專利名稱：一種用于轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和棉花檢測的標準質(zhì)粒分子及其構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的質(zhì)粒分子，具體來說，涉及一種轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和棉花檢測用標準質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
自從轉(zhuǎn)基因植物商業(yè)化以來，全球轉(zhuǎn)基因植物種植面積不斷擴大，1996年到2009 年全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植面積累計達到6. 9億公頃，10多年間轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植面積增長了 67倍。種植的轉(zhuǎn)基因作物主要是轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因玉米和轉(zhuǎn)基因棉花。轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積最大，5860萬公頃，占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的57%，其次是轉(zhuǎn)基因玉米(2520 萬公頃，占25% )和轉(zhuǎn)基因棉花(1340萬公頃，占13% )。隨著轉(zhuǎn)基因作物的廣泛種植，其安全性問題引起了全球公眾的普遍重視。在許多國家特別是歐洲聯(lián)盟，國家立法要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行標簽說明。我國于2001年5月23日發(fā)布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》，2002年1月5 日公布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價、標識和進口安全管理二個配套管理辦法，確定了第一批實施標識管理的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物目錄，并于2002年3月20日起正式實施。標識制度的實施依賴于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)。目前，國際上還沒有統(tǒng)一的轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的標準化檢測方法。綜合各國的檢測方法，主要有兩種類型，即基于外源基因表達產(chǎn)物-蛋白質(zhì)檢測和基于外源基因插入的DNA檢測。針對插入的外源DNA序列，PCR方法應(yīng)用最廣。PCR檢測策略可以分為四種，即通用元件篩選檢測、基因特異性檢測、構(gòu)建特異性檢測和品系特異性檢測。通用元件篩選PCR檢測主要是以轉(zhuǎn)基因通用元件CaMV35S啟動子和NOS終止子為目的基因片段；基因特異性PCR檢測是以插入外源基因的特異性DNA片段作為目的檢測片段；品系特異性PCR檢測是通過檢測外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列實現(xiàn)的。由于每一個轉(zhuǎn)基因植物品系，都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列，并且連接區(qū)序列是單拷貝，所以品系特異性檢測方法具有較高的特異性和準確性。品系特異性檢測已經(jīng)成為目前轉(zhuǎn)基因檢測研究的重點，并逐步地為國際各檢測實驗室所采用。在應(yīng)用PCR檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品時，需要設(shè)置陽性對照來對檢測活動進行監(jiān)控。通常以從陽性標準品(CRMs)中提取的基因組DNA作為陽性對照，但由于轉(zhuǎn)基因作物存在生物安全性和和現(xiàn)有技術(shù)的限制，轉(zhuǎn)基因作物陽性標準品很難獲得，因此亟需研制新型陽性對照材料，以滿足不斷發(fā)展的轉(zhuǎn)基因檢測需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和棉花檢測用標準質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法，使其可以代替陽性標準物質(zhì)用于轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和棉花的定性和定量PCR檢測。利用融合PCR技術(shù)的原理設(shè)計了玉米Hmg基因、轉(zhuǎn)基因玉米Btl76和MonSlO品系的3'端轉(zhuǎn)化事件的PCR融合引物，經(jīng)過融合PCR擴增獲得了二基因的融合片段。利用分了克隆技術(shù)將融合片段插入到質(zhì)粒分子PTLE8(專利申請?zhí)?201010286884.幻，獲得了組質(zhì)粒分子pTLHIO。本發(fā)明構(gòu)建的標準質(zhì)粒分子pTLHIO可以作為檢測過程中的陽性對照，為解決轉(zhuǎn)基因作物檢測中標準物質(zhì)缺乏的難題提供一條有效途徑并能有效地保障檢測工作的進行。本發(fā)明是通過以下實驗方案實現(xiàn)的，本發(fā)明所述標準質(zhì)粒分子，以替代轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS40-3-2和轉(zhuǎn)PAT大豆、轉(zhuǎn)基因玉米Bt 176和Mon810品系、轉(zhuǎn)基因Bt棉，用于定性和定量PCR檢測。該標準質(zhì)粒分子含有大豆內(nèi)參基因LeCtinl、35S啟動子、NOS終止子、 PAT基因、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2品系的5'端轉(zhuǎn)化事件序列、棉花內(nèi)源基因Sad特異性片段、轉(zhuǎn)Bt基因棉花的外源基因CrylAb/c融合基因的特異性片段、玉米內(nèi)參基因Hmg特異性片段、轉(zhuǎn)基因玉米Btl76品系的3'端轉(zhuǎn)化事件和MonSlO品系的3端轉(zhuǎn)化事件特異性片段的部分序列。本發(fā)明所述的一種轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和棉花檢測用標準質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法， 包括以下步驟(1)利用GcnBank數(shù)據(jù)庫查找并獲得玉米內(nèi)參基因Hmg、轉(zhuǎn)基因玉米Btl76品系的 3'端轉(zhuǎn)化事件和MonSlO品系的3'端轉(zhuǎn)化事件特異性序列；(2)利用Primer Premier 5. O軟件設(shè)計PCR特異性引物并進行blast驗證；(3)分別擴增上述三個基因；(4)采用融合PCR方法將三個基因拼接成一個片段；第一輪反應(yīng)以轉(zhuǎn)基因玉米Btl76和Mon810的基因組DNA為模板，以權(quán)利要求 3中對應(yīng)引物進行PCR擴增；反應(yīng)體系為總體積為50 μ 1，其中10倍Taq緩沖液5 μ 1， dNTPs(10mM)4y 1，上下游引物(10 μ M)各 2μ 1，模板(IOOng/μ 1) 1 μ 1，用 ddH20 補足至 50 μ 1。反應(yīng)程序為95"C 5min ；30 個循環(huán)(94 "C 30s, 58. 2-59. 6 "C 30s, 72 "C 60s)； 72°C IOmin ；4°C保存；產(chǎn)物標記為 PHmg、PBt、PM。n ；第二輪反應(yīng)，分兩步進行擴增第一步取第一輪反產(chǎn)物各70ng，10倍Taq緩沖液5 μ 1，dNIPs (IOmM) 4 μ 1，用 (MH2O 補足至 50 μ 1 ；使 PHmg、Pbo PMon 相連接；反應(yīng)程序11個循環(huán)(94°C 15s，60°C 20s，72°C 10min)，4°C保存；第二步向第一步反應(yīng)液中分別加入引物Bt-Pl和Hmg-P2各1 μ 1 ；反應(yīng)程序94°C3min,28 個循環(huán)(94°C 15s，60°C lmin，72°C 2min)，4°C保存；將融合PCR產(chǎn)物割膠純化后標記為PBH3。(5)因收純化PBH13，連接于pMD 19-TSimple載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10篩選得到中間質(zhì)粒分子PTBH3。(6)將質(zhì)粒分子pTLE8和pTBH3分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I和)(bal進行雙酶切， 回收這兩種酶切產(chǎn)物，用T4DNA連接酶連接獲得質(zhì)粒分子pTLHIO。(7)標準質(zhì)粒分子pTLHIO的定量PCR檢測方法驗證。所述的定量PCR驗證，是指用定量PCR方法分析構(gòu)建的標準質(zhì)粒分子pTLHIO中玉米內(nèi)源基因HmgI和轉(zhuǎn)基因玉米Btl76、Mon810品系轉(zhuǎn)化事件特異性序列的定量檢測極限以及重復(fù)性和重演性等特性，以鑒定該標準質(zhì)粒分子代替陽性標準物質(zhì)的能力本發(fā)明有益結(jié)果在于，利用融合PCR、酶切、連接等分子克隆技術(shù)構(gòu)建了含有十個基因的標準質(zhì)粒分子pTLHIO。此標準質(zhì)粒分子可以代替陽性標準物質(zhì)用于轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和棉花的定量PCR檢測，很好的解決了檢測過程中陽性標注物質(zhì)缺乏的問題，在檢測過程中無需提供多種陽性基因組DNA作為陽性對照；將該標準質(zhì)粒分了轉(zhuǎn)入大腸桿菌，可長其穩(wěn)定保存；也可以在原有標準質(zhì)粒分子的基礎(chǔ)上加入新的外源基因片段，以滿足日益增多的轉(zhuǎn)基因作物材料檢測的需要。此標準質(zhì)粒分子PTLHlO在實際檢測中具有較高的特異性和重復(fù)性、靈敏度高等優(yōu)點，應(yīng)用該標準質(zhì)粒分子進行實際樣品定量分析時，樣品檢測結(jié)果的偏差在國際上廣泛認可的允許范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明中構(gòu)建的標準質(zhì)粒分子PTLHlO完全適用于對轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和棉花及其加工產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因成分含量的定量分析。


附圖為十基因標準質(zhì)粒分子pTLHIO的測序結(jié)果斜體加粗的為融合PCR引物，在十基因之間引入了四個限制性內(nèi)切酶NotI，Sail， EcoR I和)(ba I。方框內(nèi)為定量PCR的引物和探針序列。
具體實施例方式為了更充分的解釋本發(fā)明的實施，提供轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和棉花標準分子對照物的制備實施實例。這些實施實例僅僅是解釋而不是限制分發(fā)明的范圍。下列實施例中未標明具條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件操作實施例1 標準質(zhì)粒分子的構(gòu)建一、實驗材料轉(zhuǎn)基因玉米Btl76品系和Mon810品系；非轉(zhuǎn)基因玉米品種。二、實驗試劑pMD 19-T Simple Vector購自大連寶生物工程公司；dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA marker I、II和marker III購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶Not I.Sal I、EcoR I, Xba I購自NEB北京有限公司；質(zhì)?；蚪MDNA提取及純化采用北京天根生化科技有限公司研制的質(zhì)粒小量提取試劑盒；其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。三、實驗儀器TC-512型PCR擴增儀(英國TECHNE公司)；Geliance 200DNA電泳凝膠成像儀 (美國PerkinElmer公司)；Nano-Drop ND-1000核酸蛋白儀(美國Nano Drop公司)；離心機；恒溫水浴鍋；培養(yǎng)箱；天平等。四、試驗方法和過程1、植物基因組DNA提取-SDS法a、稱取0. Ig經(jīng)粉碎機粉碎的玉米樣品，加入Iml 65°C預(yù)熱的2% SDS抽提液， 10 μ IRNase-A混勻，于65°C溫育30min，置于室溫后13000r離心lOmin。b、取上清加0. 6倍體積的KAc，冰浴20min后，13000r離心lOmin，取上清加2倍體積預(yù)冷無水乙醇，混勻。c、于-20°C靜置30min，13000r離心lOmin，充上清，沉淀用70%乙醇洗滌，短時間離心后棄上清，重復(fù)一次。自然干燥后加200μ1 TE溶沉淀，20°C保存。d、取2 μ 1提取的DNA樣品，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。利用核酸儀測定所提取的DNA濃度和純度。2、引物設(shè)計在GenBank中搜索玉米內(nèi)源基因Hmg、轉(zhuǎn)基因玉米Btl76品系和Mon810品系的3 ‘ 端轉(zhuǎn)化事件特異性序列，利用軟件ft~imer5. 0設(shè)計3對定性PCR引物，分別用于擴增玉米內(nèi)參基因特異性序列Hmg、轉(zhuǎn)基因玉米Btl76品系和MonSlO品系的3'端轉(zhuǎn)化事件特異性序列。具體引物序列見表1。表1構(gòu)建標準質(zhì)粒分子的PCR引物序列
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和棉花檢測用標準質(zhì)粒分子，其特征在于，含有大豆內(nèi)參基因Lectin 1、35S啟動子、NOS終止子、PAT基因、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2品系的5'端轉(zhuǎn)化事件35SG、棉花內(nèi)源基因Sad特異性片段、轉(zhuǎn)Bt基因棉花的外源基因CrylAb/c融合基因的特異性片段、玉米內(nèi)參基因Hmg特異性片段、轉(zhuǎn)基因玉米Btl76品系的3'端轉(zhuǎn)化事件和MonSlO品系的3'端轉(zhuǎn)化事件特異性片段的部分序列，其先后順序為Lectin l+35S+N0S+PAT+35SG+Sad+Cryl Ab/c+Bt176+Mon81O+Hmg
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和棉花檢測用標準質(zhì)粒分子，其特征是，所述的大豆內(nèi)源基因Lectin、棉花內(nèi)源基因Sad和玉米內(nèi)源基因Hmg，分別指的是大豆凝集素基因、硬脂酰-酰基載體蛋白脫飽和酶基因和玉米內(nèi)生高遷移率族基因，其在大豆、玉米和棉花基因組中高度保守，具有種間特異性、種內(nèi)非特異性和單拷貝數(shù)的特點；所述的篩選序列35S是指花椰菜花葉病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV) 35S啟動子；所述的NOS是指根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因(N0Q終止子；所述的PAT基因是指草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(PAT)；所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2品系的5'端轉(zhuǎn)化事件35SG是指外源插入載體與大豆基因組的連接區(qū)序列；所述的CrylAb/c是指殺蟲晶體蛋白CrylAb、CrylAc基因的融合基因(CrylAb/c)；所述的轉(zhuǎn)基因玉米Btl76品系3 ‘端轉(zhuǎn)化事件是指外源插入載體與玉米基因組的連接區(qū)序列；所述的轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO品系3'端轉(zhuǎn)化事件是指外源插入載體與玉米基因組的連接區(qū)序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和棉花檢測用標準質(zhì)粒分子，其中轉(zhuǎn)基因玉米Btl76品系的3'端轉(zhuǎn)化事件、MonSlO品系的3'端轉(zhuǎn)化事件和玉米內(nèi)參基因Hmg特異性序列的引物序列如下13標基W引物…物序列(5'-3')產(chǎn)物人小(bp)Btl 76Bt-PlGGAATTCGAAGTCCCTGGAGGCACABt-P2AGGTCTTGGCTGTCTTC-ACTCCGTGGGCGTGGTAT372Mon810Mon-PlATACCACGCCCACGGAGT-GAAGACAGCCAAGACCTMon-P2AAAGTCAAAGTAGATACrT-TTACATCTAAGAAGGATTCTCA365HmgHmg-PlrGAGAA'I'CC'n'CrrAGAI'GrAA-ACTATCTACTTTGACTTTHmg-P2GCTCTAGA GAAGCATCAGTTTCCCTACC.354
4. 一種如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和棉花檢測用標準質(zhì)粒分子的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟第一輪反應(yīng)以轉(zhuǎn)基因大豆Btl76品系、轉(zhuǎn)基因玉米MonS 10品系基因組DNA為模板，以權(quán)利要求3中對應(yīng)引物進行PCR擴增；反應(yīng)體系為總體積為50μ 1，其中10倍Taq緩沖液 5 μ 1，dNTPs(10mM)4y 1，上下游引物(10 μ M)各 2μ 1，模板(IOOng/μ 1) 1 μ 1，用 ddH20 補足至50 μ 1。反應(yīng)程序為95 "C 5min ；30 個循環(huán)(94 "C 30s, 58. 2-59. 6 "C 30s, 72 "C 60s)； 72°C IOmin ；4°C保存；產(chǎn)物標記為 PHmg、PBt、PM。n ； 第二輪反應(yīng)，分兩步進行擴增第一步取第一輪反應(yīng)產(chǎn)物各70ng，10倍Taq緩沖液5μ l，dNTPs(10mM)4y 1，用ddH20 補足至50 μ 1 ；使PHmg、PBt、PMon相連接；反應(yīng)程序11 個循環(huán)(94°C 15s，60°C 20s, 72°C 10min)，4°C保存；第二步向第一步反應(yīng)液中分別加入引物Bt-Pl和Hmg-P2各1μ 1 ； 反應(yīng)程序94°C 3min,28 個循環(huán)(94°C 15s，60°C lmin，72°C 2min)，4°C保存；將融合 PCR產(chǎn)物割膠純化后標記為PBH3。將融合純化產(chǎn)物Pbh3連接于pMD 19-T Simple載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10篩選得到中間質(zhì)粒分子PTBH3。將質(zhì)粒分子pTLE8和pTBH3分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I和)(ba I進行雙酶切，分別回收酶切目的片段BH3和pTLE7，用T4DNA連接酶連接獲得質(zhì)粒分子pTLHIO。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因作物檢測中必要的標準質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法。將八基因質(zhì)粒分子pTLE8(專利申請?zhí)?01010286884.3)進行改造，增加轉(zhuǎn)基因玉米Bt176品系和Mon810品系的3′端轉(zhuǎn)化事件特異性序列和玉米內(nèi)參基因Hmg特異性序列的融合片段，改造成十基因的質(zhì)粒分子pTLH10(Lec1，35S，NOS，PAT，Sad1，Cry1Ab/c，Bt176，Mon810和Hmg)。本發(fā)明中構(gòu)建的標準質(zhì)粒分子完全可以代替陽性標準品，適用于對轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2品系、轉(zhuǎn)基因玉米Bt176和Mon810品系及轉(zhuǎn)Bt基因棉花的篩選、基因特異性和品系特異性的定性和定量PCR分析和檢測。
文檔編號C12N15/63GK102559854SQ201010595049
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月20日
發(fā)明者楊雅麟, 滕達, 王建華, 王秀敏 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所