專利名稱：一種肽核酸探針、含有該肽核酸探針的組合物及其用途的制作方法
一種肽核酸探針、含有該肽核酸探針的組合物及其用途技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種肽核酸探針，具體地，涉及一種用于檢測分枝桿菌特別是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群的肽核酸探針。本發(fā)明還涉及含有該肽核酸探針的組合物、用于檢測分枝桿菌的檢測劑、用于檢測分枝桿菌的試劑盒、一種原位雜交方法、一種檢測分枝桿菌的方法、所述肽核酸探針在制備檢測分枝桿菌的試劑中的用途、以及所述肽核酸探針在制備檢測結(jié)核病的試劑中的用途。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是一種經(jīng)呼吸道傳播的慢性傳染病，主要由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群 (Mycobacterium tuberculosis Complex, MTC)引起，其中最主要的是結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)。
目前臨床上檢測結(jié)核分枝桿菌最常用的方法是涂片染色鏡檢法，包括抗酸 (Ziehl-Neelsen)染色法和熒光染色法。涂片染色鏡檢法優(yōu)點是簡單、快速、成本低，缺點是靈敏度低，例如當(dāng)樣本內(nèi)含菌量少時，往往容易得出假陰性結(jié)果。
由于涂片染色鏡檢法靈敏度低，所以涂片陰性的樣本還要繼續(xù)使用分離培養(yǎng)法 (羅氏培養(yǎng)法)進(jìn)行進(jìn)一步確定。分離培養(yǎng)法的結(jié)果相對可靠，特異性高，是目前結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但是由于結(jié)核分枝桿菌的生長速度緩慢，大約需要4到8周才能得出結(jié)果，不利于對患者作出快速診斷和及時治療。而如果使用結(jié)核菌快速培養(yǎng)儀，可以縮短一些培養(yǎng)時間，不過儀器價格昂貴，還需要專門進(jìn)口專利的培養(yǎng)基，費用較高。
此外，PCR方法也被引入結(jié)核分枝桿菌的檢測領(lǐng)域。這種方法可以在短時間內(nèi)使特定的核酸序列拷貝數(shù)幾何級數(shù)增加，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行探針雜交，提高了檢出的靈敏度和特異性。但是缺點是非常容易出現(xiàn)假陽性。并且由于樣本中有可能有如血色素等抑制劑的存在導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性的情況，所以限制了 PCR方法的臨床應(yīng)用。
肽核酸(ρ印tide nucleic acid,PNA)是一類具有類多肽骨架的DNA類似物，由聚 N-(2-氨基乙基)甘氨酸替代DNA分子中的磷酸戊糖骨架，四種堿基通過亞甲基羰基與骨架相連。由于肽核酸是一種不帶電荷的中性分子，它可以高度親和并序列特異地與DNA或RNA 結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合體，形成的雜交復(fù)合物具有相當(dāng)高的熱穩(wěn)定性以及獨特的耐離子強(qiáng)度變化的性質(zhì)，并且不易被核酸酶和蛋白酶所降解。
已經(jīng)有文獻(xiàn)報導(dǎo)了兩種檢測結(jié)核分枝桿菌的肽核酸探針(Stenderet al., Fluorescence In situ hybridization assay using peptidenucleic acid probes for differentiation between tuberculous andnontuberculous mycobacterium species in smears ofmycobacterium cultures. J Clin Microbiol.，1999，37 (9) :2760-2765 ； Lefmann et al. ， Evaluation of peptide nucleicacid-fluorescence in situ hybridization for identification ofclinically relevant mycobacteria in clinical specimens andtissue sections. J Clin Microbiol. 2006 ；44(10) :3760-3767.)，但是這兩種探針雜交后的信號偏弱。部分可能的原因是探針序列的特異性不是很好，以及未使用CN 102533955 AΗ,Ν
N、
X-Iinker結(jié)構(gòu)式如下連接器(linker)將熒光素基團(tuán)與PNA鏈間隔開，造成PNA鏈與靶序列結(jié)合時存在空間位阻效應(yīng)，影響雜交效率。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)過大量的實驗和創(chuàng)造性的勞動，出乎意料地發(fā)現(xiàn)了一種信號強(qiáng)度高并且特異性好的肽核酸探針，其可以有效、快速地檢測分枝桿菌特別是結(jié)核分枝桿菌以及結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群。由此提供了下述發(fā)明
本發(fā)明的一個方面涉及一種肽核酸探針，其堿基序列為SEQ IDNO :1或SEQ ID NO: 2中連續(xù)的10-20個堿基；具體地，為連續(xù)的13-18個堿基，更具體地，為連續(xù)的14-17個堿基，進(jìn)一步具體地，所述肽核酸探針的堿基序列如SEQ ID N0:3所示。
SEQ ID NO :1_3的堿基序列如下所示
5’-TGGCCTATCCTGGTGCCCTACGTACAGAACACCACCTTTCGCG-3’ (SEQ IDNO 1)；
5’-GCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCGTGGTCCTATCCGGT-3，(SEQ IDNO 2)；
5，-TCCTGGTGCCCTACG-3，(SEQ ID NO :3)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述肽核酸探針的堿基序列的5’端或3’端連接有一個或多個賴氨酸，具體地，為1個賴氨酸。所述賴氨酸可以通過連接器(linker)與肽核酸序列相連接，所述連接器可以是0-linker、E_linker、X-linker、或AEEEA-Iinker以及根據(jù)特殊用途(如提高或降低疏水性以及針對硫醇化PNA)而設(shè)計的linker。
O-Iinker結(jié)構(gòu)式如下
O
E-Iinker結(jié)構(gòu)式如下
O
權(quán)利要求
1.一種肽核酸探針，其帶有可檢測的標(biāo)記，其特征在于，所述肽核酸探針的堿基序列為 SEQ ID N0:1中或SEQ ID NO :2中連續(xù)的10-20個堿基；具體地，為連續(xù)的13-18個堿基，更具體地，為連續(xù)的14-17個堿基，進(jìn)一步具體地，所述肽核酸探針的堿基序列如SEQID NO 3 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽核酸探針，其堿基序列的5’端或3’端連接有一個或多個賴氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肽核酸探針，其中，所述賴氨酸通過連接器與肽核酸序列相連接，所述連接器選自0-1 inker、E_1 inker、X_1 inker、以及AEEEA-1 inker ；所述可檢測的標(biāo)記為熒光標(biāo)記。
4.一種組合物，其含有權(quán)利要求1至3中任一項所述的肽核酸探針。
5.一種分枝桿菌檢測劑，其含有權(quán)利要求1至3中任一項所述的肽核酸探針。
6.一種用于分枝桿菌檢測的試劑盒，其含有權(quán)利要求1至3中任一項所述的肽核酸探針。
7.—種檢測分枝桿菌的方法，包括使用權(quán)利要求1至3中任一項所述的肽核酸探針的步驟。
8.—種原位雜交方法，包括使用權(quán)利要求1至3中任一項所述的肽核酸探針的步驟。
9.權(quán)利要求1至3中任一項所述的肽核酸探針在制備檢測分枝桿菌的試劑中的用途。
10.權(quán)利要求1至3中任一項所述的肽核酸探針在制備檢測結(jié)核病的試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種肽核酸探針、含有該肽核酸探針的組合物及其用途。具體而言，所述肽核酸探針帶有可檢測的標(biāo)記，并且所述肽核酸探針的堿基序列為SEQ ID NO1中或SEQ ID NO2中連續(xù)的10-20個堿基。本發(fā)明還涉及含有該肽核酸探針的組合物、用于檢測分枝桿菌的檢測劑、用于檢測分枝桿菌的試劑盒、一種原位雜交方法、一種檢測分枝桿菌的方法、所述肽核酸探針在制備檢測分枝桿菌的試劑中的用途、以及所述肽核酸探針在制備檢測結(jié)核病的試劑中的用途。本發(fā)明的肽核酸探針信號強(qiáng)度高，并且特異性高，可以有效、快速地檢測分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群。
文檔編號C12Q1/68GK102533955SQ201010598260
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者呂瑛, 吳曉東, 胡軍, 陳忠 申請人:北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司