專利名稱：一種人工核酸水解酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人工核酸水解酶，本發(fā)明還涉及該 人工核酸水解酶的制備方法。
背景技術(shù)：
在生理和非酶催化條件下，核酸中的磷酸二酯鍵是相當(dāng)穩(wěn)定的?，F(xiàn)在廣泛使用的 限制性內(nèi)切酶識別位點一般為少數(shù)幾個核苷酸，而且只能在特定位點斷裂核酸，其使用受 到一定限制?；瘜W(xué)合成的DNA/RNA定位斷裂化合物是國際上發(fā)展起來的水解工具，它們能 有效進攻和水解磷酸二酯鍵并生成5’ -，3’ -寡核苷磷酸。人工核酸酶能夠有效清除細菌和 病毒等致病微生物的污染；另外在現(xiàn)代分子生物學(xué)如反義核酸、基因沉默和RNA干擾等技 術(shù)中有非常重要的應(yīng)用價值。人工核酸水解酶是化學(xué)合成的一類過渡金屬化合物，通常情況下為銅、鐵、鈷、鎳、 鋅、鈰、鑭系金屬配合物?，F(xiàn)有的人工核酸水解酶存在以下的不足首先配合物金屬中心 的配位數(shù)高、空間位阻大，它們與核酸結(jié)合的親和力較弱，通常只能水解分子量小的寡核苷 酸；其次配合物的溶解性差，導(dǎo)致了對核酸的催化水解反應(yīng)的速率慢、時間長，同時水解反 應(yīng)效率也低(通常不大于36%)；另外現(xiàn)有的核酸水解反應(yīng)通過氧化型的途徑進行，反應(yīng)過程 復(fù)雜。人工合成的金屬配合物在體外催化核酸水解時，在反應(yīng)體系中需要添加氧化物，形成 了大量的自由基；現(xiàn)有的水解技術(shù)需要的條件十分苛刻，通常在加熱、紫外線照射、并有強 酸介質(zhì)參與下完成；最后，因為現(xiàn)有金屬配合物缺乏核酸的選擇性識別因子，通常存在選擇 性低、特異性差的缺點，與核酸作用時幾乎所有的磷酸二酯鍵均發(fā)生斷裂。近年來的研究熱點轉(zhuǎn)向水解型核酸的斷裂。這種途徑能夠極大地提高核酸的降解 速率，其速率常數(shù)可增加IO17倍；同時反應(yīng)條件溫和，在模擬生理條件下(pH 7.0，37 ° C) 即可實現(xiàn)反應(yīng)。在水解型的途徑中，對核酸酶的設(shè)計尤其關(guān)注結(jié)合位點和水解中心的選擇 性。核酸水解酶應(yīng)該同時具備以下三個結(jié)構(gòu)組件水解中心如金屬配合物，生物連接和靶向 識別基團。然而，這類人工核酸水解酶的分子設(shè)計仍然面臨極大的挑戰(zhàn)。在研究工作中，很 難得到同時滿足以上結(jié)構(gòu)組件的金屬配合物。利用水解型人工核酸切割酶的靶向識別和生 物連接基團，按照特定的序列選擇性連接到核酸的高級結(jié)構(gòu)區(qū)域，金屬配合物進一步攻擊 并水解附近的磷酸二酯鍵。不同的核酸堿基序列編碼特定的氨基酸或短肽，依據(jù)天然的編 碼特性，在配合物中設(shè)計氨基酸或短肽基團可以提高對核酸的靶向識別功能。另一方面，金 屬配合物的氨基酸或短肽基團可以增加對核酸的生物適應(yīng)性、減小毒副作用，更好地應(yīng)用 在分子生物學(xué)技術(shù)中。此外，由于核酸中的η電子插入是常見的有效連接方式，因此通過 引入含氮原子的共軛堿(如大環(huán)、并環(huán)的咪唑、鄰二氮雜菲、哌嗪及其含雜氮原子的內(nèi)酯)基 團可以有效提高對核酸的連接功能。目前，具備以上功能要素的金屬配合物不易通過化學(xué) 手段合成，相關(guān)的研究報道非常少。金屬配合物的物化特性決定了核酸水解酶的活力。溶解度和相對分子量是人工核 酸酶高效利用的制約因素。人工核酸酶的溶解度小，在溶液介質(zhì)中容易合成并分離到純化產(chǎn)品。然而溶解度小，金屬配合物對水溶性核酸的親和力通常也小，導(dǎo)致水解酶的活力不 高。與此相反，金屬配合物的溶解度大，在溶液介質(zhì)中不易得到合成產(chǎn)物。通過現(xiàn)有的分離、 提純手段如揮發(fā)法、擴散法等較難達到純化目的。通常情況下，金屬配合物的收率也很低。 此外，相對分子量大不利于金屬配合物對核酸進行有效的連接?，F(xiàn)有的研究工作仍未解決 人工核酸酶的溶解度、分子大小和活力之間的制約關(guān)系。在核酸酶的應(yīng)用技術(shù)中，通過化學(xué)、儀器分析方法檢測斷裂產(chǎn)物。光吸收和電化學(xué) 測定、粘度和凝膠電泳分析是常采用的分析方法。例如，測定核酸水解前后的光吸收(紫外 和熒光)強度的變化只能間接表征斷裂碎片。在核酸水解的過程中，酶催化劑與反應(yīng)介質(zhì) 不能夠?qū)崿F(xiàn)較好地分離，金屬配合物的η電子連接基團會對核酸及其水解產(chǎn)物的光吸收 強度產(chǎn)生很大的干擾。因此，該方法在實際應(yīng)用中具有很大的局限性。采用凝膠電泳檢測 核酸斷裂碎片，實驗步驟繁瑣、費時，很難在金屬配合物催化水解核酸的反應(yīng)中實現(xiàn)動態(tài)監(jiān) 測。目前，對于核酸水解產(chǎn)物的檢測，仍然缺乏直觀、快捷和簡便的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是根據(jù)現(xiàn)有人工核酸酶的溶解度、分子結(jié)構(gòu)、大小和 活力之間的制約關(guān)系，提供了一種人工核酸水解酶及其制備方法。在水相中通過一步化學(xué)反應(yīng)由氯化銅(或氫氧化銅)、甘氨酸(或縮甘氨酸)和π電 子基團合成水溶性的功能金屬配合物，所得產(chǎn)物為平面或四方錐構(gòu)型，對核酸有很強的插 入和水解能力，同時具有很強的序列選擇性和連接能力，利用混合溶劑揮發(fā)法，加快產(chǎn)物的 結(jié)晶效率，提高純度和收率。在模擬生理條件下(ρΗ 7. 0，37 ° C)，利用合成的銅配合物實現(xiàn)酵母轉(zhuǎn)錄 RNA (tRNA)的快速、高效切割。反應(yīng)為水解型途徑，序列選擇性的水解產(chǎn)物約為8-12個寡 核苷酸碎片、切割效率大于90%，能有效地應(yīng)用在致病性微生物的清除以及現(xiàn)代分子生物學(xué) 的技術(shù)中。通過現(xiàn)代分析儀器，建立一種核酸水解產(chǎn)物的快速、簡便的動力學(xué)檢測手段。使用 毛細管電泳方法，能實現(xiàn)水解產(chǎn)物的及時、動態(tài)的檢測，獲得定性、定量的分析結(jié)果；利用原 子力顯微掃描方法能直觀觀察并分析切割碎片的形貌和大小。人工核酸水解酶，包括人工核酸水解酶I甘氨酸銅鄰二氮雜菲，分子式 C14H19Cl1Cu1N3O6,分子量 424. 32，單元池參數(shù) a 7.0100 (14)、b 12.304 (3)、c 20.879 (5)、b 104.31(3)，空間群P21/c ；人工核酸水解酶II，甘氨酰甘氨酸銅1-甲基咪唑， 分子式 C8H13Cu1N4O4,分子量四2·76，單元池參數(shù) a 7. 0981 (14)、b 8. 2360 (16), c 11. 257(2) ,b 88. 99 (3)，空間群 P-1。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的
人工核酸水解酶的制備方法，包括以下步驟
(1)制備人工核酸水解酶I將甘氨酸、1，10-鄰二氮雜菲和氯化銅按摩爾比1 1 1在 水相中攪拌混合，在C條件下反應(yīng)30分鐘，冷卻至室溫后過濾；
(2)制備人工核酸水解酶II將甘氨酰甘氨酸、1-甲基咪唑和新制的氫氧化銅按摩爾 比1 1 1攪拌混合在水相中，加熱到55° C后反應(yīng)30分鐘，冷卻后過濾；
(3)分別將步驟(1)和步驟(2)所制得的濾液按體積比1:3與N，N-二甲基甲酰胺)
4混合后，溶液出現(xiàn)混濁現(xiàn)象，然后逐滴滴加水后轉(zhuǎn)為透明溶液，再次滴加3-5滴水后靜置揮 發(fā)，其中步驟(1)產(chǎn)物靜置揮發(fā)7天后得到紫色單晶分人工核酸水解酶I，甘氨酸銅鄰二 氮雜菲，分子式 C14H19Cl1Cu1N3O6,分子量 424. 32，單元池參數(shù) a 7.0100 (14)、b 12.304 (3)、c 20.879 (5)、b 104.31(3)，空間群P21/c ；步驟(2)產(chǎn)物靜置揮發(fā)10天后得到 紫色單晶人工核酸水解酶II，甘氨酰甘氨酸銅1-甲基咪唑，分子式C8H13Cu1N4O4,分子量 292.76，單元池參數(shù) a 7.0981 (14)、b 8.2360 (16)、c 11. 257(2), b 88.99 (3)，空間 群 P-I。步驟(1)所述的氯化銅可以用氫氧化銅代替。所述的甘氨酸可以用縮甘氨酸代替。步驟(2)所述的氫氧化銅可以用氯化銅代替。tRNA水解在tRNA儲備液中，按1. 0 mg tRNA: 1. 0 mmol :1. Ommol配合物比例分 別滴加本發(fā)明所得到的人工核酸水解酶I和人工核酸水解酶II，在攪拌條件下，于4 ° C 下反應(yīng)36小時，反應(yīng)時通入高純氬氣，然后滴加乙醇停止反應(yīng)，復(fù)合物沉淀過濾、乙醇洗滌 后低溫真空干燥，準確稱量一定質(zhì)量復(fù)合物，配成1.0 mg/ml磷酸緩沖體系，在37° C條件 下進行水解，記錄反應(yīng)時間，定期取樣進行毛細管電泳分析，反應(yīng)完畢后，取樣進行原子力 顯微掃描測定。在線檢測和原子力顯微掃描高效毛細管電泳分析在20° C下進行，使用量程 為+30kV直流高壓電源，在毛細管進樣的一端供給+15kV的電極電位，根據(jù)荷質(zhì)比大小在 不同的時間間隔流出毛細管另外一端。通過紫外檢測器跟蹤流出組分。樣品采用電進 樣方法注入毛細管柱。依據(jù)停留時間和流出峰面積對核酸切割碎片分別進行定性、定量 分析；核酸切割產(chǎn)物的原子力顯微掃描的頻率為1-3 Hz0測定采用敲擊模式完成，標準 探針為RTESP 7 (Veeco, USA)，平均共振頻率九=273. 77 kHz。制樣基片采用綠云母片 (Ashville-Schoonmaker Mica, Mewport New, VA, USA)。測定在 20 ° C 和相對濕度低于 55 %條件下進行。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
(1)本發(fā)明所得到的配合物中心銅分別采用立體四方錐和平面四邊形構(gòu)型，如圖1和 圖2所示，賦有tRNA靶向識別(甘氨酸和甘氨腺甘氨酸)和生物連接(鄰二氮雜菲和1-甲 基咪唑)基團，對核酸具有很強的結(jié)合常數(shù)，分別為2. 06X 105和LMXlO5 M—1，這些結(jié)合 常數(shù)遠大于氧化型RNA水解酶的結(jié)合平衡常數(shù)(通常為XlO3 Μ"1)；
(2)在溫和實驗條件下，本發(fā)明所制得的銅配合物能夠?qū)崿F(xiàn)對核酸有效的催化切割， tRNA的水解效率分別為97. 0% (76小時，見圖3)和90% (119小時，見圖4)，因此它們?yōu)閮?yōu) 良的人工核酸水解酶；
(3)在線檢測和顯微掃描技術(shù)顯示，tRNA經(jīng)本發(fā)明所制得的銅配合物催化水解后，毛細 管電泳分析結(jié)果，分別見圖5中d曲線和圖6中f曲線，顯示主要組分為低分子量的寡核苷 磷酸，原子力顯微掃描結(jié)果顯示，水解前的tRNA為連接螺旋構(gòu)型，見圖7 ；水解后切割產(chǎn)物 顯示首尾間隔的碎片結(jié)構(gòu)，分別見圖8和圖9，碎片約為8-12個核苷磷酸寡聚物，屬序列選 擇性的切割。


圖1甘氨酸銅鄰二氮雜菲的分子結(jié)構(gòu)；
圖2甘氨酰甘氨酸銅1-甲基咪唑的分子結(jié)構(gòu)； 圖3甘氨酸銅鄰二氮雜菲的催化水解效率； 圖4甘氨酰甘氨酸銅1-甲基咪唑的催化水解效率；
圖5 tRNA切割反應(yīng)的毛細管電泳分析結(jié)果(催化劑甘氨酸銅鄰二氮雜菲，a 0小時， b 24小時，c 48小時和d 72小時水解)；
圖6 tRNA切割反應(yīng)的毛細管電泳結(jié)果(催化劑甘氨酰甘氨酸銅1-甲基咪唑，a 0小 時，b 19小時，c 45小時，d 79小時，e 108小時和f 129小時水解)； 圖7 tRNA原子力顯微掃描圖片；
圖8 tRNA切割碎片原子力顯微掃描圖片(催化劑甘氨酸銅鄰二氮雜菲)； 圖9 tRNA切割碎片原子力顯微掃描圖片(催化劑甘氨酰甘氨酸銅1-甲基咪唑)。
具體實施例方式人工核酸水解酶的制備方法，包括以下步驟
(1)制備人工核酸水解酶I將甘氨酸(或者縮甘氨酸)、1，10-鄰二氮雜菲和氯化銅(或 者氫氧化銅)按摩爾比1:1:1在水相中攪拌混合，在55° C條件下反應(yīng)30分鐘，冷卻至室 溫后過濾；
(2)制備人工核酸水解酶II將甘氨酰甘氨酸、1-甲基咪唑和新制的氫氧化銅(或者氯 化銅)按摩爾比1 1 1攪拌混合在水相中，加熱到55° C后反應(yīng)30分鐘，冷卻后過濾；
(3)分別將步驟(1)和步驟(2)所制得的濾液按體積比1:3與N，N-二甲基甲酰胺) 混合后，溶液出現(xiàn)混濁現(xiàn)象，然后逐滴滴加水后轉(zhuǎn)為透明溶液，再次滴加3-5滴水后靜置揮 發(fā)，其中步驟(1)產(chǎn)物靜置揮發(fā)7天后得到紫色單晶分人工核酸水解酶I，甘氨酸銅鄰二氮 雜菲，子式 C14H19Cl1Cu1N3O6,分子量 424. 32，單元池參數(shù) a 7. 0100 (14)、b 12.304 (3)、 c 20.879 (5)、b 104.31(3)，空間群P21/c ；步驟(2)產(chǎn)物靜置揮發(fā)10天后得到紫色單晶 人工核酸水解酶II，甘氨酰甘氨酸銅1-甲基咪唑，分子式C8H13Cu1N4O4,分子量四2. 76，單 元池參數(shù) a 7.0981 (14)、b 8.2360 (16), c 11. 257 (2), b 88.99 (3)，空間群 P-1。人工核酸水解酶I 名稱甘氨酸銅鄰二氮雜菲，分子式C14H19Cl1Cu1N3O6,分子 量 424. 32，單元池參數(shù) a 7.0100 (14)、b 12.304 (3)、c 20.879 (5)、b 104.31(3)， 空間群P21/c，晶系單斜；人工核酸水解酶1為紫色晶體，在水中的溶解度最大 (64mg/100ml)，可溶于甲醇、乙醇和丙酮等極性溶劑。晶體學(xué)數(shù)據(jù)和結(jié)果
選取尺寸為0.35 mmXO. 28 mmXO. 20 mm深藍色長方形單晶，在室溫下將其置于 Rigaku Raxis-IV X-射線單晶衍射儀上，使用經(jīng)石墨單色器單色化了的Mo-K3射線Q= 0. 071073 nm)，以ω /2 0掃描方式在1. 94 ° < 0 <26. 96 °范圍內(nèi)共收集衍射點7588個，獨 立衍射點3503個OPint= 0. 0313)，其中，可觀測點3302個[/>2 σ (I)J0用于晶體結(jié)構(gòu)解 析的全部強度數(shù)據(jù)經(jīng)Zp因子及吸收校正。收集的數(shù)據(jù)實用軟件SAINT來進行還原，吸收系 數(shù)通過SADABS軟件來校正。全部氫原子均由差值Rmrier合成得到。晶體結(jié)構(gòu)采用直接 法使用SHELXTL軟件采用直接法解出，使用全矩陣最小二乘法對非氫原子坐標和溫度因子進行修正，氫原子則通過理論計算加入。V = 1744.8(6) A3, Z = A, Dc= 1.482 mg ·πΓ3，μ = 1.411 mnT1，尸(000) = 804， 結(jié)構(gòu)因子 W = 0.0890，wR= 0.2254，其中 r = l/{o2if) + (0· 0837/7) 2+5· 7772P]，P = if + 2^c2)/3,最佳吻合因子S = 1.290。差值Rmrier圖中殘余最高電子密度峰Pmax= 1.420 e - Α"3,最低為Pmin= -0.747 e · A_3。原子散射因子和反常散射系數(shù)取自國際晶 體學(xué)表。
表1-1.氫鍵和C-H…/7分子間相互作用*
D-H---ASymmetryD--A(A)BD-H...A(° )Ν(3)-Η(3Α)···0(2)-1/2-χ, 1/2+y, 1/2-ζ3. 1167136. 64N (3)-H(3Β)…O(IW)Ι/2-j-, 1/2+j, 1/2-ζ3. 0550167.17C(2)-H(2)...0(3W)-l/2+jr, 1/2-7，1/2+ζ3. 4314166. 63C(3)-H(3)...0(2)l/2+jr, 1/2-7，1/2+ζ3. 3838160. 41C(9)-H(9)... Cl(I)1-ζ, 1-7，1-Z3. 5551142. 79C (9)-H (9)…Cg (2)1—ζ, 1—7，ι—ζ3. 61996. 19
*Cg (2) Cu(I) -N(I) -C (5) -C (6) -N(2) 表1-2.晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)
EmpiricalformulaC14H19Cl1Cu1N3O6Formulaweight424. 32Temperature566 (2) KWavelength0. 71073ACrystalsystem, spacegroupMonoclinic, P21/cUnitcelldimensionsa=l. OlOO(H)A a=90°b=\2. 304(3)A 辦=104.31(3)°c=20. 879(5)A ^=90°Volume1744. 8 (6) A3Ζ, Calculateddensity4，1. 482Mg/m3Absorptioncoefficient1. 411 mnf1,(000)804θ rangefordatacolIection1.94to26. 96°Limitingindices-8 彡 h 彡 8，-12 彡 k 彡 15, -22 ^ 1 ^ 25RefIectionscollected/unique7588/3503[R(int)=0. 0313]RefinementmethodFull-matrixleast-squareson/^Data/restraints/parameters3503/0/217Goodness-of-f iton/^1. 290FinaLWndices [/>2 σ (/)]Rl=O.0890, wR2=0. 2254"indices(alldata)Rl=O.0937, wR2=0. 2285Largestdiff. peakandhole1. 420and-0. 747e. ^3
表1-3.非氫原子的最終坐標參數(shù)(X104)和等效溫度因子(AX IO3)
AtomXrZ"(eq)Cu(I)4377(1)9181(1)1648(1)38(1)C(I)3404(10)7698(6)473(3)44(2)C (2)2759(11)7489(7)-193(4)51(2)C (3)2208(10)8347(7)-596(3)46 (2)C (4)2256(9)9412(6)-352(3)38(1)C (5)2931(8)9542(5)324(3)32(1)C (6)3009(8)10601(5)613(3)34(1)C (7)2435(9)11517(6)233(3)39(1)C (8)1791(10)11362(7)-459(3)49(2)
權(quán)利要求
1.一種人工核酸水解酶，其特征是包括人工核酸水解酶I，名稱為甘氨酸銅鄰二氮雜 菲，分子式 C14H19Cl1Cu1N3O6,分子量 424. 32，單元池參數(shù) a 7. 0100 (14)、b 12.304 (3)、 c 20.879 (5)、b 104.31(3)，空間群P21/c ；人工核酸水解酶II，名稱為甘氨酰甘氨酸銅 1-甲基咪唑，分子式C8H13Cu1N4O4,分子量四2. 76，單元池參數(shù)a 7. 0981 (14)、b 8. 2360 (16)、c 11. 257(2) ,b 88.99 (3)，空間群 P-1。
2.權(quán)利要求1所述的人工核酸水解酶的制備方法，其特征是包括以下步驟(1)將甘氨酸、1，10-鄰二氮雜菲和氯化銅按摩爾比1 1 1在水相中攪拌混合，在55° C 條件下反應(yīng)30分鐘，冷卻至室溫后過濾；(2)將甘氨酰甘氨酸、1-甲基咪唑和新制的氫氧化銅按摩爾比1:1:1攪拌混合在水相 中，加熱到C后反應(yīng)30分鐘，冷卻后過濾；(3)分別將步驟(1)和步驟(2)所制得的濾液按體積比1:3與N，N-二甲基甲酰胺) 混合后，溶液出現(xiàn)混濁現(xiàn)象，然后逐滴滴加水后轉(zhuǎn)為透明溶液，再次滴加3-5滴水后靜置 揮發(fā)，其中步驟(1)產(chǎn)物靜置揮發(fā)7天后得到紫色單晶，分子式C14H19Cl1Cu1N3O6,分子量 424.32，單元池參數(shù) a 7.0100 (14)、b 12.304 (3)、c 20.879 (5)、b 104.31(3)，空間群 P21/c ；步驟(2)產(chǎn)物靜置揮發(fā)10天后得到紫色單晶，分子式C8H13Cu1N4O4,分子量四2. 76， 單元池參數(shù) a 7.0981 (14)、b 8.2360 (16), c 11. 257 (2), b 88.99 (3)，空間群 P-1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的的人工核酸水解酶的制備方法，其特征是步驟(1)所述的氯 化銅可以用氫氧化銅代替。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的的人工核酸水解酶的制備方法，其特征是所述的甘氨酸 可以用縮甘氨酸代替。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的的人工核酸水解酶的制備方法，其特征是步驟(2)所述 的氫氧化銅可以用氯化銅代替。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人工核酸水解酶及其制備方法，屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，目的是根據(jù)現(xiàn)有人工核酸酶的溶解度、分子結(jié)構(gòu)、大小和活力之間的制約關(guān)系，提供了一種高效的人工核酸水解酶及其制備方法。是在水相中通過一步化學(xué)反應(yīng)由氯化銅、甘氨酸和π電子基團合成水溶性的功能金屬配合物，所得產(chǎn)物為平面或四方錐構(gòu)型，對核酸有很強的插入和水解能力，同時具有很強的序列選擇性和連接能力，利用混合溶劑揮發(fā)法，加快產(chǎn)物的結(jié)晶效率，提高純度和收率。本發(fā)明所得到的配合物中心銅分別采用立體四方錐和平面四邊形構(gòu)型，賦有tRNA靶向識別和生物連接基團，對核酸具有很強的結(jié)合常數(shù)；水解率高。
文檔編號C12N15/55GK102120992SQ20101060115
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者喬元彪, 吳玉花, 楊衛(wèi)民 申請人:喬元彪, 吳玉花, 楊衛(wèi)民