鉀、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鉀、氯化鈉中的一種 或一種以上混合物，所述的微量養(yǎng)分為氯化鐵、硼酸、硫酸銅、硫酸錳、硫酸鋅、鉬酸銨中的 一種或一種以上混合物。
2.如權(quán)利要求1所述的一種快速促進(jìn)生長的高脂小球藻培養(yǎng)液，其特征在于所述竹醋 液的含量為2-7%，優(yōu)選為3-5%。
3.如權(quán)利要求1所述的一種快速促進(jìn)生長的高脂小球藻培養(yǎng)液，其特征在于所述主要 養(yǎng)分的含量為6-12%，優(yōu)選為7-10%。
4.如權(quán)利要求1所述的一種快速促進(jìn)生長的高脂小球藻培養(yǎng)液，其特征在于所述微量 養(yǎng)分的含量為0. 5-2. 0%，優(yōu)選為0. 8-1. 5%。
5.如權(quán)利要求1所述的一種快速促進(jìn)生長的高脂小球藻培養(yǎng)液，其特征在于所述土壤 提取液的含量為0. 2-1. 0%，優(yōu)選0. 4-0. 8%。
6.如權(quán)利要求1所述的一種快速促進(jìn)生長的高脂小球藻培養(yǎng)液，其特征在于所述水的 含量為82-90%，優(yōu)選85-88%。
7.如權(quán)利1所述一種快速促進(jìn)生長的高脂小球藻培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于包括 以下步驟1)取未施過肥的土壤500g置于容器中，加入蒸餾水IOOOml，瓶口用透氣塞封口，在水 浴中沸水加熱2-4小時(shí)，然后冷卻4-6小時(shí)，在無菌條件下三成紗布過濾，取上清液，再將滅 過菌的蒸餾水加入上清液中至總體積1000ml，即為土壤提取液，3-6°C保存?zhèn)溆茫?)在反應(yīng)釜中投入竹醋液1_8%，主要養(yǎng)分4-15%，微量養(yǎng)分0.2-2. 5%，土壤提取液 0-1. 5%，水78-94%，攪拌均勻即成最終產(chǎn)品。
全文摘要
一種快速促進(jìn)生長的高脂小球藻培養(yǎng)液及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。含有竹醋液1-8%、主要養(yǎng)分4-15%、微量養(yǎng)分0.2-2.5%、土壤提取液0-1.5%、水78-94%，所述的主要養(yǎng)分為硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硝酸鉀、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鉀、氯化鈉中的一種或一種以上混合物，所述的微量養(yǎng)分為氯化鐵、硼酸、硫酸銅、硫酸錳、硫酸鋅、鉬酸銨中的一種或一種以上混合物。該培養(yǎng)液通過添加竹醋液作增效成分，大大提高了藻類固定CO2產(chǎn)生的脂類含量，其制備方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，操作方便，促進(jìn)小球藻脂類含量效果好，在同等情況下，培養(yǎng)得到藻類純度很高，大幅度降低了對(duì)小球藻大規(guī)模開發(fā)利用的培養(yǎng)成本。
文檔編號(hào)C12N1/12GK102093957SQ20101059330
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者夏國華, 張啟香, 童森淼, 胡君艷, 鄭炳松, 閆道良, 陳國娟, 黃堅(jiān)欽, 黃有軍 申請(qǐng)人:浙江農(nóng)林大學(xué)