專利名稱：冠突散囊菌快速分離方法
技術領域：
本發(fā)明涉及農產品加工技術領域，具體涉及茯磚茶優(yōu)勢菌冠突散囊菌快速分離方 法，冠突散囊菌俗稱金花。
背景技術：
一直以來，茯磚茶是作為邊疆少數(shù)名族日常生活中不可或缺的必備品，在邊疆享 有“寧可三日無糧，不可一日無茶”的美譽，其奧妙與茯磚茶的品質風味是不可分割的。發(fā) 花是形成茯磚茶獨特品質風味的關鍵工藝，其目的是通過對外界條件(如溫、濕度等)的 控制促使茯磚茶中的優(yōu)勢菌種——冠突散囊菌生長繁殖，從而使茯磚茶具備獨特的品質風 味。該菌俗稱金花，歷來邊疆少數(shù)民族通過判斷金花質量和數(shù)量來衡量茯磚茶的品質優(yōu)劣。茯磚茶因具有獨特的金花菌以及品質風味而聞名，邊疆少數(shù)名族更是將金花視為 衡量茯磚茶品質的標志，金花菌慢慢便成為人們研究的焦點，快速分離成品茯磚茶中金花 菌是研究的基礎。因此，目前亟待研制一種能在短期內從成品茯磚茶中快速分離金花菌的 方法，基本無雜菌，滿足不同品牌茯磚茶金花菌分離需要、操作性強。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是解決上述現(xiàn)有技術存在的問題，而提供一種用于 茯磚茶優(yōu)勢菌冠突散囊菌快速分離方法，實現(xiàn)在短期內從成品茯磚茶中快速分離冠突散囊 菌即金花菌，而且無雜菌，滿足不同品牌茯磚茶中金花菌的分離需要，而且可操作性強。本發(fā)明采用的技術方案是這種冠突散囊菌快速分離方法，其具體步驟為1)成品茯磚茶的處理；2)冠突散囊菌發(fā)酵液的制備；3)冠突散囊菌快速分離培養(yǎng)基的制備；4)冠突散囊菌的培養(yǎng)、純化；5)冠突散囊菌的保存。上述技術方案中，所述的成品茯磚茶的處理是用植物微型粉碎機將樣品粉碎，200 目過篩、65°C干燥2小時后稱取Ig樣品，定容10mL，配成濃度為10—1、10_2、10_3、10_4、10_5各 IOmL,取10_3、10_4、10_5三個梯度準備涂布改良PDA平板；上述技術方案中，所述的冠突散囊菌發(fā)酵液的制備方法為接種實驗室已經分離 純化的冠突散囊菌于PDA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD值0. 6-0. 8，用0. 2 μ m過濾膜進行 過濾滅菌，即為制備好的發(fā)酵液；上述技術方案中，所述的冠突散囊菌快速分離培養(yǎng)基的制備是為改良PDA固體 培養(yǎng)基，改良方法為按照常規(guī)方法配制PDA固體培養(yǎng)基，滅菌結束后冷卻至50°C左右，按照 培養(yǎng)基量和冠突散囊菌發(fā)酵液體積比10 1添加制備好的發(fā)酵液，趁熱到平板；上述技術方案中，所述的冠突散囊菌的培養(yǎng)、純化為取濃度10-3、10_4、10-5三個梯 度各0. 5mL涂布于改良PDA平板超凈臺上吹干，培養(yǎng)2_3天，挑取金黃色優(yōu)勢菌落，畫線接種至同樣的改良PDA平板上，同樣條件繼續(xù)培養(yǎng)直至純化；結果判定當冠突散囊菌落 呈現(xiàn)金黃色，菌落形態(tài)相同、大小一致，無其它雜菌生長即表示冠突散囊菌已經純化分離。上述技術方案中，所述的冠突散囊菌的保存為用改良PDA斜面管保存于4°C冰箱 中或用改良PDA液體培養(yǎng)基制成孢子懸液加50%滅菌甘油于-70°C冰箱保存。上述技術方案中，所述的PDA指Potato Dextrose Agar的簡稱，中文含義為馬鈴 薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。PDA液體培養(yǎng)基指將馬鈴薯洗凈去皮，稱取200g，切成小塊放入燒杯中，加適量蒸 餾水，煮沸1小時，稍冷后用雙層紗布過濾，最后加入蔗糖20g，混勻，用量筒定容至IOOOmL, 趁熱分裝在三角瓶中，在1. lkg/cm2(12rC )中保持20分鐘滅菌。PDA平板指培養(yǎng)基滅菌結束后冷卻至50 0C左右，在超凈工作臺上將培養(yǎng)基倒入事 先已經滅菌并干燥的培養(yǎng)皿中，待冷卻即為制得的PDA培養(yǎng)基平板。改良PDA固體培養(yǎng)基指將馬鈴薯洗凈去皮，稱取200g，切成小塊放入燒杯中，加適 量蒸餾水，煮沸1小時，稍冷后用雙層紗布過濾，在濾液中加IOOmL制備好的茶汁，然后加入 15g瓊脂，加熱熔化，最后加入蔗糖20g，混勻，用量筒定容至IOOOmL,趁熱分裝在三角瓶中， 在1. lkg/cm2(121°C)中保持20分鐘滅菌。滅菌結束后冷卻至50°C左右，在超凈工作臺上 將10%茶汁的PDA瓊脂固體培養(yǎng)基倒入事先已經滅菌并干燥的培養(yǎng)皿中，待冷卻即為制得 的10%茶汁的PDA瓊脂固體培養(yǎng)基平板。改良PDA固體培養(yǎng)基在冠狀散囊菌快速分離技術指10%茶汁的PDA培養(yǎng)基按照 上述方法制備，滅菌結束后冷卻至50°C左右，按照培養(yǎng)基量和冠狀散囊菌發(fā)酵液體積比 10 1添加制備好的冠狀散囊菌發(fā)酵液，趁熱到平板，即為冠狀散囊菌快速分離培養(yǎng)基平 板，亦即改良PDA固體培養(yǎng)基平板。畫線接種指用滅菌的接種針在超凈臺中將已經生長好的菌落挑取，在新的固體培 養(yǎng)基平皿畫線分離相應微生物。金花菌落指金花菌在10% PDA培養(yǎng)基平板上生長到一定時候形成的一個菌落集 合體，菌落是指聚集在一起的微生物團。茶汁的制備方法制按照Ig茯磚茶樣本比30mL蒸餾水的比例稱取20g茯磚茶，加 入600mL蒸餾水，100水浴2小時，待稍冷卻后用量筒定容至600mL即為制備好的茶汁。冠狀散囊菌的發(fā)酵液的制備接種實驗室已經分離純化的冠狀散囊菌于添加 10%茶汁的PDA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD值0. 6-0. 8，用0. 2 μ m過濾膜進行過濾滅菌， 即為制備好的冠狀散囊菌發(fā)酵液，OD值即吸光值。本發(fā)明能在短期4-5天內從成品茯磚茶中快速分離冠突散囊菌，而且基本無其他 雜菌生長，滿足從不同品牌茯磚茶中金花菌的分離需要，可操作性強，為金花菌的研究奠定 了基石出。


圖1為PDA培養(yǎng)基3天分離、純化成品湘益牌茯磚茶樣本中冠突散囊菌驗證結果 照片。圖2為改良PDA培養(yǎng)基3天分離、純化成品湘益牌茯磚茶樣本中冠突散囊菌驗證 結果察照片。
圖3為改良PDA培養(yǎng)基分離、純化成品湖南益陽茶廠茯磚茶樣本中冠突散囊菌的 驗證結果照片，圖中只顯示了濃度為10_4梯度照片。圖4為改良PDA培養(yǎng)基分離、純化成品湖南安化利源隆茶廠茯磚茶樣本中冠突散 囊菌的驗證結果照片，圖中只顯示了濃度為10_4梯度照片。圖5為改良PDA培養(yǎng)基分離、純化成品永泰福茶廠茯磚茶樣本中冠突散囊菌的驗 證結果照片，圖中只顯示了濃度為10_4梯度照片。圖6為改良PDA培養(yǎng)基分離、純化成品湖南安化華茗茶廠茯磚茶樣本中冠突散囊 菌的驗證結果照片，圖中只顯示了濃度為10_4梯度照片。圖7為改良PDA培養(yǎng)基分離、純化成品湖南久楊茶葉有限公司茯磚茶樣本中冠突 散囊菌的驗證結果照片，圖中只顯示了濃度為10_4梯度照片。圖8為改良PDA培養(yǎng)基分離、純化成品白沙溪茶葉有限公司茯磚茶樣本中冠突散 囊菌的驗證結果照片，圖中只顯示了濃度為10_4梯度照片。
具體實施例方式1、成品茯磚茶的處理用植物微型粉碎機將樣品粉碎，200目過篩、65°C干燥2小時后稱取Ig樣品，定容 10mL，配成濃度為川入川人川穴川入^^各川！^，取10-3、10_4、10-5三個梯度準備涂布改良 PDA平板。2、冠突散囊菌發(fā)酵液的制備用接種環(huán)挑取實驗室已經分離純化的冠突散囊菌接種于PDA液體培養(yǎng)基中，28°C 培養(yǎng)至OD值0. 6-0. 8，用0. 2 μ m過濾膜進行過濾滅菌，即為制備好的發(fā)酵液。3、冠突散囊菌快速分離培養(yǎng)基的制備冠突散囊菌快速分離培養(yǎng)基為改良PDA固體培養(yǎng)基，改良方法為按照常規(guī)方法配 制PDA固體培養(yǎng)基，滅菌結束后冷卻至50°C左右，按照培養(yǎng)基量和冠突散囊菌發(fā)酵液體積 比10 1添加制備好的發(fā)酵液，趁熱到平板。4、冠突散囊菌的培養(yǎng)、純化取10_3、10_4、10_5三個梯度各0. 5mL涂布改良PDA平板超凈臺上吹干，28 V培養(yǎng) 2-3天，挑取金黃色優(yōu)勢菌落，畫線接種至同樣的改良PDA平板上，同樣條件繼續(xù)培養(yǎng)直至純化。5、冠突散囊菌的保存用改良PDA斜面管保存于4°C冰箱中或用改良PDA液體培養(yǎng)基制成孢子懸液加 50%滅菌甘油于_70°C冰箱保存。實施例1 :PDA培養(yǎng)基與改良PDA培養(yǎng)基分離、純化成品湘益牌茯磚樣本中冠突散 囊菌的驗證將成品湘益牌茯磚樣本按照具體實施方式
1-4步實驗，結果證明能有效分離冠突 散囊菌。分離純化的金花菌落見附圖1和附圖2。實施例2 改良PDA培養(yǎng)基分離、純化成品湖南益陽茶廠、湖南安化利源隆茶廠、湖 南安化華茗茶廠、永泰福茶廠、湖南久楊茶葉有限公司、白沙溪茶葉有限公司生產的茯磚樣本中冠突散囊菌的驗證將湖南益陽茶廠、湖南安化利源隆茶廠、湖南安化華茗茶廠、永泰福茶廠、湖南久 楊茶葉有限公司、白沙溪茶葉有限公司生產的茯磚樣本按照具體實施方式
1-4步實驗，結 果證明能有效分離冠突散囊菌。分離純化的金花菌落見附圖2和附圖3、4、5、6、7、8。
權利要求
1.一種冠突散囊菌快速分離方法，其特征在于其具體步驟為1)成品茯磚茶的處理；2)冠突散囊菌發(fā)酵液的制備；3)冠突散囊菌快速分離培養(yǎng)基的制備；4)冠突散囊菌的培養(yǎng)、純化；5)冠突散囊菌的保存。
2.根據(jù)權利要求1所述的冠突散囊菌快速分離方法，其特征在于所述的成品茯磚茶 的處理是用植物微型粉碎機將樣品粉碎，200目過篩、65°C干燥2小時后稱取Ig樣品，定容 10mL，配成濃度為川入川人川穴川入^^各川！^，取10-3、10_4、10-5三個梯度準備涂布改良 PDA平板。
3.根據(jù)權利要求1所述的冠突散囊菌快速分離方法，其特征在于所述的冠突散囊菌 發(fā)酵液的制備方法為接種實驗室已經分離純化的冠突散囊菌于PDA液體培養(yǎng)基中二8°C 培養(yǎng)至OD值0. 6-0. 8，用0. 2 μ m過濾膜進行過濾滅菌，即為制備好的發(fā)酵液；
4.根據(jù)權利要求1所述的冠突散囊菌快速分離方法，其特征在于所述的冠突散囊菌 快速分離培養(yǎng)基的制備是為改良PDA固體培養(yǎng)基，改良方法為按照常規(guī)方法配制PDA固體 培養(yǎng)基，滅菌結束后冷卻至50°C左右，按照培養(yǎng)基量和冠突散囊菌發(fā)酵液體積比10 1添 加制備好的發(fā)酵液，趁熱到平板；
5.根據(jù)權利要求1所述的冠突散囊菌快速分離方法，其特征在于所述的冠突散囊菌 的培養(yǎng)、純化為取濃度10_3、10_4、10_5三個梯度各0. 5mL涂布于改良PDA平板超凈臺上吹 干，培養(yǎng)2-3天，挑取金黃色優(yōu)勢菌落，畫線接種至同樣的改良PDA平板上，同樣條件繼 續(xù)培養(yǎng)直至純化；結果判定當冠突散囊菌落呈現(xiàn)金黃色，菌落形態(tài)相同、大小一致，無其 它雜菌生長即表示冠突散囊菌已經純化分離。
6.根據(jù)權利要求1所述的冠突散囊菌快速分離方法，其特征在于所述的冠突散囊菌 的保存為用改良PDA斜面管保存于4°C冰箱中或用改良PDA液體培養(yǎng)基制成孢子懸液加 50%滅菌甘油于_70°C冰箱保存。
全文摘要
一種冠突散囊菌快速分離方法，其特征在于其具體步驟為1)成品茯磚茶的處理；2)冠突散囊菌發(fā)酵液的制備；3)冠突散囊菌快速分離培養(yǎng)基的制備；4)冠突散囊菌的培養(yǎng)、純化；5)冠突散囊菌的保存。本發(fā)明實現(xiàn)了在短期內從成品茯磚茶中快速分離冠突散囊菌即金花菌，而且無雜菌，滿足不同品牌茯磚茶中金花菌的分離需要，而且可操作性強。
文檔編號C12N1/14GK102120963SQ20101059820
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月21日 優(yōu)先權日2010年12月21日
發(fā)明者劉石泉, 趙運林 申請人:湖南城市學院