專利名稱：豬早期胚胎發(fā)育前期培養(yǎng)液及后期培養(yǎng)液的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及發(fā)育生物學，具體涉及一種豬早期胚胎發(fā)育前期培養(yǎng)液及豬胚胎后期 培養(yǎng)液。
背景技術：
早期胚胎培養(yǎng)是胚胎生物技術的基礎和關鍵環(huán)節(jié)，對于體外受精、胚胎分割、胚胎 嵌合、核移植和轉基因動物的構建都具有重要的意義。現(xiàn)有的早期胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)能夠成功 地支持重構胚發(fā)育到囊胚階段，但是發(fā)育至囊胚比率沒有體內高，而且體外培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng) 的胚胎質量也差于體內胚胎。人們對早期胚胎發(fā)育的機制仍知之甚少，同時體外培養(yǎng)也不 能完全模擬體內環(huán)境一方面，體內胚胎處于微量的液體環(huán)境中，而在體外培養(yǎng)的胚胎多置 于較多的培養(yǎng)液中，使得胚胎自分泌產生的因子均被稀釋而無效果。另一方面體內胚胎始 終處于一種動態(tài)的環(huán)境中，胚胎通過輸卵管到達子宮的過程中周圍的營養(yǎng)環(huán)境持續(xù)變化， 以滿足胚胎不同發(fā)育階段的營養(yǎng)需求；而在體外培養(yǎng)時，許多傳統(tǒng)胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)是一個靜 止的環(huán)境，在整個植入前時期只有一種培養(yǎng)基。此外，體外培養(yǎng)系統(tǒng)中也缺乏任何雌性生殖 道旁分泌因子?？偟膩碚f，現(xiàn)階段體外培養(yǎng)的胚胎在數(shù)量上和質量上都不如體內胚胎，這告 訴我們胚胎的體外培養(yǎng)體系還不十分完美，還需要繼續(xù)深入研究并建立更好更接近生理環(huán) 境的培養(yǎng)系統(tǒng)。目前豬的胚胎從合子到囊胚在體外有以下幾種體外培養(yǎng)液如改良的Whitten培 養(yǎng)液、北卡羅來納州立大學研制的培養(yǎng)液(North Carolina State University (NCSU23/ NCSU37)、改良的Chatot, Ziomek, Bavister 培養(yǎng)液、Beltsville embryo culture medium (BECM)培養(yǎng)液和PZM系列(PZM-3/PZM- 4/PZM-5)培養(yǎng)液。其中NCSU23是公認的這其中最 成功的培養(yǎng)液，它基本能滿足其發(fā)育至囊胚的代謝和營養(yǎng)需要。然而這些經體外培養(yǎng)后的 胚胎經胚胎移植后，其妊娠率和窩均產仔數(shù)均很低，發(fā)育至囊胚的細胞數(shù)也顯著低于體內 胚胎，我們還需要對體外培養(yǎng)液進行改進，以提高豬早期胚胎體外生產效率。

發(fā)明內容
發(fā)明人經大量深入研究，在NCSU23豬胚胎培養(yǎng)液的基礎上，通過在豬早期胚胎 (即豬孵化囊胚前的胚胎)發(fā)育前期階段和后期階段添加及刪減某些營養(yǎng)物質或抗氧化劑， 大大提高了豬克隆胚胎和孤雌激活胚胎的體外發(fā)育效果。兩種胚胎利用本發(fā)明的豬早期 胚胎發(fā)育前期培養(yǎng)液及后期培養(yǎng)液培養(yǎng)后，囊胚率和內細胞團數(shù)均要顯著高于NCSU23和 NCSU37。本發(fā)明的目的之一在于提供一種pH值為7. 3 士0. 02的豬早期胚胎發(fā)育前期培養(yǎng) 液，用于豬早期胚胎發(fā)育的前期培養(yǎng)，即前60h的培養(yǎng)，具體成份包括NaCl、KCl、KH2PO4, MgSO4, NaHC03> BSA (牛血清白蛋白)，其特征在于還包括乳酸鈣和丙酮酸鈉。研究表明，高 濃度的葡萄糖對豬4細胞前的胚胎有抑制其體外發(fā)育作用，而在4細胞以后，一定濃度的葡 萄糖則可以促進囊胚的形成。本發(fā)明中，NaCl的主要作用是維持整個培養(yǎng)液的滲透壓(當然其他物質也提供滲透壓);KCL為K離子主要來源(KH2PO4也部分提供K離子)，且生理狀態(tài) 下Na離子和K離子通常維持在一定比例，通常為20:1。KH2PO4和NaHCO3為一對緩沖體系， 主要起維持培養(yǎng)液PH值的作用。BSA起到營養(yǎng)細胞的作用。在豬早期胚胎發(fā)育的前期用低 濃度的Na-pyruvate (丙酮酸鈉)和Ca-(Iactate)2 ·5Η20 (乳酸鈣)代替葡萄糖作為能量物 質，60h后恢復葡萄糖，部分提高了胚胎的發(fā)育效果。同時乳酸鈣中的鈣代替氯化鈣作為鈣 源。較佳地，本發(fā)明的豬早期胚胎發(fā)育前期培養(yǎng)液中，NaCl的濃度為108. 62 mmol/ L、KCl 的濃度為 4. 78mmol/L、KH2PO4 的濃度為 1. 19 mmol/L、MgSO4 的濃度為 1. 2mmol/L、 NaHCO3的濃度為25. 07mmol/L、牛血清白蛋白的濃度為4 g/L、乳酸鈣的濃度為2mmol/L、丙 酮酸鈉的濃度為0. 2^0. 4mmol/L，優(yōu)選0. 34mmol/L。其中本發(fā)明的豬早期胚胎發(fā)育前期培 養(yǎng)液還可包括NCSU23培養(yǎng)液中的其他成份，但不包括CaCl2和葡萄糖，具體為lmmol/L的 Glutamine (谷氨酰胺)、7mmol/L 的 Taurine (牛磺酸)、5mmol/L Hypotaurine (亞牛磺酸)、 0. 075g/L的青霉素G和0. 05g/L的鏈霉素。在本發(fā)明一較佳實施例中，本發(fā)明的豬早期胚胎發(fā)育前期培養(yǎng)液還包括濃度為 0. 5^1. 5mmol/L，優(yōu)選 lmmol/L 的 dbcAMP. NaCDibutyryl cAMP. Na，雙丁酰環(huán)腺苷酸鈉鹽)和 1%的MEM-NEAA (非必需氨基酸)。雙丁酰環(huán)腺苷酸鈉鹽(dbcAMP. Na)的添加用于提高克隆 或孤雌激活胚胎的囊胚率。非必需氨基酸的添加對胚胎的發(fā)育具有協(xié)同促進作用。在本發(fā)明另一較佳實施例中，本發(fā)明的豬早期胚胎發(fā)育前期培養(yǎng)液還包括濃度為 5%的發(fā)情第7d豬血清，以部分模擬體內發(fā)育激素環(huán)境，提高胚胎培養(yǎng)效率。在本發(fā)明再一較佳實施例中，本發(fā)明的豬早期胚胎發(fā)育前期培養(yǎng)液還包括濃度為 3(T50Mmol/L，優(yōu)選40Mmol/L的β _ΜΕ( β -巰基乙醇)，可促進細胞內還原性谷胱甘肽(GSH) 的形成，降低胚胎培養(yǎng)過程中氧自由基的形成，減少液體對胚胎的毒副作用。本發(fā)明的目的之二在于提供一種PH值為7. 3士0.02的豬早期胚胎發(fā)育后期培養(yǎng) 液，用于豬早期胚胎發(fā)育的后期培養(yǎng)，即培養(yǎng)60h后至孵化囊胚階段，具體成份包括NaCl、 KCl、KH2PO4, MgSO4、NaHCO3、牛血清白蛋白、葡萄糖，其特征在于還包括乳酸鈣和丙酮酸鈉。較佳地，本發(fā)明的豬早期胚胎發(fā)育后期培養(yǎng)液中，NaCl的濃度為108. 62 mmol/L、 KCl 的濃度為 4· 78_ο1/L、KH2PO4 的濃度為 1. 19 mmol/L^MgSO4 的濃度為 1. 2謹ol/L、NaHC03 的濃度為25.07mmol/L、牛血清白蛋白的濃度為4 g/L、葡萄糖的濃度為4. 55 mmol/L、乳酸 鈣的濃度為2mmol/L、丙酮酸鈉的濃度為0. 2 0. 4mmol/L，優(yōu)選0. 34mmol/L。其中，本發(fā)明 的豬早期胚胎發(fā)育后期培養(yǎng)液還可包括NCSU23培養(yǎng)液中的其他成份，但不包括CaCl2，具體 為濃度為lmmol/L的谷氨酰胺、7mmol/L的?；撬帷?mmol/L亞?；撬帷?. 075g/L的青霉素 G和0. 05g/L的鏈霉素。在本發(fā)明一較佳實施例中，本發(fā)明的豬早期胚胎發(fā)育后期培養(yǎng)液還包括濃度為 0. 5^1. 5mmol/L，優(yōu)選lmmol/L的雙丁酰環(huán)腺苷酸鈉鹽(dbcAMP. Na)和1%的非必需氨基酸， dbcAMP. Na的添加用于提高克隆或孤雌激活胚胎的囊胚率。非必需氨基酸的添加對胚胎的 發(fā)育具有協(xié)同促進作用。在本發(fā)明另一較佳實施例中，本發(fā)明的豬早期胚胎發(fā)育后期培養(yǎng)液還包括濃度為 5%的發(fā)情第7d豬血清，以部分模擬體內發(fā)育激素環(huán)境，提高胚胎培養(yǎng)效率。在本發(fā)明再一較佳實施例中，本發(fā)明的豬早期胚胎發(fā)育后期培養(yǎng)液還包括濃度為3(T50MfflOl/L，優(yōu)選40Mfflol/L的β-巰基乙醇，可促進細胞內還原性谷胱甘肽(GSH)的形成， 降低胚胎培養(yǎng)過程中氧自由基的形成，減少液體對胚胎的毒副作用。本發(fā)明的目的之三在于提供一種豬胚早期胎的培養(yǎng)方法，其特征在于，先使用豬 早期胚胎發(fā)育前期培養(yǎng)液對豬胚胎進行培養(yǎng)，60小時后再使用豬早期胚胎發(fā)育后期培養(yǎng)液 對豬胚胎進行培養(yǎng)。本發(fā)明的優(yōu)點在于
1、合并使用本發(fā)明的豬早期胚胎發(fā)育前期及后期培養(yǎng)液于核移植和孤雌激活胚胎上， 可獲得高于NCSU23和NCSU37囊胚發(fā)育率；
2、利用本發(fā)明的豬早期胚胎發(fā)育前期及后期培養(yǎng)液所獲得的囊胚質量要好于NCSU23 和NCSU37，具體表現(xiàn)在囊胚細胞數(shù)高于NCSU23和NCSU37。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明的豬早期胚胎前期培養(yǎng)液及后期培養(yǎng)液
表1 NCSU23、NCSU37和本發(fā)明的豬早期胚胎發(fā)育前、后期培養(yǎng)液的成份 注上述液體按照IOOmL體積進行配制，單位為克。(括號外數(shù)字的單位為克，括號內的 數(shù)字是換算后的濃度，單位為mmol/L)
權利要求
1.一種豬早期胚胎發(fā)育前期培養(yǎng)液，其PH值為7. 3士0.02，包括如下成份NaCl、KCl、 KH2PO4, MgSO4, NaHCO3、牛血清白蛋白，其特征在于還包括乳酸鈣和丙酮酸鈉。
2.如權利要求1所述的豬早期胚胎發(fā)育前期培養(yǎng)液，其特征在于NaCl的濃度為108.62 mmol/L、KCl 的濃度為 4. 78mmol/L、KH2PO4 的濃度為 1. 19 mmol/L、MgS04 的濃度為 1. 2mmol/ L、NaHC03的濃度為25. 07mmol/L、牛血清白蛋白的濃度為4 g/L、乳酸鈣的濃度為2mmol/L、 丙酮酸鈉的濃度為0. 2^0. 4mmol/L，優(yōu)選0. 34mmol/L，其中還包括濃度為lmmol/L的谷氨酰 胺、7mmol/L的牛磺酸、5mmol/L亞?；撬?、0. 075g/L的青霉素G和0. 05g/L的鏈霉素。
3.如權利要求2所述的豬早期胚胎發(fā)育前期培養(yǎng)液，其特征在于還包括濃度為 0. 5^1. 5mmol/L，優(yōu)選lmmol/L的雙丁酰環(huán)腺苷酸鈉鹽和1%的非必需氨基酸。
4.如權利要求2所述的豬早期胚胎發(fā)育前期培養(yǎng)液，其特征在于還包括濃度為5%的發(fā) 情第7天豬血清。
5.如權利要求2所述的豬早期胚胎發(fā)育前期培養(yǎng)液，其特征在于還包括濃度為 3(T50Mmol/L，優(yōu)選 40Mmol/L 的 β -巰基乙醇。
6.一種豬早期胚胎發(fā)育后期培養(yǎng)液，其ρΗ值為7. 3士0.02，包括如下成份NaCl、KCl、 KH2P04、MgS04、NaHC03、牛血清白蛋白、葡萄糖，其特征在于還包括乳酸鈣和丙酮酸鈉。
7.如權利要求6所述的豬早期胚胎發(fā)育后期培養(yǎng)液，其特征在于NaCl的濃度為108.62 mmol/L、KCl 的濃度為 4. 78mmol/L、KH2PO4 的濃度為 1. 19 mmol/L、MgS04 的濃度為 1. 2mmol/ L、NaHCO3的濃度為25. 07mmol/L、牛血清白蛋白的濃度為4 g/L、葡萄糖的濃度為4. 55 mmol/L、乳酸鈣的濃度為2mmol/L、丙酮酸鈉的濃度為0. 2^0. 4mmol/L，優(yōu)選0. 34mmol/L，其 中還包括濃度為lmmol/L的谷氨酰胺、7mmol/L的牛磺酸、5mmol/L亞?；撬?、0. 075g/L的青 霉素G和0. 05g/L的鏈霉素。
8.如權利要求7所述的豬早期胚胎發(fā)育后期培養(yǎng)液，其特征在于還包括濃度為 0. 5^1. 5mmol/L，優(yōu)選lmmol/L的雙丁酰環(huán)腺苷酸鈉鹽和1%的非必需氨基酸。
9.如權利要求7所述的豬早期胚胎發(fā)育后期培養(yǎng)液，其特征在于還包括濃度為5%的發(fā) 情第7天豬血清。
10.如權利要求7所述的豬早期胚胎發(fā)育后期培養(yǎng)液，其特征在于還包括濃度為 3(T50Mmol/L，優(yōu)選 40Mmol/L 的 β -巰基乙醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬早期胚胎(適用于豬孵化囊胚前的胚胎)發(fā)育前期培養(yǎng)液(前60h)和一種豬早期胚胎發(fā)育后期培養(yǎng)液(培養(yǎng)60h后至孵化囊胚階段)，其在不含CaCl2的NCSU23培養(yǎng)液基礎上添加了乳酸鈣、丙酮酸鈉、β-巰基乙醇、dbcAMP.Na、非必需氨基酸和發(fā)情第7d豬血清。另外，本發(fā)明的豬早期胚胎發(fā)育前期培養(yǎng)液與豬早期胚胎發(fā)育后期培養(yǎng)液的區(qū)別在于前者不含有葡萄糖，后者含有葡萄糖，具體對豬早期胚胎進行培養(yǎng)時，先使用本發(fā)明的豬早期胚胎發(fā)育前期培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，60h后再換成本發(fā)明的豬早期胚胎發(fā)育后期培養(yǎng)液。如此一來，可大大提高囊胚發(fā)育率和囊胚質量。
文檔編號C12N5/073GK102093978SQ20101059387
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權日2010年12月17日
發(fā)明者吳彩鳳, 張廷宇, 張德福, 張樹山, 戴建軍 申請人:上海市農業(yè)科學院