專利名稱：一種h9亞型禽流感病毒檢測試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種H9亞型禽流感病毒檢測試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
禽流感是由正黏病毒科流感病毒屬的禽類A型流感病毒(Influenza A virus)引 起的一類禽類烈性傳染病。根據(jù)血凝素與神經(jīng)氨酸酶的抗原性不同，可分為16個(gè)H亞型 (H1-H16)和9個(gè)N亞型(N1-N9)。1966年在美國首次分離到H9亞型禽流感病毒，隨后中國 大陸、香港、韓國、中東、歐洲以及北美等國家和地區(qū)均有報(bào)道。中國大陸自1994年首次分 離到H9亞型禽流感病毒后，開始廣泛流行，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。家禽感染H9亞型禽流感病毒，特別當(dāng)伴有混合感染時(shí)，可導(dǎo)致病禽高死亡率及產(chǎn) 蛋率嚴(yán)重下降。有文獻(xiàn)報(bào)道香港曾從患有流感的兒童體內(nèi)分離出H9N2禽流感病毒。因此， 該病不僅對(duì)養(yǎng)禽業(yè)有較大危害，而且威脅著人類健康。目前已有多種方法用于H9亞型禽流感病毒的檢測，大致可以分為病原學(xué)、血清 學(xué)以及分子生物學(xué)三類。病原學(xué)方法主要包括組織學(xué)診斷、動(dòng)物接種試驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng) 法。血清學(xué)方法主要包括瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)、血液凝集試驗(yàn)(HA)、血液凝集抑制 試驗(yàn)(HI)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。分子生物學(xué)方法組要包括各種反轉(zhuǎn)錄聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)、核酸恒溫?cái)U(kuò)增法(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)等。上述方法均存在不同的缺點(diǎn)，如操作復(fù)雜、費(fèi) 時(shí)、設(shè)備昂貴等缺點(diǎn)，不適于基層應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種H9亞型禽流感病毒檢測試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明 提供的試劑盒基于反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)技術(shù)，可以快速檢測H9亞型禽流感病毒。本發(fā)明提供了檢測H9亞型禽流感病毒的專用引物，由以下三對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 所用引物組成；一對(duì)引物是與H9亞型禽流感病毒的HA基因(GenBank Accession Number EU644482)結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是與H9亞型禽流感病毒的HA基因(GenBank Accession Number EU644482)結(jié)合的外側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是與H9亞型禽流感病毒的HA 基因(GenBank Accession Number EU644482)結(jié)合的環(huán)形引物對(duì)。H9亞型禽流感病毒的HA基因的核苷酸序列具體可如序列表的序列1所示 (GenBank Accession Number EU644482)。所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)由上游引物FIP和下游引物BIP組成，所述上游引物FIP的核苷 酸序列具體可為序列表中的序列4，所述下游引物BIP的核苷酸序列具體可為序列表中的 序列5 ；所述外側(cè)引物對(duì)由上游引物F3和下游引物B3組成，所述上游引物F3的核苷酸序 列具體可為序列表中的序列2，所述下游引物B3的核苷酸序列具體可為序列表中的序列3 ； 所述環(huán)形引物對(duì)由上游引物L(fēng)F和下游引物L(fēng)B組成，所述上游引物L(fēng)F的核苷酸序列具體可為序列表中的序列6，所述下游引物L(fēng)B的核苷酸序列具體可為序列表中的序列7。應(yīng)用所述專用引物檢測H9亞型禽流感病毒的原理如下根據(jù)H9亞型禽流感病毒的HA基因設(shè)計(jì)一組用于反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物， 即內(nèi)側(cè)引物對(duì)(上游引物FIP和下游引物BIP)、外側(cè)引物對(duì)(上游引物F3和下游引物B3) 和環(huán)形引物對(duì)(上游引物L(fēng)F和下游引物L(fēng)B)。三對(duì)引物和H9亞型禽流感病毒HA基因序列 保守區(qū)的八個(gè)特定區(qū)域的序列完全配對(duì)(見表1)，可以確保反應(yīng)的徹底進(jìn)行，也保證了檢 測方法的特異性。由于引物識(shí)別的8個(gè)區(qū)域是通過比對(duì)最近幾年所有H9亞型禽流感病毒 的HA基因(包括H9W至H9N9)尋找出的保守區(qū)，所以所述專用引物能特異性的識(shí)別所有 H9亞型的禽流感病毒。表1專用引物與H9亞型禽流感病毒的HA基因的結(jié)合區(qū)域
權(quán)利要求
1.一種檢測H9亞型禽流感病毒的專用引物，由以下三對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增所用引物組 成；一對(duì)引物是與H9亞型禽流感病毒的HA基因結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是與H9亞型 禽流感病毒的HA基因結(jié)合的外側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是與H9亞型禽流感病毒的HA基因結(jié)合 的環(huán)形引物對(duì)；所述HA基因如GenBank Accession Number EU644482中所示。
2.如權(quán)利要求1所述的專用引物，其特征在于所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)由上游引物FIP和下 游引物BIP組成，所述上游引物FIP的核苷酸序列是序列表中的序列4，所述下游引物BIP 的核苷酸序列是序列表中的序列5;所述外側(cè)引物對(duì)由上游引物F3和下游引物B3組成，所 述上游引物F3的核苷酸序列是序列表中的序列2，所述下游引物B3的核苷酸序列是序列表 中的序列3 ；所述環(huán)形引物對(duì)由上游引物L(fēng)F和下游引物L(fēng)B組成，所述上游引物L(fēng)F的核苷 酸序列是序列表中的序列6，所述下游引物L(fēng)B的核苷酸序列是序列表中的序列7。
3.權(quán)利要求1或2所述的專用引物在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒用于輔助鑒定 H9亞型禽流感病毒和/或檢測待測樣本是否含有H9亞型禽流感病毒。
4.一種含有權(quán)利要求1或2所述的專用引物的試劑盒；所述試劑盒用于輔助鑒定H9亞 型禽流感病毒和/或檢測待測樣本是否含有H9亞型禽流感病毒。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括溶液A；所述溶液A是 將溶質(zhì)溶于水得到的；所述溶質(zhì)及其濃度如下KC1為16. 67nmol/y 1, MgSO4 · 7H20為 13. 33nmol/y 1，(NH4)2SO4 為 16. 67nmol/y 1，鈣黃綠素為 0. 083nmol/y 1，MnCl2 · 4H20 為 lnmol/μ l，dNTPs 各 2. 33nmol/y 1，甜菜堿為 0. 33ymol/y 1，Tris-HCl 為 33. 33nmol/y 1， Tween-20為0· 17% (體積百分含量)，所述上游引物F3為0. 28-0. 39pmol/μ 1，所述下游 引物Β3為0. 28-0. 39ρπι01/μ 1，所述上游引物FIP為2. 22-3. Ilpmol/μ 1，所述下游引物 BIP為2. 22-3. Ilpmol/μ 1，所述上游引物L(fēng)F為1. 11-1. 55pmol/μ 1，所述下游引物L(fēng)B為 1. 11-1. 55pmol/ μ 1。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述溶液A中，所述上游引物F3為 0. 33ρπιο1/μ 1，所述下游引物B3為0. 33pmol/μ 1，所述上游引物FIP為2. 67ρπιο1/μ 1，所 述下游引物BIP為2. 67ρπι01/μ 1，所述上游引物L(fēng)F為1. 33pmol/μ 1，所述下游引物L(fēng)B為 1.33pmol/μ 1。
7.如權(quán)利要求4或5或6所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括溶液B；所 述溶液B由溶劑和溶質(zhì)組成；所述溶劑為水；所述溶質(zhì)及其濃度如下Bst DNA聚合酶為 7. 52U/ μ 1, AMV 反轉(zhuǎn)錄酶為 0. 6U/ μ 1。
8.—種檢測來自死亡動(dòng)物的樣品中是否攜帶Η9亞型禽流感病毒的方法，是用權(quán)利要 求1或2所述專用引物對(duì)來自死亡動(dòng)物的樣品的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)， 檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，確定來自死亡動(dòng)物的樣品中是否攜帶Η9亞型禽流感病毒；所述環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增反應(yīng)的條件為60-65°C、60-90分鐘。
9.權(quán)利要求1或2所述專用引物或權(quán)利要求4至6中任一所述試劑盒在輔助鑒定H9 亞型禽流感病毒中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1或2所述專用引物或權(quán)利要求4至6中任一所述試劑盒在檢測待測樣 本是否含有H9亞型禽流感病毒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種H9亞型禽流感病毒檢測試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的試劑盒，包括三對(duì)引物，即與H9亞型禽流感病毒的HA基因結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物對(duì)、外側(cè)引物對(duì)和環(huán)形引物對(duì)。本發(fā)明的H9亞型禽流感病毒檢測試劑盒，檢測靈敏度高，最低可檢測出100.5EID50的病毒，操作簡單方便，特別適于基層現(xiàn)場進(jìn)行的臨床醫(yī)學(xué)檢測及食品中可能污染的H9亞型禽流感病毒的檢測。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102121057SQ201010598148
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者吳文學(xué), 張躍偉, 蔣菲, 黃書林 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)