專利名稱：用于檢測(cè)股骨頭壞死易感性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測(cè)用的試劑盒，尤其是一種檢測(cè)股骨頭壞死易感 性的試劑盒，通過(guò)檢測(cè)VEGF、FV、MTHFR、APOAU APOB和PONl基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn) (SNP)，來(lái)預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)股骨頭壞死的易感性。
背景技術(shù)：
股骨頭壞死因其主要病理系股骨頭血運(yùn)受阻，遭受破壞而引起的頭部骨質(zhì)缺血， 故多稱為股骨頭缺血性壞死或股骨頭無(wú)菌性壞死。由于股骨頭壞死有一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò) 程，如早期不能得到及時(shí)有效的治療，就會(huì)使股骨頭塌陷，關(guān)節(jié)間隙變窄，最后導(dǎo)致骨關(guān)節(jié) 炎，使病人髖關(guān)節(jié)功能障礙而致殘致癱。病人在遭受生理病痛的同時(shí)，還要遭受心理創(chuàng)傷的 煎熬，也給家庭、單位和社會(huì)增添了沉重的負(fù)擔(dān)。股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head ANFH)是骨科常 見病，多發(fā)病，早期診斷困難，治療效果欠佳，最終仍需人工關(guān)節(jié)置換術(shù)，給患者和社會(huì)帶來(lái) 巨大損失。其發(fā)病機(jī)理尚不十分清楚，但其共同特征都是血液循環(huán)障礙導(dǎo)致股骨頭缺血壞 死。由于機(jī)體對(duì)壞死區(qū)具有自然的修復(fù)能力，當(dāng)新生骨細(xì)胞隨新生血管向壞死區(qū)生長(zhǎng)并形 成新骨的同時(shí)，壞死骨小梁將被逐步吸收。在此過(guò)程中骨的力學(xué)性能明顯減弱，正常負(fù)重即 可致股骨頭塌陷變形及髖關(guān)節(jié)退行性關(guān)節(jié)炎，同時(shí)出現(xiàn)以疼痛和活動(dòng)障礙為主的臨床癥狀 群。早期的診斷和治療是治療ΑΝ 的關(guān)鍵。隨著ΑΝ 的基因多態(tài)性的深入研究，越來(lái)越 多的和ANFH相關(guān)的基因見諸報(bào)道。證實(shí)了多種基因在ANFH的發(fā)生發(fā)展中的作用，為ANFH 的早期診斷和治療提供了理論依據(jù)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)基因位于 6 號(hào) 染色體pl2區(qū)，其-634上C/G多態(tài)性會(huì)影響基因的表達(dá)，其產(chǎn)物血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子能特異 性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂，促進(jìn)血管的生長(zhǎng)和側(cè)支循環(huán)建立的作用，也能 促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌胰島素樣生長(zhǎng)因子等生長(zhǎng)因子，促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)，其多態(tài)性會(huì)影 響VEGF基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致ANFH的發(fā)生。亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR gene)位于1ρ36. 13，由11個(gè)外顯子組成，編 碼656個(gè)氨基酸，翻譯成能夠催化N5，WO-亞甲基四氫葉酸還原成N5-亞甲基四氫葉酸的 蛋白質(zhì)，后者為Hcy的再甲基化提供甲基供體，使其生成蛋氨酸。MTHFR基因677位存在 C —T突變。該突變會(huì)導(dǎo)致其編碼的丙氨酸(GCU)被纈氨酸(GUU)所取代，從而影響MTHFR 的活性，使血漿中HCY水平升高。是同型半胱氨酸，高同型半胱氨酸血癥是血栓形成的獨(dú)立 危險(xiǎn)因素。凝血因子5 (coagulation factor V，F(xiàn)V)基因位于 lq23，編碼 Glueek 因子 V 蛋白， 在凝血過(guò)程中位于內(nèi)外源性凝血途徑的交匯點(diǎn)，加速和促進(jìn)凝血酶原的激活和凝血酶的生 成。因子V在rs6025發(fā)生基因突變后稱V Leiden因子。V Leiden因子是靜脈血栓形成的 常見的危險(xiǎn)因素?；蛲蛔儗?dǎo)致深靜脈血栓形成，血液高凝狀態(tài)，從而導(dǎo)致股骨頭小血管的 血栓形成。
脂類代謝紊亂是導(dǎo)致股骨頭壞死的重要機(jī)理，長(zhǎng)期大劑量使用糖皮質(zhì)激素引起體 內(nèi)高脂血癥，脂肪分解，血中游離脂肪酸增多，從而使血管內(nèi)皮損傷，膠原暴露，激活內(nèi)源性 凝血途徑，使纖維蛋白血小板血栓形成。對(duì)氧磷酶(pamoxonase，PON)又稱芳香基二烷基磷酸酯酶，人類血清中的PONl與 HDL緊密結(jié)合，形成一個(gè)八聚合體的結(jié)構(gòu)，是ApoA — 1的重要組成部分。PON基因位于染色 體7q21. 3 一 q22. 1，含有9個(gè)外顯子及8個(gè)內(nèi)含子，PON基因家族至少有三個(gè)成員，分別為 PONUP0N2和P0N3。PONl基因產(chǎn)物是循環(huán)中HDL的組成部分，并且HDL的抗氧化的活性大 部分取決于P0N1。PONl的192Glu/Arg的改變，影響了對(duì)氧磷酶酶的活性。載脂蛋白Afepolipoprotein Α,Αρο Α)位于人類11號(hào)染色體長(zhǎng)臂上約15kb的基 因片段內(nèi)，與Apo C3、Apo A4基因呈簇狀排列。Apo Al基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游_75bp處有G/ A多態(tài)性位點(diǎn)(rs670)，Apo Al基因結(jié)構(gòu)的改變影響著Apo Al的分子結(jié)構(gòu)、生成和向血液 中釋放的速率，進(jìn)而影響血中Apo Al與HDL的水平。載脂蛋白Bfepolipoprotein B,Apo B)基因位于第2號(hào)染色體短臂Op23)末端， 全長(zhǎng)43吐，由四個(gè)外顯子和觀個(gè)內(nèi)含子組成。最大的外顯子是沈號(hào)外顯子。位于第沈 號(hào)外顯子的C7673T多態(tài)(rs69;3)靠近LDL受體結(jié)合區(qū)域，被認(rèn)為與動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、 心肌梗死及股骨頭壞死密切相關(guān)?，F(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)股骨頭壞死易感人群，采用雜交芯片法或玻璃板芯片法，以及利用 taqman探針，該方法準(zhǔn)確率低、假陰性和假陽(yáng)性率較高，且不能批量檢測(cè)；另一種直接測(cè)序 法，雖準(zhǔn)確率高，但其成本高、同樣不能實(shí)現(xiàn)批量檢測(cè)，因此現(xiàn)有方法均無(wú)法滿足大規(guī)?；?因篩選的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，通過(guò)檢測(cè)一組與股骨頭壞死易感性的試劑盒，利 用特異性引物和探針，通過(guò)單核苷酸延伸技術(shù)結(jié)合微陣列芯片技術(shù)，綜合檢測(cè)和分析受檢 人群是否攜帶“股骨頭壞死易感基因”，將股骨頭壞死易感人群從人群中篩選出來(lái)，改變不 良的生活習(xí)慣，達(dá)到預(yù)防的目的。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種用于檢測(cè)股骨頭壞死易 感的檢測(cè)試劑盒，它檢測(cè)與股骨頭壞死關(guān)系密切的六個(gè)基因的組合血管內(nèi)皮因子類的 VEGF基因，凝血因子類的FV基因和MTHFR基因，脂類代謝基因的PONl基因、AP0A1基因和 APOB基因。包括下述SNP位點(diǎn)VEGF基因的rs2010963位點(diǎn)、FV基因的rs6025位點(diǎn)、MTHFR 基因的rsl801133位點(diǎn)、AP0A1基因的rs670位點(diǎn)、APOB基因的rs693位點(diǎn)和PCMl基因的 rs662位點(diǎn)。所述的用于檢測(cè)股骨頭壞死易感的基因組合，用于針對(duì)所述位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性的引 物對(duì)和探針。所述的用于檢測(cè)股骨頭壞死易感的基因組合設(shè)計(jì)的特異性引物，所述的特異性引 物對(duì)的序列如下，用于進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，能同時(shí)擴(kuò)增出上述6個(gè)位點(diǎn)的基因片段針對(duì)rs2010963 位點(diǎn)GGTAGCAAGAGCTCCAGAGAG(SEQ ID NO 1)
AAGCAGGTCACTCACTTTGC(SEQ ID NO 2)針對(duì)rs6025 位點(diǎn)TAGCCAGGAGACCTAACATGTTC(SEQ ID NO 3)GAGAGACATCGCCTCTGGG(SEQ ID NO 4)針對(duì)rsl801133 位點(diǎn)CACAAAGCGGAAGAATGTGTC(SEQ ID NO 5)GTCATCCCTATTGGCAGGTTAC(SEQ ID NO 6)針對(duì)rs670位點(diǎn)AGCTCTTGCAGGGCCTATT(SEQ ID NO 7)CCACATTGCCAGGACCAGT(SEQ ID NO 8)針對(duì)rs693位點(diǎn)AAACCTGGCCTACCAGAGAC(SEQ ID NO 9)TTGGTTACAGGAGGCTTTAAGT(SEQ ID NO 10)針對(duì)rs662位點(diǎn)CAAATCCTTCTGCCACCACT(SEQ ID NO: 11)CTGTGGGACCTGAGCACTTT(SEQ ID NO :12)所述的用于檢測(cè)白血病易感的基因組合設(shè)計(jì)的特異性探針，其特征在于，所述的 特異性探針序列如下，能同時(shí)對(duì)6個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分型針對(duì)rs2010963 位點(diǎn)ACGCACGTCCACGGTGATTTCGCGCGGGCGTGCGAGCAGCGAAAG(SEQ ID NO :13)針對(duì)rs6025 位點(diǎn)GGATGGCGTTCCGTCCTATTTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGC(SEQ ID NO :14)針對(duì)rsl801133 位點(diǎn)CGTGCCGCTCGTGATAGAATGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG(SEQ ID NO :15)針對(duì)rs670位點(diǎn)AGCGATCTGCGAGACCGTATAGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCC(SEQ ID NO :16)針對(duì)rs693位點(diǎn)GCGGTAGGTTCCCGACATATACATGAAGGCCAAATTCCGAGAGAC(SEQ ID NO :17)針對(duì)rs662位點(diǎn)GGCTATGATTCGCAATGCTTCACTATTTTCTTGACCCCTACTTAC(SEQ ID NO :18)所述的引物或探針，用于通過(guò)單核苷酸延伸技術(shù)結(jié)合微陣列芯片技術(shù)特異性檢出 白血病易感基因。本試劑盒的組分和含量包括250ul 10XPCR 反應(yīng)緩沖液，20ul IOmM dNTP 混合液，450ul 25mM MgCl2 溶液，45ul (5U/ul) Taq DNA 聚合酶，50ul特異性引物(12條)混合液(IOuM each)，15ul特異性延伸探針(6條)混合液(IOuM)，
90ul ExoI(10U/ul),450ul SAP(lU/ul),140ul 10XSAP 反應(yīng)緩沖液，1700ul Extension Dilution Buffer,90ul IOXExtension Mix,IOul DNA polymerase,3500ul Hybridization Solution,200ul Hybridization Additive,2500ul 20XWash Buffer 1，800ul 64XWash Buffer 2，一個(gè)384孔12重微陣列芯片去離子水20ml，本試劑盒供380人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒保存溫度為-20°C。本發(fā)明的有益效果是(1)分型結(jié)果準(zhǔn)確性高達(dá)99%以上，重復(fù)性好，沒有假陽(yáng)性 影響；( 同時(shí)檢測(cè)多個(gè)SNP位點(diǎn)，檢測(cè)成本低；C3)通量高，可一次對(duì)384個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)； (4)操作簡(jiǎn)便；( 靈敏度高，每次檢測(cè)的DNA用量?jī)H2ng。本發(fā)明通過(guò)單核苷酸延伸技術(shù) 結(jié)合微陣列芯片技術(shù)，利用特異性引物和探針對(duì)單核苷酸多態(tài)性(SNP)的基因分型準(zhǔn)確率 超過(guò)99%。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件 的實(shí)驗(yàn)放大，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。IDNA 的提取取受檢者外周靜脈血，加入同等體積的細(xì)胞裂解液，裂解兩次，充分裂解白細(xì)胞， 離心棄上清后加入蛋白酶K緩沖液和蛋白酶K(50ug/ml)，65°C孵育10分鐘，異丙醇沉淀、 75 %乙醇洗滌兩次，晾干后溶于適量TB溶液中。2PCR 擴(kuò)增取受檢者的基因組DNA提取液加入96孔板中，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積5ul，其中 10M mol/L dNTPs 0. 0375ul, 10XPCR BufferO. 5ul, 25mmol/L MgCl2 lul，模板 DNA 30ng，6 重引物混合液 lOuM/L eachO. 025ul, Amplitaq Gold(5U/ul)0. lul，補(bǔ)足水到 5ul。置于 PCR 儀上反應(yīng)預(yù)變性 94°C Imin ；94°C 30sec, 55°C 30sec,72°C lmin，40 個(gè)循環(huán)；Hold 4°C。擴(kuò)增引物混合液包括下列引物
IFGGTAGCAAGAGCTCCAGAGAG(SEQ ID NO 1)
IRAAGCAGGTCACTCACTTTGC(SEQ ID NO 2)
2FTAGCCAGGAGACCTAACATGTTC(SEQ ID NO 3)
2RGAGAGACATCGCCTCTGGG(SEQ ID NO 4)
3FCACAAAGCGGAAGAATGTGTC(SEQ ID NO 5)
3RGTCATCCCTATTGGCAGGTTAC(SEQ ID NO 6)
6
4F AGCTCTTGCAGGGCCTATT(SEQ ID NO 7)4R CCACATTGCCAGGACCAGT(SEQ ID NO 8)5F AAACCTGGCCTACCAGAGAC(SEQ ID NO 9)5R TTGGTTACAGGAGGCTTTAAGT(SEQIDN0:10)6F CAAATCCTTCTGCCACCACT (SEQ ID N0:11)6R CTGTGGGACCTGAGCACTTT(SEQ ID NO 12)3 純化在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入 0. 2ul ExoI, Iul SAP，0. 3ul 10 X SAP 反應(yīng)緩沖液禾口 1. 5ul 去離子水。將96孔板放入PCR儀中進(jìn)行純化，純化程序37°C 30min,96°C 10min,Hold 4°C。4引物延伸反應(yīng)純化后的PCR產(chǎn)物中加入延伸反應(yīng)混合物extension Dilution Buffer3. 76ul, 延伸探針混合液(1010uM/L each) 0. 03ul, 20 X Extension Mix 0. 2ul，DNA 聚合酶 0. 02ul， 去離子水;3ul。將裝有延伸反應(yīng)混合物的96孔板再次放入PCR儀中進(jìn)行延伸反應(yīng)，反應(yīng)程 序=Hold 96°C 3min ；94°C 20sec，40°C llsec，46 個(gè)循環(huán)；Hold 4°C。延伸探針混合液包含下列探針I(yè)PACGCACGTCCACGGTGATTTCGCGCGGGCGTGCGAGCAGCGAAAG(SEQIDNO13)
2PGGATGGCGTTCCGTCCTATTTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGC(SEQIDNO14)
3PCGTGCCGCTCGTGATAGAATGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG(SEQIDNO15)
4PAGCGATCTGCGAGACCGTATAGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCC(SEQIDNO16)
5PGCGGTAGGTTCCCGACATATACATGAAGGCCAAATTCCGAGAGAC(SEQIDNO17)
6PGGCTATGATTCGCAATGCTTCACTATTTTCTTGACCCCTACTTAC(SEQIDNO18)以上延伸探針5’端具有與微陣列芯片地址引物對(duì)應(yīng)的地址序列。5延伸反應(yīng)結(jié)束后，加入雜交液可與微陣列芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)。孵育溫度42 °C，孵育時(shí)間2小時(shí)。6激光掃描檢測(cè)熒光信號(hào)本發(fā)明將上述6個(gè)與股骨頭壞死易感、發(fā)生密切相關(guān)的基因進(jìn)行組合，通過(guò)大量 的篩選數(shù)據(jù)表明所述6個(gè)基因VEGF基因、FV基因，MTHFR基因、PONl基因、AP0A1基因、 APOB基因，如6個(gè)基因都有位點(diǎn)發(fā)生突變，則患股骨頭壞死的概率最高；4或5個(gè)基因發(fā)生 突變次之；沒有發(fā)生突變患股骨頭壞死的概率最小。本發(fā)明采用單核苷酸延伸技術(shù)和微陣列芯片技術(shù)相結(jié)合的方法，針對(duì)上述6個(gè)位 點(diǎn)，設(shè)計(jì)一套多重PCR引物，在一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增攜帶SNP位點(diǎn)的6個(gè)基因片段，根 據(jù)SNP位點(diǎn)上游5’端23-2^p的序列設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，此探針與序列雜交后3’末端位 于snp5’端上游Ibp處。檢測(cè)時(shí)聚合酶根據(jù)SNP攜帶的堿基在探針末端結(jié)合上一個(gè)攜帶熒 光的ddNTP，根據(jù)結(jié)合的ddNTP不同，其所攜帶的熒光顏色也不相同，在探針的5’端根據(jù)與 微陣列芯片結(jié)合位置的不同設(shè)計(jì)有不同的20bp的Tag地址序列，與微陣列芯片上對(duì)應(yīng)的序 列互補(bǔ)，延伸后的探針與微陣列芯片上對(duì)應(yīng)區(qū)域上的序列雜交，不同的探針結(jié)合在芯片的 不同區(qū)域，通過(guò)檢測(cè)對(duì)應(yīng)位置的熒光，達(dá)到同時(shí)進(jìn)行多個(gè)SNP分型的目的。疾病的發(fā)生是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，受到多個(gè)蛋白和基因的共同影響，其中任何 一個(gè)酶的改變都會(huì)影響疾病的易感性。傳統(tǒng)的基因檢測(cè)疾病的方法受到方法的限制，往往只能對(duì)一到兩個(gè)基因的多態(tài)性進(jìn)行分析，只能覆蓋一部份患病風(fēng)險(xiǎn)人群，對(duì)于由于其他基 因上的多態(tài)性造成的疾病患病風(fēng)險(xiǎn)不能及時(shí)的預(yù)警，檢測(cè)的準(zhǔn)確性因此會(huì)大幅降低，受檢 者不能全面的了解自身疾病的易感情況。本發(fā)明針對(duì)一種疾病不同的患病途徑檢測(cè)多個(gè)相關(guān)的基因和其多態(tài)性位點(diǎn)，能更 準(zhǔn)確更全面的檢測(cè)受檢者不同患病途徑的患病風(fēng)險(xiǎn)，能給受檢者提出具有針對(duì)性和有效地 健康建議，及時(shí)有效的避免其疾病的發(fā)生。由于本發(fā)明使用的檢測(cè)方法可以高通量，自動(dòng)化的檢測(cè)SNP，大幅降低了檢測(cè)成 本，可以對(duì)不同患病途徑的多個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，本發(fā)明針對(duì)股骨頭壞死不同的患病途 徑的關(guān)鍵酶基因?qū)ふ姨暨x了 6個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，能更準(zhǔn)確更全面的檢測(cè)受檢者不同患病途徑 的患病風(fēng)險(xiǎn)，能夠給受檢者提出具有針對(duì)性的健康建議，及時(shí)有效的避免其疾病的發(fā)生。本 發(fā)明通過(guò)單核苷酸延伸技術(shù)結(jié)合微陣列芯片技術(shù)，利用特異性引物和探針對(duì)單核苷酸多態(tài) 性(SNP)的基因分型準(zhǔn)確率超過(guò)99%，同時(shí)檢測(cè)上述6個(gè)基因?qū)z測(cè)、比較個(gè)體的股骨頭壞 死易感性具有重要意義。綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可 以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā) 明的范圍之內(nèi)。
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權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)股骨頭壞死易感性的試劑盒，其特征在于，包括同時(shí)檢測(cè)VEGF基因 的rs2010963位點(diǎn)、FV基因的rs6025位點(diǎn)、MTHFR基因的rs 1801133位點(diǎn)、APOAl基因的 rs670位點(diǎn)、APOB基因的rs693位點(diǎn)和PONl基因的rs662位點(diǎn)的特異性引物及對(duì)應(yīng)的延 伸探針，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，10XPCR反應(yīng)緩沖液，ExoI，SAP, 10XSAP反應(yīng)緩 沖液，Extension Dilution Buffer, IOXExtension Mix, DNA polymerase, Hybridization Solution, Hybridization Additive, 20 Xffash Buffer 1,64X Wash Buffer2，去離子水，微 陣列芯片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)股骨頭壞死易感性的試劑盒，其特征在于所述的 特異性引物對(duì)是針對(duì)VEGF基因的rs2010963位點(diǎn)、FV基因的rs6025位點(diǎn)、MTHFR基因的 rsl801133位點(diǎn)、AP0A1基因的rs670位點(diǎn)、APOB基因的rs693位點(diǎn)和PONl基因的rs662 位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增出包括上述SNP位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)股骨頭壞死易感性的試劑盒，其特征在于所述的 特異性延伸探針是針對(duì)VEGF基因的rs2010963位點(diǎn)、FV基因的rs6025位點(diǎn)、MTHFR基因的 rsl801133位點(diǎn)、AP0A1基因的rs670位點(diǎn)、APOB基因的rs693位點(diǎn)和PONl基因的rs662 位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過(guò)單核苷酸延伸和微陣列技術(shù)檢測(cè)出這六個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)股骨頭壞死易感性的試劑盒，其特征在意所含的 特異性引物對(duì)選自具有SEQ ID NO :1，2所示核苷酸序列的引物對(duì)、具有SEQ ID N0:3，4所 示核苷酸序列的引物對(duì)、具有SEQ ID NO :5，6所示核苷酸序列的引物對(duì)、具有SEQ ID NO :7， 8所示核苷酸序列的引物對(duì)、具有SEQ ID NO :9，10所示核苷酸序列的引物對(duì)以及具有SEQ ID NO :11，12所示核苷酸序列的引物對(duì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)股骨頭壞死易感性的試劑盒，其特征在于所含的 特異性延伸探針選自具有SEQ ID N0:13、14、15、16、17和18所示核苷酸序列的延伸探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)股骨頭壞死易感性的試劑盒，其特征在于試劑 盒的組分和含量包含250ul 10XPCR反應(yīng)緩沖液，20ul IOmM dNTP混合液，450ul 25mM MgCl2溶液，45ul 5U/ul Taq DNA聚合酶，50ul每條IOuM的12條特異性引物混合液， 15ul 每條 IOuM 的 6 條特異性延伸探針混合液，90ull0U/ul Exol，450ul lU/ul SAP, 140ul 10XSAP 反應(yīng)緩沖液，1700ulExtension Dilution Buffer,90ul IOXExtension Mix, IOul DNApolymerase,3500ul Hybridization Solution,200ul Hybridization Additive, 2500ul 20XWash Buffer l,800ul 64XWash Buffer 2，去離子水20ml，一個(gè)供 380人份檢 測(cè)應(yīng)用的384孔12重微陣列芯片，試劑盒保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測(cè)股骨頭壞死易感性的試劑盒，它檢測(cè)與股骨頭壞死關(guān)系密切的六個(gè)基因的組合血管內(nèi)皮因子類的VEGF基因，凝血因子類的FV基因和MTHFR基因，脂類代謝基因的PON1基因、APOA1基因和APOB基因。利用本試劑盒，通過(guò)檢測(cè)一組與股骨頭壞死易感性相關(guān)的基因及位點(diǎn)，利用特異性引物和探針，通過(guò)單核苷酸延伸技術(shù)結(jié)合微陣列芯片技術(shù)，可清晰的判斷受檢人群是否攜帶“股骨頭壞死易感基因”，將股骨頭壞死易感人群從人群中篩選出來(lái)，改變不良的生活習(xí)慣，達(dá)到預(yù)防的目的。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102108413SQ201010599558
公開日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月22日
發(fā)明者劉志霈, 劉蓉華, 周毓玲, 李楠, 杜宏偉, 靳霞, 韓俊領(lǐng) 申請(qǐng)人:協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司, 天津?yàn)I海協(xié)和基因科技有限公司