專利名稱：一種來自極端嗜堿菌的β-葡萄糖苷酶基因及其合成、表達和純化的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種來自極端嗜堿菌的β-葡萄糖苷酶基因及其合成、表達和純化， 具體涉及一種來自極端嗜堿菌Bacillus halodurans C-125的β-葡萄糖苷酶基因及其合成、表達和純化。
背景技術：
β -葡萄糖苷酶(EC3. 2. 1. 21)是一種能夠水解碳水化合物之間糖苷鍵的水解酶 (J Struct Biol 129 :69-79) 0酶學分類系統(tǒng)根據(jù)其氨基酸序列將β _葡萄糖苷酶分為兩類糖苷水解酶家族I(GHFl)和糖苷水解酶家族3(GHF!3)。β -葡萄糖苷酶的應用范圍很廣，我們研究它的應用主要集中在它降解纖維素，木聚糖(Appl Environ Microbiol 68: 1485-1490)以及植物產(chǎn)生的各種化合物(Mol Plant Microbe Interact 13:1041-1052) 的功能。除此之外，還有它參與植物與病原菌之間的相互作用和其生物應用。眾所周知， β-葡萄糖苷酶給工業(yè)生產(chǎn)方面帶來了巨大的貢獻。大量的β-葡萄糖苷酶的基因從動物 (Enz Microbial Technol43 :35-42)、植物(Bioresou Technol 99 :6081-6087)和微生物 (J Microbiol 47 =542-548)中分離出來，進行了系統(tǒng)的研究。最近，來自于極端微生物體內(nèi)的β -葡萄糖苷酶成為研究的熱點，主要是因為這些酶可能具有潛在的特殊生物功能。在NCBI數(shù)據(jù)庫中，收集了很多微生物的全基因組信息，其中編碼蛋白的序列都被注釋了。但是大部分的蛋白的生化功能和生理功能都是未知的。因此研究注釋蛋白的功能可以完善這些酶學，并運用到工業(yè)應用中去。極端嗜堿菌Bacillus halodurans C-125是1977年首次被日本科學家分離出來的，并在2000年完成了基因組的測序(Nucleic Acids Res 28 :4317-4331) 在過去的二十多年里，很多來自該堿性微生物中酶被分離出來并商業(yè)化了，其中含有半乳糖苷酶 (Agri and Bio Chem 43 :85-88)，木聚糖酶(J Bacteriol 161 :784-785)，木糖酶(Appl Microbiol Biotechnol73 :582-590)和乙酰酯酶(J Bacteriol 190 :1375-1382)等。然而來自該菌的β -葡萄糖苷酶還從未研究過，也未見對該酶生理生化研究的報告。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題之一，在于提供一種來自極端嗜堿菌的葡萄糖苷酶基因，所述的極端嗜堿菌為Bacillus halodurans C-125。本發(fā)明所要解決的技術問題之二，在于提供一種所述β -葡萄糖苷酶基因的化學合成方法。本發(fā)明所要解決的技術問題之三，在于提供一種所述β -葡萄糖苷酶基因在原核生物中的表達及其應用。本發(fā)明的技術方案是通過以下方式來實現(xiàn)的。本發(fā)明所述的β-葡萄糖苷酶基因，來自于極端嗜堿菌Bacillus haloduransC-125，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。所述的β-葡萄糖苷酶基因是通過化學合成方法制備而成的。該方法采用大量重疊的引物通過兩步PCR進行全基因的合成(PTDS) (Nucleic Acids Research, 2004, 32 e98)。即首先通過重疊延伸獲得合成基因的片段，再通過最外側的引物將全長的基因擴增得到目的基因。該方法一個明顯的優(yōu)勢就是不需要對引物進行磷酸化處理。而且通過高通量的DNA合成儀器，可以較為便利地獲得大量的引物。所述的β-葡萄糖苷酶基因的合成方法，包括以下步驟1、引物設計設計長度大概為60mer左右的覆蓋整個β-葡萄糖苷酶基因的寡核苷酸的引物序列34個，且每相鄰的兩個寡核苷酸引物序列有20個堿基的重復。利用PCR進行β-葡萄糖苷酶擴增，在100 μ 1反應體系中，Ρ2-Ρ33共32個引物的添加量為2ng，外側引物Pl和P34添加量為30ng，擴增條件為:94°C預熱Imin ；94°C,30s, 50°C，30s，72°C，10min，使用的 Taq DNA 聚合酶為 KOD FX taq 酶(Toyobo 公司，日本)，共 25個循環(huán)。PCR結束后，1 %瓊脂糖膠回收片段，取10 μ 1直接與Τ/Α克隆載體相連(大連寶生物公司)。4°C連接過夜，高效轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)中。獲得長度為1374bp的SEQ ID No 1 序列的陽性克隆，即為本發(fā)明的葡萄糖苷酶基因。將上述SEQ ID No 1序列直接與原核表達載體ρΥΜ4087相連，4°C連接2小時。然后將該載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOPlO (Invitrogen)。將菌液涂布于含有50 μ g/mL氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基(15g/L瓊脂，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH7. 5)培養(yǎng)后獲得淡藍色菌落。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明通過克隆，高效合成出葡萄糖苷酶，它是一類應用非常廣的生物用酶。 通過對該基因的原核表達和純化，可以應用于β-葡萄糖苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)中。


圖1為本發(fā)明的葡萄糖苷酶基因的化學合成策略圖。圖2為以ρΥΜ4087質(zhì)粒構建DNA表達單元示意圖。圖3為酶的最適溫度及溫度的穩(wěn)定性，其中A為最適溫度，B為溫度的穩(wěn)定性。圖4為酶的最適ρΗ及ρΗ的穩(wěn)定性。圖5為金屬離子對酶活的影響。圖6為葡萄糖、木糖、蔗糖和半乳糖對酶活的影響。
具體實施例方式以下結合附圖詳細描述本發(fā)明的技術方案。實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍中。本發(fā)明所用的試劑若未經(jīng)說明，均購自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司。
本發(fā)明涉及分子生物學實驗，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書(J.薩姆布魯克、E. F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科學出版社。)實施例1 β -葡萄糖苷酶基因的化學合成參看圖1，以基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)來克隆合成本發(fā)明的葡萄糖苷酶基因。設計的引物分別如下Pl :Tm = 54,60merGGA, TCC, ATG, TCT, ATC, ATT, CAG, TTT, CCA, AAG, GAG, ATG, AAG, TGG, GGT, GTT, GCT，ACT, GCT，TCTP2 :Tm = 54,60merCAC，CTC，TAC，CAC，CAG，CAT, TGA，TAG, CAC，CTT，CGA，TCT，GGT，AAG，AAG，CAG， TAG, CAA，CAC，CCCP3 :Tm = 54,60merCAA，TGC，TGG，TGG，TAG, AGG，TGC，TTC，CAT, CTG，GGA，TGT，CTT，TGC，CAA，GAC， TCC，AGG，TAA，GGTP4 :Tm = 54,60merATA，GGA，GTC，ACA，GGC，AAC，ATC，ACC，ATT，GTC，ACC，GTT，CTT，GAC，CTT，ACC， TGG，AGT，CTT，GGCP5 :Tm = 54,60merATG，TTG，CCT，GTG，ACT, CCT，ATC，ACA，GAT，ACG，AAG，AAG，ACA，TTG，AGA，TCA， TGA，AGG，ATC，TTGP6 :Tm = 54,60merATT, CTT, GGC, CAA, GCA, ACA, GAG, AAT, CTG, TAC, ATG, TCA, ACA, CCA, AGA, TCC, TTC，ATG，ATC，TCAP7 :Tm = 54,60merTCT，GTT，GCT，TGG，CCA，AGA，ATC，TTT，CCA，AAC，GGT，ACT, GGT，GAA，GTC，TCC， AGA，GAA，GGT，CTTP8 :Tm = 54,60merCAT, TCT，CGG，TGA，GTC，TGT，CAA，CGA，GTC，TGT，GAT，AGT，AAT，CAA，GAC，CTT， CTC，TGG，AGA，CTTP9 :Tm = 54,60merTGA，CAG，ACT, CAC，CGA，GAA，TGG，TAT，TCA，ACC，AAT，GTG，TAC，TCT，CTA，CCA， TTG，GGA，TCT，GCCPlO :Tm = 54,60merGTC，TCT，GTT，GTC，CCA，ACC，ACC，TTT，CTC，TTG，CAG，AGC，TTG，TGG，CAG，ATC， CCA，ATG，GTA，GAGPll :Tm = 54,60merGTG, GTT, GGG, ACA, ACA, GAG, ACA, CCA, TCG, ATG, CCT, TTG, TCA, GAT, ACG, CTG, AAG，TCA，TGT，TCAP12 :Tm = 54,60mer
TTG，AAG，GTG，ATC，CAG，TGG，TTG，ATC，TTG，TCA，CCA，AAC，TCC，TTG，AAC，ATG， ACT, TCA，GCG，TATP13 :Tm = 54,60merAAC，CAC，TGG，ATC，ACC，TTC，AAC，GAA，CTG，TGG，TGT，GTT，TCC，TTC，CTC，TCC， AAC，TAC，ATT，GGTP14 :Tm = 54,60merTGG，TAG, CAA，GCT，GGA，GAT，CGG，TAT，TGC，CTG，GAG，CAT, GGA，CAC，CAA，TGT， AGT，TGG，AGA，GGAP15 :Tm = 54,60merCGA，TCT，CCA，GCT，TGC，TAC，CAA，CGT，TGC，TCA，CCA，TCT，TCT，TGT，TGC，TCA， TGG, TAA, GGC, TGTP16 :Tm = 54,60merACC，AAT，CTG，ACC，ATC，AAG，ACC，CAT, CTT，TCT，GTA，GGA，CTG，AAC，AGC，CTT， ACC，ATG，AGC，AACP17 :Tm = 54,60merGTC，TTG，ATG，GTC，AGA，TTG，GTT，ATG，CTC，CTA，ACG，TCG，AGT，GGA，ACG，AAC， CAT, TCT，CCA，ATCP18 :Tm = 54,60merCAG，CCA，TTG，CCT，CTC，TTA，CAG，GCT，TCA，GCA，TCT，TCC，ATC，TGA，TTG，GAG， AAT, GGT, TCG, TTCP19 :Tm = 54,60merTGT, AAG, AGA, GGC, AAT, GGC, TGG, TTC, ATC, GAG, TGG, TTC, ATG, GAC, CCA, GTC, TTC，AAA, GGT，GCCP20 :Tm = 54,60merTGC，CTT，TCT，TCT，CGA，ACC，ATT，CGA，CCA，AGA，AGG，ATG，GGT，AGG，CAC，CTT， TGA，AGA，CTG，GGTP21 :Tm = 54,60merATG，GTT，CGA，GAA，GAA，AGG，CAT, CAC，TGT，TCC，AAT，TGA，AGC，TGG，TGA，TAT， GGA，GAC，CAT, CCAP22 :Tm = 54,60merACC，AGT，GTA，GTA，GTT，GAT，GCC，AAG，GAA，GTC，GAT，TGG，TTG，TTG，GAT，GGT， CTC，CAT, ATC，ACCP23 :Tm = 54,60merGCA，TCA，ACT, ACT, ACA，CTG，GTT，CTG，TTG，CCA，GAT，ACA，AGG，AGA，ACG，AAG， GTC，TCT，TTG，ACCP24 :Tm = 54,60merCCA, ATG, TCA, GTC, TTC, TCA, TAG, CCA, GCA, TCG, ACT, TTC, TCC, AGG, TCA, AAG, AGA，CCT，TCG，TTCP25 :Tm = 54,60mer
TAT，GAG，AAG，ACT, GAC，ATT，GGC，TGG，AAC，ATC，TAT，CCA，GAA，GGC，TTC，TAC， AAG，GTC，CTG，TACP26 :Tm = 54,60merTGA, TGT, AGA, TTG, GAA, TCT, GAC, CAT, ACT, GTT, CAG, TGA, TGT, AGT, ACA, GGA, CCT，TGT，AGA，AGCP27 :Tm = 54,60merTCA，GAT，TCC，AAT，CTA，CAT, CAC，TGA，GAA，TGG，TTC，CTG，CTA，CAA，CGA，CGA， ACC，AGT，CAA，TGGP28 :Tm = 54,60merCTG，AGA，CAG，GTA，TCT，GAT，TCT，ACC，TTC，ATC，CTT，GAC，TTG，ACC，ATT，GAC， TGG，TTC，GTC，GTTP29 :Tm = 54,60merGAA，TCA，GAT，ACC，TGT，CTC，AGC，ACC，TGA，CTG，CTC，TCA，AGA，GAA，GCA，TGG， AGT，CTG，GTG，TCAP30 :Tm = 54,60merAAG，TTG，TCG，AGC，AGG，GAC，CAA，GCC，ATG，TAG, CCT，TTG，ATG，TTG，ACA，CCA， GAC，TCC，ATG，CTTP31 :Tm = 54,60merTGG，TCC，CTG，CTC，GAC，AAC，TTT，GAA，TGG，GCT，GAA，GGC，TAC，TCT，ATG，AGA， TTC，GGT，ATC，GTTP32 :Tm = 54,60merAGT，CCT，TCT，TGG，TTC，TCT，CAA，GGG，TTC，TGT，AGT，TGA，CGT，GAA，CGA，TAC， CGA，ATC，TCA，TAGP33 :Tm = 54,60merTGA，GAG, AAC，CAA，GAA，GGA，CTC，TTT，CTA，CTG，GTA，CAA，ACA，GAT，GAT，TGC， CAA，CCA，GTT，CTTP34 :Tm = 54,54merGAG, CTC, TTA, ATG, GTG, ATG, GTG, ATG, GTG, GAG, TTC, GAA, GAA, CTG, GTT, GGC, AAT，CAT利用PCR進行β-葡萄糖苷酶基因的擴增，在100 μ 1反應體系中，P2-P33共32個引物的添加量為2ng，外側引物Pl和Ρ34添加量為30ng，擴增條件為94°C預熱lmin ;94°C， 30s，50°C，30s，72°C，10min，使用的 iTaqDNA聚合酶為 KOD FXtaq 酶(Toyobo 公司，日本)，共 25個循環(huán)。PCR結束后，瓊脂糖膠回收，取10 μ 1直接與T/A克隆載體相連(大連寶生物公司)。4°C連接過夜，高效轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)中。獲得陽性克隆，即為本發(fā)明的葡萄糖苷酶基因，其序列如SEQ ID No 1所示。將該SEQ ID No 1序列與來自極端嗜堿菌Bacillus haloduransC-125的β -葡萄糖苷酶基因相比對，同源性為79%，具體如下1 GTGGATATGTATCGCTTCTCTGTTGCTTGGCCGCGAATTTTTCCGAATGGTACAGGGGAGIl Il Illll I 111111111111111 Illl mil Il mil Il
223 GTTGACATGTACAGATTCTCTGTTGCTTGGCCAAGAATCTTTCCAAACGGTACTGGTGAA61 GTGTCACGTGAAGGATTAGATTATTACCATCGACTTGTTGATCGTTTAACCGAAAACGGGII II I mil I ||| Il Il Illl mil I I Illll Il283 GTCTCCAGAGAAGGTCTTGATTACTATCACAGACTCGTTGACAGACTCACCGAGAATGGT121 ATTCAACCGATGTGTACTCTCTACCATTGGGATTTGCCGCAAGCATTGCAAGAAAAGGGCIlllll IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII Illl mil lllllll Il343 ATTCAACCAATGTGTACTCTCTACCATTGGGATCTGCCACAAGCTCTGCAAGAGAAAGGT181 GGCTGGGATAATCGCGACACGATCGACGCTTTTGTCCGTTATGCTGAGGTCATGTTCAAAIl mil Il I III Illll Il Illlll I Il Illll IIIIIIIII403 GGTTGGGACAACAGAGACACCATCGATGCCTTTGTCAGATACGCTGAAGTCATGTTCAAG241 GAGTTCGGTGATAAAATTAACCACTGGATTACTTTTAATGAGCTGTGGTGCGTTTCTTTCmil mil Il || IIIIIIIII Il Il Il Il Illlll mil Il463 GAGTTTGGTGACAAGATCAACCACTGGATCACCTTCAACGAACTGTGGTGTGTTTCCTTC301 CTTTCAAATTATATCGGTGTCCATGCACCTGGAAATACCGATCTCCAGCTAGCGACAAATIl Il Il Il Il IIIIIIIII Il Il lllllllllllllllll Il Il523 CTCTCCAACTACATTGGTGTCCATGCTCCAGGCAATACCGATCTCCAGCTTGCTACCAAC361 GTGGCCCACCATCTTCTAGTTGCTCATGGAAAAGCGGTTCAGTCGTATCGAAAAATGGGGIl Il IIIIIIIII IIIIIIIII Il Il ΜΙΝΙ Il Illl III583 GTTGCTCACCATCTTCTTGTTGCTCATGGTAAGGCTGTTCAGTCCTACAGAAAGATGGGT421 CTTGATGGACAAATCGGGTACGCGCCGAATGTAGAATGGAATGAGCCTTTCAGCAATCAAIlllll Il Il Il Il Il Il Il Il Il III Il Il III Mill643 CTTGATGGTCAGATTGGTTATGCTCCTAACGTCGAGTGGAACGAACCATTCTCCAATCAG481 ATGGAGGATGCTGAAGCTTGTAAGCGGGGGAATGGTTGGTTTATCGAATGGTTTATGGATIII IIIIIIIII Mill I Il III III III III III703 ATGGAAGATGCTGAAGCCTGTAAGAGAGGCAATGGCTGGTTCATCGAGTGGTTCATGGAC541 CCAGTCTTCAAGGGAGCCTACCCATCTTTCTTAGTCGAATGGTTTGAGAAGAAAGGGATTIIIIIIIII Il IIIIIIIII III IIIIIIIII IIIIIIIII763 CCAGTCTTCAAAGGTGCCTACCCATCCTTCTTGGTCGAATGGTTCGAGAAGAAAGGCATC601 ACCGTACCGATTGAGGCTGGAGATATGGAGACAATCCAACAACCAATCGACTTTTTAGGAIl Il Il III III IIIIIIIII llllllllllllllllll I823 ACTGTTCCAATTGAAGCTGGTGATATGGAGACCATCCAACAACCAATCGACTTCCTTGGC661 ATTAACTATTATACGGGAAGTGTTGCCCGCTACAAGGAGAACGAAGGACTATTTGATCTAIl III Il Il Il lllllll I lllllllllllllllll Il III883 ATCAACTACTACACTGGTTCTGTTGCCAGATACAAGGAGAACGAAGGTCTCTTTGACCTG721 GAAAAAGTAGATGCAGGTTATGAGAAAACGGATATTGGCTGGAACATTTATCCTGAAGGCIl III III Il ΜΙΝΙ Il Il llllllllllll III Mill943 GAGAAAGTCGATGCTGGCTATGAGAAGACTGACATTGGCTGGAACATCTATCCAGAAGGC781 TTTTACAAAGTGTTGTACTATATAACTGAGCAATATGGACAAATCCCGATTTATATTACGIl III Il lllllll Il III Il III Il Il Il Il Il Il
1003 TTCTACAAGGTCCTGTACTACATCACTGAACAGTATGGTCAGATTCCAATCTACATCACT841 GAAAATGGGTCTTGTTACAATGATGAACCTGTGAATGGGCAAGTGAAGGATGAGGGGCGAIl III Il Il III Il III Il III III Illlll Il1063 GAGAATGGTTCCTGCTACAACGACGAACCAGTCAATGGTCAAGTCAAGGATGAAGGTAGA901 ATCCGCTACTTGAGCCAGCATTTGACGGCACTAAAGCGTAGCATGGAGTCAGGTGTCAACIII I III II III Illl Il Il III I lllllllll lllllll1123 ATCAGATACCTGTCTCAGCACCTGACTGCTCTCAAGAGAAGCATGGAGTCTGGTGTCAAC961 ATTAAAGGATACATGGCGTGGTCATTGCTCGATAATTTTGAATGGGCCGAGGGCTACAGTIl III Illlll III lllllll Il lllllllll Il Mill1183 ATCAAAGGCTACATGGCTTGGTCCCTGCTCGACAACTTTGAATGGGCTGAAGGCTACTCT1021 ATGAGGTTTGGCATCGTTCACGTCAATTATCGAACGTTGGAACGGACGAAGAAGGATAGTIllll Il Il IIIIIIIIIIM Il Illl I Il I Il Illlll1243 ATGAGATTCGGTATCGTTCACGTCAACTACAGAACCCTTGAGAGAACCAAGAAGGACTCT1081 TTCTATTGGTATAAACAAATGATTGCCAATCAGTTCTTTGAACTTTAAIllll Illll Illll lllllllllll Illlll Illll1303 TTCTACTGGTACAAACAGATGATTGCCAACCAGTTCTTCGAACTCCACCATCACCATCAC實施例2 β -葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌中表達參看圖2，將上述SEQ ID No 1序列直接與原核表達載體ρΥΜ4087相連，4°C連接2 小時。然后將該載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌T0P10 (Invitrogen)。將菌液涂布于含有50 μ g/ mL氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基(15g/L瓊脂，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH7. 5)，37°C培養(yǎng)16小時，直到有淡藍色的菌落長出。挑取3-5個菌落，接種于50ml液體LB培養(yǎng)基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl, 10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH7. 5) 中，37°C搖床直到菌液的濃度達到0D600為1. 0時停止培養(yǎng)。實施例3 β -葡萄糖苷酶基因的純化將實施例2最終獲得的培養(yǎng)液在5，OOOg重力加速度下離心5min，無菌水清洗1 次。所得的細胞沉淀用ImL磷酸裂解緩沖液重懸，然后將其轉(zhuǎn)移到微量離心管中。使用超聲波儀裂解菌液30min，以12，OOOg離心30min。使用微孔濾膜過濾離心好的上清，上到 Ni-Agarose柱上，純化出目的蛋白。將目的蛋白透析后使用蛋白保存液保存起來。實施例4β -葡萄糖苷酶基因的酶動力學特性分析葡萄糖苷酶的酶動力學特性分析主要有三個底物。它們分別是oNPGlu， oNPGal和pNPfeil。反應采用實施例3中的體系。主要測定酶對不同底物的Km和最大反應速度Vmax。也就是在溫度、pH及酶濃度恒定的條件下，底物濃度對酶促反應的速度有很大的影響。在底物濃度很低時，酶促反應的速度(ν)隨底物濃度的增加而迅速增加；隨著底物濃度的繼續(xù)增加，反應速度的增加開始減慢；當?shù)孜餄舛仍黾拥侥撤N程度時，反應速度達到一個極限值(Vmax)。底物濃度與反應速度的這種關系可用Michaelis-Menten方程式表示
ι·…Λ Λ π,,^nax ]ν = ^ 式中V-反應速度；Km-米氏常數(shù)；Vmax-酶反應最大速度；[S]-底物濃度。
12
采用Linewaver-Burk作圖法測定Km、Vmax，該法是根據(jù)米氏方程的倒數(shù)形式，以1/ V對l/[s]作圖，得到一條直線。直線在橫軸上的截距為-1/Km，縱截距為l/vmax，求出Km與
Vmax °
權利要求
1.一種來自極端嗜堿菌的β-葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其編碼的核苷酸序列如SEQ ID No 2所示。
2.根據(jù)權利要求1所述的來自極端嗜堿菌的葡萄糖苷酶基因，其特征在于，所述的極端嗜堿菌為 Bacillus halodurans C-125。
3.權利要求1所述的來自極端嗜堿菌的葡萄糖苷酶基因的合成方法，其特征在于， 采用大量重疊的引物通過兩步PCR進行全基因的合成，即首先首先設計34個引物，通過重疊延伸獲得合成基因的片段，再通過最外側的引物將全長的基因擴增得到目的基因。
4.根據(jù)權利要求3所述的合成方法，所述引物的序列具體如下 Pl:Tm = 54,60merGGA，TCC，ATG，TCT，ATC，ATT，CAG，TTT，CCA，AAG，GAG，ATG，AAG，TGG，GGT，GTT，GCT， ACT, GCT，TCTP2 :Tm = 54,60merCAC，CTC，TAC，CAC，CAG，CAT, TGA，TAG, CAC，CTT，CGA，TCT，GGT，AAG，AAG，CAG，TAG, CAA，CAC，CCCP3 :Tm = 54,60merCAA，TGC，TGG，TGG，TAG, AGG，TGC，TTC，CAT, CTG，GGA，TGT，CTT，TGC，CAA，GAC，TCC， AGG，TAA，GGTP4 :Tm = 54,60merATA, GGA，GTC，ACA，GGC，AAC，ATC，ACC，ATT，GTC，ACC，GTT，CTT，GAC，CTT，ACC，TGG， AGT，CTT，GGCΡ5 :Tm = 54,60merATG，TTG，CCT，GTG，ACT, CCT，ATC，ACA，GAT，ACG，AAG，AAG，ACA，TTG，AGA，TCA，TGA， AGG，ATC，TTGP6 :Tm = 54,60merATT，CTT，GGC，CAA，GCA，ACA，GAG，AAT，CTG，TAC，ATG，TCA，ACA，CCA，AGA，TCC，TTC， ATG，ATC，TCAP7 :Tm = 54,60merTCT，GTT，GCT，TGG，CCA，AGA，ATC，TTT，CCA，AAC，GGT，ACT, GGT，GAA，GTC，TCC，AGA， GAA，GGT，CTTP8 :Tm = 54,60merCAT, TCT，CGG，TGA，GTC，TGT，CAA，CGA，GTC，TGT，GAT，AGT，AAT，CAA，GAC，CTT，CTC， TGG，AGA，CTTP9 :Tm = 54,60merTGA，CAG，ACT, CAC，CGA，GAA，TGG，TAT，TCA，ACC，AAT，GTG，TAC，TCT，CTA，CCA，TTG， GGA，TCT，GCCPlO :Tm = 54,60merGTC, TCT, GTT, GTC, CCA, ACC, ACC, TTT, CTC, TTG, CAG, AGC, TTG, TGG, CAG, ATC, CCA, ATG，GTA，GAGPll :Tm = 54,60merGTG，GTT，GGG，ACA，ACA，GAG，ACA，CCA，TCG，ATG，CCT，TTG，TCA，GAT，ACG，CTG，AAG， TCA, TGT, TCAP12 :Tm = 54,60merTTG，AAG，GTG，ATC，CAG，TGG，TTG，ATC，TTG，TCA，CCA，AAC，TCC，TTG，AAC，ATG，ACT, TCA，GCG，TATP13 :Tm = 54,60merAAC，CAC，TGG，ATC，ACC，TTC，AAC，GAA，CTG，TGG，TGT，GTT，TCC，TTC，CTC，TCC，AAC， TAC，ATT，GGTP14 :Tm = 54,60merTGG，TAG, CAA，GCT，GGA，GAT，CGG，TAT，TGC，CTG，GAG，CAT, GGA，CAC，CAA，TGT，AGT， TGG，AGA，GGAP15 :Tm = 54,60merCGA, TCT, CCA, GCT, TGC, TAC, CAA, CGT, TGC, TCA, CCA, TCT, TCT, TGT, TGC, TCA, TGG, TAA, GGC, TGTP16 :Tm = 54,60merACC，AAT，CTG，ACC，ATC，AAG，ACC，CAT, CTT，TCT，GTA，GGA，CTG，AAC，AGC，CTT，ACC， ATG，AGC，AACP17 :Tm = 54,60merGTC，TTG，ATG，GTC，AGA，TTG，GTT，ATG，CTC，CTA，ACG，TCG，AGT，GGA，ACG，AAC，CAT, TCT，CCA，ATCP18 :Tm = 54,60merCAG，CCA，TTG，CCT，CTC，TTA，CAG，GCT，TCA，GCA，TCT，TCC，ATC，TGA，TTG，GAG, AAT， GGT, TCG, TTCP19 :Tm = 54,60merTGT, AAG, AGA, GGC, AAT, GGC, TGG, TTC, ATC, GAG, TGG, TTC, ATG, GAC, CCA, GTC, TTC, AAA, GGT，GCCP20 :Tm = 54,60merTGC，CTT，TCT，TCT，CGA，ACC，ATT，CGA，CCA，AGA，AGG，ATG，GGT，AGG，CAC，CTT，TGA， AGA，CTG，GGTP21 :Tm = 54，60merATG，GTT，CGA，GAA，GAA，AGG，CAT, CAC，TGT，TCC，AAT，TGA，AGC，TGG，TGA，TAT，GGA， GAC，CAT, CCAP22 :Tm = 54,60merACC，AGT，GTA，GTA，GTT，GAT，GCC，AAG，GAA，GTC，GAT，TGG，TTG，TTG，GAT，GGT，CTC， CAT, ATC，ACCP23 :Tm = 54,60merGCA, TCA, ACT, ACT, ACA, CTG, GTT, CTG, TTG, CCA, GAT, ACA, AGG, AGA, ACG, AAG, GTC, TCT，TTG，ACCP24 :Tm = 54，60merCCA，ATG，TCA，GTC，TTC，TCA，TAG, CCA，GCA，TCG，ACT, TTC，TCC，AGG，TCA，AAG，AGA， CCT，TCG，TTCP25 :Tm = 54,60merTAT，GAG，AAG，ACT, GAC，ATT，GGC，TGG，AAC，ATC，TAT，CCA，GAA，GGC，TTC，TAC，AAG， GTC，CTG，TACP26 :Tm = 54,60merTGA，TGT，AGA，TTG，GAA，TCT，GAC，CAT, ACT, GTT，CAG，TGA，TGT，AGT，ACA，GGA，CCT， TGT，AGA，AGCP27 :Tm = 54,60merTCA，GAT，TCC，AAT，CTA，CAT, CAC，TGA，GAA，TGG，TTC，CTG，CTA，CAA，CGA，CGA，ACC， AGT，CAA，TGGP28 :Tm = 54,60merCTG，AGA，CAG，GTA，TCT，GAT，TCT，ACC，TTC，ATC，CTT，GAC，TTG，ACC，ATT，GAC，TGG， TTC, GTC, GTTP29 :Tm = 54,60merGAA，TCA，GAT，ACC，TGT，CTC，AGC，ACC，TGA，CTG，CTC，TCA，AGA，GAA，GCA，TGG，AGT， CTG，GTG，TCAP30 :Tm = 54,60merAAG，TTG，TCG，AGC，AGG，GAC，CAA，GCC，ATG，TAG, CCT，TTG，ATG，TTG，ACA，CCA，GAC， TCC，ATG，CTTP31 :Tm = 54,60merTGG，TCC，CTG，CTC，GAC，AAC，TTT，GAA，TGG，GCT，GAA，GGC，TAC，TCT，ATG，AGA，TTC， GGT，ATC，GTTP32 :Tm = 54,60merAGT，CCT，TCT，TGG，TTC，TCT，CAA，GGG，TTC，TGT，AGT，TGA，CGT，GAA，CGA，TAC，CGA， ATC，TCA，TAGP33 :Tm = 54,60merTGA，GAG, AAC，CAA，GAA，GGA，CTC，TTT，CTA，CTG，GTA，CAA，ACA，GAT，GAT，TGC，CAA， CCA，GTT，CTTP34 :Tm = 54,54merGAG, CTC，TTA，ATG，GTG，ATG，GTG，ATG，GTG，GAG，TTC，GAA，GAA，CTG，GTT，GGC，AAT，CAT。
5.根據(jù)權利要求4所述的合成方法，其特征在于，每相鄰的兩個引物序列有20個堿基的重復。
6.根據(jù)權利要求4所述的合成方法，其特征在于，引物P2-P33為內(nèi)側引物，PUP34為外側引物。
7.權利要求1所述的來自極端嗜堿菌的葡萄糖苷酶基因在原核生物中的表達。
8.根據(jù)權利要求7所述的表達，其特征在于，所述原核生物為載體ΡΥΜ4087。
9.根據(jù)權利要求7所述的表達，其特征在于，將葡萄糖苷酶基因與原核表達載體PYM4087連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。
10.權利要求1所述的來自極端嗜堿菌的葡萄糖苷酶基因的純化方法，其特征在于，對權利要求7至9任一項所述的原核表達最終獲得的培養(yǎng)液離心、洗滌、重懸，使用微孔濾膜過濾離心，上到Ni-Agar0se柱上，即純化出目的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來自極端嗜堿菌的β-葡萄糖苷酶基因及其合成、表達和純化。所述的β-葡萄糖苷酶的基因，是通過化學合成得到，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，全長1374bp，其編碼的核苷酸序列如SEQ ID No 2所示。將該基因構入到原核表達載體中并轉(zhuǎn)化入原核生物中，可用于β-葡萄糖苷酶的工業(yè)生產(chǎn)應用。
文檔編號C12N9/42GK102533816SQ20101059972
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月21日 優(yōu)先權日2010年12月21日
發(fā)明者付曉燕, 姚泉洪, 彭日荷, 徐虎, 熊愛生, 田永生, 趙偉, 金曉芬, 陳晨, 韓紅娟 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學院