專利名稱：一種山羊雄性生殖干細(xì)胞的體外分離及培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及動物干細(xì)胞的體外增殖、分化、分離，特別涉及一種山羊雄性生殖干細(xì)胞的體外分離及培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
生殖細(xì)胞的發(fā)生、增殖、分化的研究是生命科學(xué)研究的重要課題之一。在動物繁殖育種中，高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的遺傳資源完全依賴于生殖細(xì)胞來完成遺傳；在人類，由于精子細(xì)胞的發(fā)生、成熟障礙等引起的不育癥更是困擾眾多患者的一個現(xiàn)實(shí)問題；在基礎(chǔ)研究中，精子更是發(fā)育生物學(xué)研究的最重要研究對象之一；因此生殖細(xì)胞的發(fā)生、分化的研究，在畜牧業(yè)生產(chǎn)和生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要的意義。然而高等哺乳動物生殖細(xì)胞的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、分化完全在體內(nèi)完成，因此很難動態(tài)實(shí)時地檢測和研究其中的分子事件(Hua等，Recent advances in the derivation of germ cells from the embryonic stem cells.Stem Cells and Development,2008,17 :399-411)。干細(xì)胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體。胚胎干細(xì)胞 (ES細(xì)胞或ESCs)是由早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)或原始生殖細(xì)胞(PGCs)分離而來的多能干細(xì)胞。由于胚胎干細(xì)胞的獨(dú)特生物學(xué)特性，使干細(xì)胞在細(xì)胞替代治療、組織器官修復(fù)與重建、基因治療以及發(fā)育生物學(xué)模型、新藥開發(fā)和毒理實(shí)驗(yàn)等，幾乎所有的生命科學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域均具有重要的意義。iS^jft, —Wff(Sesndel 等’ Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors. Nature ；2007,449 :346-350 ； Bukovsky 等，Generation of pluripotent stem cells from adult human testis. Nature, 456, 344-349)發(fā)現(xiàn)從胚胎期動物生殖嵴的原始生殖細(xì)胞或雄性的睪丸可以得到類似于ES細(xì)胞的多能性分化潛能的雄性生殖干細(xì)胞(mGSCs)。一般認(rèn)為，這些雄性生殖干細(xì)胞(mGSCs)來源于原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCs)，終生存在于性分化后的睪丸中，包括性分化后到精子發(fā)生過程中，具有自我增殖和分化潛能的細(xì)胞總稱；不同于精原干細(xì)胞(SSCs)，mGSCs可以分化為機(jī)體所有的類型細(xì)胞，精原干細(xì)胞指未分化的A型精原細(xì)胞，一般認(rèn)為其只有向精子分化的潛能(Ko等，2009)。但也有人認(rèn)為目前生殖干細(xì)胞的起源并不清楚(Yu等，Pluripotent stem cell lines. Genes & Dev，2008，22 :1987-1997)。由于成年動物睪丸的精原細(xì)胞在體外合適的條件下，可能轉(zhuǎn)化為多能性的雄性生殖干細(xì)胞(Matsui 等，Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell，1992，70 :841-847 ；董武子等，新生牛雄性生殖細(xì)胞源類ES的培養(yǎng)及檢測，畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2007,38 ) =144-148 ； Guan等， Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis. Nature，2006， 440 :1199-1203 ;Sesndel等，Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors. Nature ；2007,449 :346-350 ；Kanatsu-Shinohara 等，Pluripotency of a single spermatogonial stem cell in mice. Biol Reprod.，2008，78(4) :681-687 ；Kanatsu 等，Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis. Cell，2004，119 :1001-1012 ；Bukovsky 等，Generation of pluripotent stem cells from adult human testis. Nature，456，344-349 ；Kanatsu-Shinohara 等， Pluripotency of asingle spermatogonial stem cell in mice. Biol Reprod.，2008， 78(4) :681-687)。所以，mGSCs成為轉(zhuǎn)基因動物和克隆動物的理想載體細(xì)胞，而且比起正常的ES細(xì)胞，mGSCs細(xì)胞來源數(shù)量多，培養(yǎng)相對容易。但對于生殖細(xì)胞研究來說，更為重要的是mGSCs能夠有效地分化產(chǎn)生出精子(Ko等，Induction of pluripotency in adult unipotent germline stem cells. Cell Stem Cell,2009, 5 :87-96)。mGSCs在線蟲、果蠅和小鼠等模式動物上取得了一些進(jìn)展，如建立了精原干細(xì)胞的培養(yǎng)體系，基本了解各種動物雄性生殖干細(xì)胞維持的機(jī)理(Ko等，hduction of pluripotency in adult unipotent germline stem cell s.Cell Stem Cell,2009,5: 87-96)。但對大家畜如牛、羊、豬等的生殖干細(xì)胞，人們了解的仍很不夠，僅見的幾篇研究報道涉及到mGSCs細(xì)胞的分離培養(yǎng)，但未見有生殖干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化分離培養(yǎng)方法(董武子等， 山羊胎兒睪丸細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及雄性生殖系干細(xì)胞的生長行為.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報， 2004，12 (6) =648-652.；董武子等，胎牛雄性生殖干細(xì)胞源類ES細(xì)胞的分離培養(yǎng)與多能性研究.生物工程學(xué)報，2007，23 ) :751-755;董武子等，新生牛雄性生殖細(xì)胞源類ES的培養(yǎng)及檢測.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2007，38 O) :144-148).山羊是一種重要的經(jīng)濟(jì)動物，生產(chǎn)肉、絨、奶等經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品，特別是在利用山羊乳腺作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)生物制品方面具有巨大的市場潛力。如何獲得、保持優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)遺傳資源，對現(xiàn)有種群進(jìn)行改良，成為山羊大規(guī)模養(yǎng)殖的迫切問題，對山羊生殖細(xì)胞的研究成為解決種質(zhì)遺傳資源的重要手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的解決的問題在于提供一種山羊雄性生殖干細(xì)胞的體外分離及培養(yǎng)方法， 從雄性山羊的睪丸體外分離克隆雄性生殖干細(xì)胞，并對分離到的山羊雄性生殖干細(xì)胞離體培養(yǎng)，為研究山羊的生殖細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種山羊雄性生殖干細(xì)胞的體外分離方法，包括以下步驟1)分離細(xì)胞將從無菌采集的山羊睪丸中分離的曲細(xì)精管剪碎至碎塊，用包含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸2 3次曲細(xì)精管碎塊，靜置之后得到下層曲細(xì)精管細(xì)胞團(tuán)；然后用包含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 的CollagenaseUOy g/ml DNase和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 透明質(zhì)酸酶的混合液消化處理下層曲細(xì)精管細(xì)胞團(tuán)2 3次，每次20 30分鐘，用包含體積分?jǐn)?shù)10% FBS 的DMEM培養(yǎng)液重懸，分離得到精原細(xì)胞；2)雄性生殖干細(xì)胞的原代培養(yǎng)將得到的精原細(xì)胞以5 X IO5個/mL的密度接種在經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 2%的明膠37°C 包被30min的塑料培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液為山羊雄性生殖干細(xì)胞分離培養(yǎng)液；所述山羊雄性生殖干細(xì)胞分離培養(yǎng)液以DMEM高糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括以下組分體積分?jǐn)?shù)20%的胎牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、lmmol/L丙酮酸鈉、0. Immol/Li3-巰基乙醇、0. lmmol/L非必需氨基酸、5 lOng/ml的堿性成纖維生長因子、1000U/ml 的白血病抑制因子、100IU/ml青霉素和lOOmg/mL鏈霉素；培養(yǎng)Ia1后將未貼壁的細(xì)胞轉(zhuǎn)到經(jīng)Matrigel 4°C包被1小時的塑料培養(yǎng)皿培養(yǎng)， 培養(yǎng)液為山羊雄性生殖干細(xì)胞分離培養(yǎng)液或人胚胎干細(xì)胞無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)液；未貼壁的細(xì)胞第一次轉(zhuǎn)移培養(yǎng)池后，將轉(zhuǎn)移培養(yǎng)后再次未貼的壁細(xì)胞轉(zhuǎn)移培養(yǎng)到經(jīng)Matrigel 4°C包被1小時的塑料培養(yǎng)皿培養(yǎng)，培養(yǎng)液為山羊雄性生殖干細(xì)胞分離培養(yǎng)液或人胚胎干細(xì)胞無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)液；未貼壁細(xì)胞第二次轉(zhuǎn)移培養(yǎng)后，2天更換一次培養(yǎng)液；細(xì)胞生長3 7天后，開始出現(xiàn)致密胚胎干細(xì)胞樣集落；3)雄性生殖干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)待致密胚胎干細(xì)胞樣集落生長至周邊開始出現(xiàn)分化細(xì)胞時，將致密胚胎干細(xì)胞樣集落吸出，在PBS中洗滌2次；再移到TrypLE細(xì)胞消化液或質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 05%的胰蛋白酶中消化2 3min，并吹吸5 20次；將離散開的單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到經(jīng)Matrigel 4°C包被1小時的塑料的培養(yǎng)皿培養(yǎng)，培養(yǎng)液為山羊雄性生殖干細(xì)胞分離培養(yǎng)液；37°C、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)；培養(yǎng)3 7天后，開始出現(xiàn)致密胚胎干細(xì)胞樣集落，即為山羊雄性生殖干細(xì)胞。進(jìn)一步，本發(fā)明還公開了分離得到的山羊雄性生殖干細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法將山羊雄性生殖干細(xì)胞接種到MEF飼養(yǎng)層上，培養(yǎng)液以DMEM高糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括以下組分體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)10%的血清替代品、2mM谷氨酰胺、0. ImM β -巰基乙醇、100IU/ml青霉素、100mg/mL鏈霉素、質(zhì)量分?jǐn)?shù)的1 %非必需氨基酸、1000IU/ml白血病抑制因子、5 lOng/ml堿性成纖維生長因子、質(zhì)量分?jǐn)?shù)的ITS ；2 天更換一次培養(yǎng)液；或者將山羊雄性生殖干細(xì)胞接種到Matrigel 4°C包被1小時的塑料培養(yǎng)皿無飼養(yǎng)層培養(yǎng)，培養(yǎng)液為人胚胎干細(xì)胞無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)液，2天更換一次培養(yǎng)液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果1、分離克隆的山羊雄性生殖干細(xì)胞形成典型的致密胚胎干細(xì)胞樣集落，具有ES 細(xì)胞特性，其堿性磷酸酶(AP)呈陽性，0CT4、SSEAU SSEA3、SSEA4、β 1-INTEGRIN、NANOG, CD49f、CD133、C-MYC, S0X2、KLF4 也呈陽性；2、分離克隆的山羊雄性生殖干細(xì)胞具有三胚層的分化潛能，能分化形成神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞和精子樣細(xì)胞；尤其是具有精子樣細(xì)胞的分化潛能對于山羊優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的獲得、保持、改良具有重要的意義；3、分離培養(yǎng)的山羊雄性生殖干細(xì)胞較大，細(xì)胞透亮、遮光性強(qiáng)、核大，培養(yǎng)后3 7 天形成典型的致密細(xì)胞克隆，類似ES細(xì)胞克隆。


圖1為山羊雄性生殖干細(xì)胞的生物學(xué)特性和染色檢測結(jié)果；其中，圖A為單個山羊雄性生殖干細(xì)胞，較大，細(xì)胞透亮、遮光性強(qiáng)、核大；圖B、C為山羊雄性生殖干細(xì)胞集落，致密；圖D、E為堿性磷酸酶染色顯示山羊雄性生殖干細(xì)胞呈紅色，為AP陽性；圖F為山羊雄性生殖干細(xì)胞集落的Gimesa染色，核大；Bar = 100 μ m。
圖2為山羊雄性生殖干細(xì)胞表面標(biāo)記的免疫熒光化學(xué)檢測結(jié)果；其中，圖A表示為 0CT4陽性；圖B表示為SSEAl陽性；圖C表示為SSEA3弱陽性；圖D表示為SSEA 4陽性；圖 E表示為β 1-INTEGRIN陽性；圖F表示為NANOG陽性；圖G表示為CD49f陽性；圖H表示為 ⑶133陽性；圖I表示為VASA弱陽性；圖J表示C-MYC陽性、圖K表示S0X2陽性、圖L表示 KLF4 陽性；Bar = 20 μ m。圖3為山羊雄性生殖干細(xì)胞的分化潛能檢測，其中，圖A為山羊雄性生殖干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)形成的類胚體(EB)；圖B為EB貼壁培養(yǎng)后周邊分化出神經(jīng)樣細(xì)胞；圖C為山羊雄性生殖干細(xì)胞分化出神經(jīng)樣細(xì)胞；圖D為EB貼壁培養(yǎng)后分化出的心肌樣細(xì)胞融合的肌管樣結(jié)構(gòu)；圖E為EB貼壁培養(yǎng)后分化出的心肌樣細(xì)胞呈心肌α -actin陽性；圖F為EB貼壁培養(yǎng)后分化出的心肌樣細(xì)胞呈心肌特異性肌鈣蛋白T陽性；圖G為EB貼壁培養(yǎng)后分化出的脂肪樣細(xì)胞呈油紅0陽性；圖H為EB貼壁培養(yǎng)后分化出的精子樣細(xì)胞；圖I為EB貼壁培養(yǎng)后分化出的精子樣細(xì)胞呈Analine Blue陽性；圖J為山羊雄性生殖干細(xì)胞分化出的細(xì)胞呈VASA 陽性；圖K為山羊雄性生殖干細(xì)胞分化出的細(xì)胞呈FE-Jl陽性；圖L為山羊雄性生殖干細(xì)胞分化出的細(xì)胞呈EMAl陽性。圖4為無飼層體外培養(yǎng)的山羊雄性生殖干細(xì)胞呈現(xiàn)較典型的致密胚胎干細(xì)胞樣集落。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種高效分離克隆山羊雄性生殖干細(xì)胞的培養(yǎng)體系，包括山羊雄性生殖干細(xì)胞的分離、山羊雄性生殖干細(xì)胞的檢測和體外培養(yǎng)。以2月齡以上胎羊、新生羊或成年羊睪丸作為原始材料來源；山羊雄性生殖干細(xì)胞的分離純化方法采用0. 2%明膠和Matrigel差速貼壁結(jié)合克隆法，將未貼壁的山羊雄性生殖干細(xì)胞與貼壁培養(yǎng)的其他細(xì)胞區(qū)分、分離。a、山羊雄性生殖干細(xì)胞的體外分離方法，具體包括以下步驟1)分離山羊睪丸細(xì)胞用無菌含雙抗(500IU/ml青霉素、500mg/mL鏈霉素)的生理鹽水將無菌采集的山羊睪丸洗滌3遍，再用含雙抗的PBS (磷酸鹽緩沖液)洗滌3遍，在無菌培養(yǎng)皿內(nèi)剝?nèi)ゲG丸外膜，分離開曲細(xì)精管與睪丸梁，去除小梁，得到曲細(xì)精管；將曲細(xì)精管剪碎至Imm3的小碎塊，用包含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM (Dulbecco' s Modified Eagle Media)培養(yǎng)液重懸(500轉(zhuǎn)以下離心)曲細(xì)精管碎塊，重復(fù)2 3次，靜置 2 5分鐘之后，得到下層曲細(xì)精管細(xì)胞團(tuán)；然后用包含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 的CollagenaseUO μ g/ml DNase和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 透明質(zhì)酸酶的混合液消化處理2 3次，每次20 30分鐘，再用DMEM+10% FBS重懸培養(yǎng)液 (500轉(zhuǎn)以下離心)，分離得到精原細(xì)胞；如果細(xì)胞團(tuán)仍較大，則用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 25%的胰蛋白酶處理3 5分鐘，用包含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)；2)雄性生殖干細(xì)胞的原代培養(yǎng)將得到的精原細(xì)胞以5X IO5個/mL的密度接種在經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的明膠37°C 包被30min的塑料培養(yǎng)皿，添加山羊雄性生殖干細(xì)胞分離培養(yǎng)液；
所述山羊雄性生殖干細(xì)胞分離培養(yǎng)液以DMEM高糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括以下組分體積分?jǐn)?shù)20%的胎牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、lmmol/L丙酮酸鈉、0. Immol/ Li3-巰基乙醇、0. lmmol/L非必需氨基酸(NEAA，美國Invitrogen公司產(chǎn)品)、5 IOng/ ml的堿性成纖維生長因子(bFGF)、1000U/ml的白血病抑制因子(mLIF)、100IU/ml青霉素、 100mg/mL鏈霉素；培養(yǎng)1 后將未貼壁的細(xì)胞轉(zhuǎn)到經(jīng)Matrigel基質(zhì)膜(BD公司)4°C包被1小時的塑料培養(yǎng)皿培養(yǎng)，培養(yǎng)液為山羊雄性生殖干細(xì)胞分離培養(yǎng)液或人胚胎干細(xì)胞無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)液(mTeSR培養(yǎng)液，商品化的人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液，Stemcell技術(shù)公司生產(chǎn))；未貼壁的細(xì)胞第一次轉(zhuǎn)移培養(yǎng)池后，將轉(zhuǎn)移培養(yǎng)后再次未貼壁的細(xì)胞轉(zhuǎn)移培養(yǎng)到經(jīng)Matrigel基質(zhì)膜4°C包被1小時的培養(yǎng)皿培養(yǎng)，培養(yǎng)液為山羊雄性生殖干細(xì)胞分離培養(yǎng)液或人胚胎干細(xì)胞無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)液；未貼壁細(xì)胞第二次轉(zhuǎn)移培養(yǎng)后，2天更換一次培養(yǎng)液；細(xì)胞生長5 7天后，開始出現(xiàn)較典型的致密胚胎干細(xì)胞樣集落；3)雄性生殖干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)待致密胚胎干細(xì)胞樣集落生長至周邊開始出現(xiàn)分化細(xì)胞，即周邊細(xì)胞變大，界限明顯時，將致密胚胎干細(xì)胞樣集落吸出，在100 μ 1 PBS中洗滌2次；再移到100 μ 1 TrypLE 細(xì)胞消化液(商品化的細(xì)胞消化液，^witrogen公司的TrypLE Express)或質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0. 05%的胰蛋白酶中消化2 3min，并用10 μ 1移液槍吹吸5 20次離散細(xì)胞；將離散開的單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)移到經(jīng)MatrigelfC包被1小時的塑料培養(yǎng)皿培養(yǎng)，培養(yǎng)液為山羊雄性生殖干細(xì)胞分離培養(yǎng)液；37°C、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)；細(xì)胞生長3 7天后，開始出現(xiàn)較典型的致密胚胎干細(xì)胞樣集落，即為分離得到的山羊雄性生殖干細(xì)胞。b、分離到的山羊雄性生殖干細(xì)胞的細(xì)胞檢測1)堿性磷酸酶檢測將傳代培養(yǎng)分離到的致密胚胎干細(xì)胞樣集落的山羊雄性生殖干細(xì)胞用4%多聚甲醛固定3 5min后，用無鈣鎂的PBS洗兩遍，用堿性磷酸酶染液Qmg α -萘酚磷酸鹽和IOmg 堅(jiān)固紅溶于10ml PH 8. 2 8. 4的Tris-Cl溶液中)染色8min，吸出染色液，PBS洗2次， 照相記錄；分離克隆的山羊雄性生殖干細(xì)胞具有ES細(xì)胞特性和生殖干細(xì)胞的生物學(xué)特性， 形成典型的集落，如圖IB F所示；山羊雄性生殖干細(xì)胞的堿性磷酸酶染色呈紅色，如圖 D E所示，為堿性磷酸酶(AP)陽性，即具有多能性干細(xì)胞的特性(Hua等，2009 ；Ko等， 2009)。2)免疫組化或免疫熒光檢測將培養(yǎng)的山羊雄性生殖干細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15min，用PBS洗兩遍，3% H2O2室溫孵育lOmin，PBS洗兩遍，10%胎牛血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育30min，傾去血清，分別滴加 0CT4(1 500)、SSEA1(1 200)、SSEA3(1 200)、SSEA4(1 200)、 β 1-INTEGRIN(1 200) , NANOG (1 200)、CD49f (1 200)、CD133(1 500)、 VASA(1 1000)、C-MYC(1 200)、S0X2(1 200)、KLF4(1 200) 一抗工作液，4°C過夜， PBS洗兩遍，滴加二抗(羊抗兔FITC或羊抗鼠FITC，1 500)工作液，室溫孵育lh，PBS洗兩遍，每次5min，熒光顯微鏡下觀察照相記錄結(jié)果；上述免疫熒光的一抗標(biāo)志均為ES細(xì)胞和生殖干細(xì)胞的標(biāo)記，檢測結(jié)果分別如圖 2 所示，0CT4(A)、SSEA1(B)、SSEA4(D)、β 1-INTEGRIN(E)、NANOG(F)、CD49f (G)、CD133 (H)、 C-MYC (J)、S0X2⑷、KLF4 (L)檢測呈陽性，SSEA3 (C)、VASA⑴檢測弱陽性，表明山羊雄性生殖干細(xì)胞具有生殖干細(xì)胞和ES細(xì)胞特性(Hua等，2009 ；Ko等，2009)。3)細(xì)胞體外分化潛能以600個細(xì)胞/25 μ 1的小滴懸滴培養(yǎng)制作類胚體(EB，Hua等，2009)，3天后體視顯微鏡下檢查類胚體形成情況，山羊雄性生殖干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)形成的類胚體(EB)，如圖3Α 所示；收集ΕΒ，培養(yǎng)在0. 1 %明膠貼附的48空培養(yǎng)板上(培養(yǎng)基為去除bFGF和LIF的山羊雄性生殖干細(xì)胞分離液，即以DMEM高糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加體積分?jǐn)?shù)20%的胎牛血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、lmmol/L丙酮酸鈉、0. lmmol/L β -巰基乙醇、0. lmmol/L非必需氨基酸、100IU/ml青霉素和lOOmg/mL鏈霉素)，1 3周檢查EB脫落出的細(xì)胞類型；分離克隆的山羊雄性生殖干細(xì)胞具有三胚層的分化潛能，能夠分化形成EB(圖3A 所示)、神經(jīng)細(xì)胞(圖3B、C所示)、心肌細(xì)胞(圖3D、E、F所示)、脂肪樣細(xì)胞(圖3G所示， 油紅0陽性)和精子樣細(xì)胞(圖3H、I所示)；圖3J、K、L分別為分化細(xì)胞呈精子及生殖細(xì)胞特異性標(biāo)記VASA(圖3J) ,FE-Jl (圖3K)和EMAl (圖3L)，表明分離克隆的山羊雄性生殖干細(xì)胞具有分化為精子樣的潛能(Toyooka等，2003 ；Hua等，2009)，這對于山羊優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的篩選研究尤其重要。C、對于分離得到的山羊雄性生殖干細(xì)胞，其體外離體培養(yǎng)方法為1)有飼養(yǎng)層培養(yǎng)將山羊雄性生殖干細(xì)胞接種到MEF飼養(yǎng)層上(即小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層，用懷孕12-16天的昆白小鼠胚胎成纖維細(xì)胞經(jīng)10 μ g/mL絲裂霉素處理2_3小時，以50000個 /cm2的密度鋪附在經(jīng)0. 1 %明膠處理的塑料培養(yǎng)板上)，培養(yǎng)液以DMEM高糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括以下組分體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清(FBQ、體積分?jǐn)?shù)10%的血清替代品 (KSR，Invitrogen)、2mM 谷氨酰胺、0. ImM β -巰基乙醇、100IU/ml 青霉素、100mg/mL 鏈霉素、
非必需氨基酸(NEAA)、1000IU/ml白血病抑制因子(LIF)、5 lOng/ml堿性成纖維生長因子(bFGF)、1% ITS (胰島素+轉(zhuǎn)鐵蛋白+亞硒酸鈉，Sigma公司)；培養(yǎng)2天更換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞生長3 7天后，開始出現(xiàn)的較典型的致密生殖干細(xì)胞集落，如圖IB所示。2)無飼養(yǎng)層培養(yǎng)或者將山羊雄性生殖干細(xì)胞接種到Matrigel (BD公司)4°C包被1小時的塑料培養(yǎng)皿無飼養(yǎng)層培養(yǎng)，培養(yǎng)液為人胚胎干細(xì)胞無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)液(mTeSR培養(yǎng)液，Stem cells 公司)；培養(yǎng)2天更換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞生長3 7天后，開始出現(xiàn)的較典型的致密生殖干細(xì)胞集落，如圖4A所示的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的山羊雄性生殖干細(xì)胞集落，圖4B無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的山羊雄性生殖干細(xì)胞集落免疫染色呈AP陽性。
權(quán)利要求
1. 一種山羊雄性生殖干細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征在于，將山羊雄性生殖干細(xì)胞接種到MEF飼養(yǎng)層上，培養(yǎng)液以DMEM高糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括以下組分體積分?jǐn)?shù) 10%的胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)10%的血清替代品、2mM谷氨酰胺、0. ΙπιΜβ -巰基乙醇、100IU/ ml青霉素、100mg/mL鏈霉素、質(zhì)量分?jǐn)?shù)的非必需氨基酸、1000IU/ml白血病抑制因子、 5 lOng/ml堿性成纖維生長因子、質(zhì)量分?jǐn)?shù)的ITS ；2 3天更換一次培養(yǎng)液；或?qū)⑸窖蛐坌陨掣杉?xì)胞接種到Matrigel基質(zhì)膜4°C包被1小時的塑料培養(yǎng)皿無飼養(yǎng)層培養(yǎng)，培養(yǎng)液為人胚胎干細(xì)胞無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)液，2天更換一次培養(yǎng)液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種山羊雄性生殖干細(xì)胞的體外分離及培養(yǎng)方法，從雄性山羊的睪丸的曲細(xì)精管得到精原細(xì)胞，山羊雄性生殖干細(xì)胞的分離純化方法采用0.2％明膠和Matrigel差速貼壁結(jié)合克隆法，將未貼壁的山羊雄性生殖干細(xì)胞與貼壁培養(yǎng)的其他細(xì)胞區(qū)分、分離。分離到的山羊雄性生殖干細(xì)胞的培養(yǎng)為MEF有飼養(yǎng)層培養(yǎng)或者無飼養(yǎng)層培養(yǎng)。分離到的山羊雄性生殖干細(xì)胞具有ES細(xì)胞特性和向神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞和精子樣細(xì)胞的分化潛能。
文檔編號C12N5/071GK102154195SQ201010600520
公開日2011年8月17日 申請日期2009年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月4日
發(fā)明者華進(jìn)聯(lián), 朱海鯨 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)