專利名稱：一種重組類人膠原蛋白及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組類人膠原蛋白及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白(collagen)是廣泛分布于人體結(jié)締組織的一組蛋白質(zhì)家族，也是體內(nèi) 含量最多的一種蛋白質(zhì)，約占蛋白質(zhì)總量的25% 33%，其對維護(hù)細(xì)胞、組織、器官的正常 生理功能和損傷修復(fù)有重要作用。膠原蛋白作為天然的生物資源，具有合成高分子材料無 法比擬的生物相容性和生物可降解性，可廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、化妝品等工業(yè)中，但是天然膠原 蛋白不能溶于水，而且從動物體內(nèi)提取的膠原蛋白為各種分子量從大到小不等的膠原蛋白 肽的混合體，性質(zhì)非常復(fù)雜，難于進(jìn)行進(jìn)一步的加工，限制了其作為生物材料在組織工程等 領(lǐng)域的應(yīng)用。而且，動物源的膠原蛋白很難避免有病毒感染的嫌疑，同時(shí)應(yīng)用到人類還會帶 來免疫排斥等副作用。為了獲得人源的膠原蛋白，有研究者采用人胎盤作為原料來進(jìn)行提 取，但是這種方式不僅受原料供應(yīng)的限制更要面臨倫理道德的指責(zé)。當(dāng)前市場銷售的膠原蛋白類產(chǎn)品或取自豬皮、牛皮等大動物組織或取自魚類的皮 膚組織。由于動物組織提取物經(jīng)常有病毒感染的隱患，此類產(chǎn)品僅能作為用于化妝品以及 保健品的原料使用，限制了其作為醫(yī)藥用品等高端產(chǎn)品方面的應(yīng)用。生產(chǎn)膠原蛋白傳統(tǒng)的也是目前最主要的方法是利用酸、堿法處理動物來源的組織 中提取膠原蛋白，另外還有酶解法提取膠原蛋白，這些方法具有較高的回收率，但是這些方 法制取的膠原蛋白水溶性差、難分離到純品，且在臨床上表現(xiàn)出排異反應(yīng)，使其作為生物醫(yī) 學(xué)材料或藥物載體等方面的應(yīng)用受到了很大限制。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因重組技術(shù)，可以在動物、植物和 微生物表達(dá)體系獲得重組人膠原蛋白，解決了傳統(tǒng)提取方法存在的病毒隱患等缺點(diǎn)，同時(shí) 也改善了膠原蛋白的親水性、免疫排異性等。國內(nèi)外一些研究機(jī)構(gòu)及生物公司相繼投入研 發(fā)研究重組膠原蛋白，如利用轉(zhuǎn)基因的方法，培育含類人膠原蛋白的小白鼠、通過轉(zhuǎn)基因微 量注射得到含重組類人膠原奶汁的哺乳動物，但通過哺乳類或昆蟲細(xì)胞株生產(chǎn)的成本極 高、生產(chǎn)周期長。我國西北大學(xué)的范代娣等采用PCR擴(kuò)增得到數(shù)段人膠原蛋白基因片段，接 著進(jìn)行拼接重復(fù)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并通過高密度發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)類人膠原蛋白，獲得高表達(dá)的 重組類人膠原蛋白。2004年，東京農(nóng)業(yè)科技大學(xué)的Yao J等對膠原蛋白細(xì)胞附著作用和自 身交聯(lián)螺旋相關(guān)序列作了研究，設(shè)計(jì)了長度為240個(gè)氨基酸的類人膠原蛋白，并在大腸桿 菌中得到了表達(dá)。但是細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)容易造成熱原殘余，致使表達(dá)產(chǎn)物不純，難以應(yīng)用于臨 床，而且目的蛋白通常以包涵體形式表達(dá)，產(chǎn)物純化過程復(fù)雜，另外原核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后 加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低等缺點(diǎn)影響產(chǎn)品的品質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種表達(dá)量高， 水溶性好，其結(jié)構(gòu)和性能都優(yōu)于動物源膠原蛋白的重組類人膠原蛋白。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種重組類人膠原蛋白，其特征 在于，其序列如下AGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPL GIAGITGARGLAGPPGMPGP60
RGSPGPQGVK GESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTA GEPGRDGNPGSDGLPGRDGS120
PGGKGDRGEN GSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGP180
QGPRGDKGET GERGMGIKGHRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAEFGADGVAGPK240
GPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRP300
GPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGMGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPA360
GPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGARGERGFPGER420
GVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGDR480
GDAGPKGADGSPGKDGVRGLTGPIGPPGPAGAPGDKGESGPSGPAGPTGARGAPGDRGEP540
GPPGPAGFAGPPGADGQPGAKGEPGDAGAKGDAGPPGPAGPAGPPGPIGNVGAPGAKGAR600
GSAGPPGATGFPGMGRVGPPGPSGNAGPPGPPGPAGKEGGKGPRGETGPAGRPGEVGPP660
GPPGPAGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQ720
GPSGASGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGAEGSPGRDGSPGAKGDRGETGPAGPP780
GAPGAPGAPGPVGPAGKSGDRGETGPAGPAGPVGPVGARGPAGPQGPRGDKGETGEQGD839
所述重組類人膠原蛋白的結(jié)構(gòu)為單鏈、單螺旋結(jié)構(gòu)，其氨基酸為839個(gè)，其中
1-241為III型肽段，242-839為I型肽段。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)該重組類人膠原蛋白的方法，其特征在于，該方法包括 以下步驟(1)畢赤酵母基因工程菌的構(gòu)建；(2)畢赤酵母基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)；(3)重組類人膠原蛋白的誘導(dǎo)和表達(dá)；(4)重組類人膠原蛋白的純化。上述步驟(1)中所述畢赤酵母基因工程菌的構(gòu)建如下a.將人體已知的I型和III型膠原蛋白基因螺旋區(qū)的一段基因分別抽提出來，然 后進(jìn)行縫合，重組DNA;b.選用畢赤酵母SMD1168株作為宿主細(xì)胞，將重組DNA轉(zhuǎn)入并整合到宿主細(xì)胞的 基因組中，篩選得到畢赤酵母基因工程菌(巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris C13)；該畢 赤酵母基因工程菌已于2010年12月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心(保藏中心地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵 政編碼100101)，保藏編號為CGMCC No. 4437。上述步驟O)中所述畢赤酵母基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)過程如下挑取畢赤酵母基 因工程菌單菌落，置于裝有30mL BMGY培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，于 30°C，250rpm 300rpm培養(yǎng)至0D600為2. 0 6. 0，室溫下1500g 3000g離心5min，收集菌體，用BMMY培 養(yǎng)基重懸菌體，使重懸后的菌體0D600為1. 0 ；將重懸菌體所得的菌液置于500mL的三角瓶 中，用四層紗布封口，于 30°C、250rpm 300rpm的搖床上繼續(xù)培養(yǎng)；每Mh向培養(yǎng) 基中添加無水甲醇，無水甲醇的添加量為培養(yǎng)基總體積的1%。上述步驟(4)所述重組類人膠原蛋白的純化過程為培養(yǎng)的畢赤酵母基因工程菌經(jīng)過離心分離后收集上清液，收集的上清液經(jīng)層析柱SlOO除去顏色物質(zhì)和腥味，再經(jīng)脫鹽 柱G75去掉多余的鹽分，脫鹽后超濾濃縮，收集蛋白冷凍干燥。上述的一種重組類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法，所述重組DNA的序列如下
GCGGGTAACACTGGTGCTCCTGGCAGCCCTGGAGTGTCTGGACCAAMGG TGATGCTGGC60
CMCCAGGAGAGMGGGATCGCCTGGTGCCCAGGGCCCACCAGGAGCTCC AGGCCCACTT120
GGGATTGCTGGGATCACTGGAGCACGGGGTCTTGCAGGACCACCAGGCAT GCCAGGTCCT180
AGGGGMGCCCTGGCCCTCAGGGTGTCMGGGTGAMGTGGGAAACCAGG AGCTAACGGT240
CTCAGTGGAGMCGTGGTCCCCCTGGACCCCAGGGTCTTCCTGGTCTGGCTGGTACAGCT300
GGTGAACCTGGAAGAGATGGAMCCCTGGATCAGATGGTCTTCCAGGCCGAGATGGATCT360
CCTGGTGGCAAGGGTGATCGTGGTGAAMTGGCTCTCCTGGTGCCCCTGGCGCTCCTGGT420
CATCCAGGCCCACCTGGTCCTGTCGGTCCAGCTGGAAAGAGTGGTGACAGAGGAGAAAGT480
GGCCCTGCTGGCCCTGCTGGTGCTCCCGGTCCTGCTGGTTCCCGAGGTGCTCCTGGTCCT540
CMGGCCCACGTGGTGACMAGGTGAAACAGGTGAACGTGGAGCTGCTGGCATCAMGGA600
CATCGAGGATTCCCTGGTMTCCAGGTGCCCCAGGTTCTCCAGGCCCTGCTGGTCAGCAG660
GGTGCMTCGGCAGTCCAGG ACCTGCAGAATTCGGCGCAGATGGTGTTGCTGGTCCCMG720
GGTCCCGCTGGTGAACGTGGTTCTCCTGGCCCTGCTGGCCCCAAAGGATCTCCTGGTGAA780
GCTGGTCGTCCCGGTGMGCTGGTCTGCCTGGTGCCAAGGGTCTGACTGGAAGCCCTGGC840
AGCCCTGGTCCTGATGGCMAACTGGCCCCCCTGGTCCCGCCGGTCMGATGGTCGCCCC900
GGACCCCCAGGCCCACCTGGTGCCCGTGGTCAGGCTGGTGTGATGGGATT CCCTGGACCT960
AMGGTGCTGCTGGAGAGCCCGGCAAGGCTGGAGAGCGAGGTGTTCCCGGACCCCCTGGC1020
GCTGTCGGTCCTGCTGGCMAGATGGAGAGGCTGGAGCTCAGGGACCCCCTGGCCCTGCT1080
GGTCCCGCTGGCGAGAGAGGTGAACMGGCCCTGCTGGCTCCCCCGGATTCCAGGGTCTC1140
CCTGGTCCTGCTGGTCCTCCAGGTGMGCAGGCAAACCTGGTGAACAGGGTGTTCCTGGA1200
GACCTTGGCGCCCCTGGCCCCTCTGGAGCAAGAGGCGAGAGAGGTTTCCCTGGCGAGCGT1260
GGTGTGCMGGTCCCCCTGGTCCTGCTGGTCCCCGAGGGGCCMCGGTGCTCCCGGCMC1320
GATGGTGCTAAGGGTGATGCTGGTGCCCCTGGAGCTCCCGGTAGCCAGGGCGCCCCTGGC1380
CTTCAGGGAATGCCTGGTGA ACGTGGTGCAGCTGGTCTTCCAGGGCCTMGGGTGACAGA1440
GGTGATGCTGGTCCCAMGGTGCTGATGGCTCTCCTGGCAMGATGGCGTCCGTGGTCTG1500
ACTGGCCCCATTGGTCCTCCTGGCCCTGCTGGTGCCCCTGGTGACAAGGGTGAMGTGGT1560
CCCAGCGGCCCTGCTGGTCCCACTGGAGCTCGTGGTGCCCCCGGAGACCGTGGTGAGCCT1620
GGTCCCCCCGGCCCTGCTGGCTTTGCTGGCCCCCCTGGTGCTGACGGCCA ACCTGGTGCT1680
AMGGCGMCCTGGTGATGCTGGTGCTAAAGGCGATGCTGGTCCCCCTGG CCCTGCCGGA1740
CCCGCTGGACCCCCTGGCCCCATTGGTMTGTTGGTGCTCCTGGAGCCM AGGTGCTCGC1800
GGCAGCGCTGGTCCCCCTGGTGCTACTGGTTTCCCTGGTGCTGCTGGCCG AGTCGGTCCT1860
CCTGGCCCCTCTGGAAATGCTGGACCCCCTGGCCCTCCTGGTCCTGCTGGCAAAGMGGC1920
GGCAAAGGTCCCCGTGGTGAGACTGGCCCTGCTGGACGTCCTGGTGMGTTGGTCCCCCT1980
GGTCCCCCTGGCCCTGCTGGCGAGAMGGATCCCCTGGTGCTGATGGTCCTGCTGGTGCT2040
CCTGGTACTCCCGGGCCTCAAGGTATTGCTGGACAGCGTGGTGTGGTCGGCCTGCCTGGT2100
CAGAGAGGAGAGAGAGGCTTCCCTGGTCTTCCTGGCCCCTCTGGTGMCCTGGCAMCAA2160
GGTCCCTCTG GAGCMGTGG TGAACGTGGT CCCCCTGGTC CCATGGGCCC CCCTGGATTG 2220GCTGGACCCC CTGGTGMTC TGGACGTGAG GGGGCTCCTG GTGCCGMGG TTCCCCTGGA 2280CGAGACGGTT CTCCTGGCGC CMGGGTGAC CGTGGTGAGA CCGGCCCCGC TGGACCCCCT 2340GGTGCTCCTG GTGCTCCTGG TGCCCCTGGC CCCGTTGGCC CTGCTGGCM GAGTGGTGAT 2400CGTGGTGAGA CTGGTCCTGC TGGTCCCGCC GGTCCTGTCG GCCCTGTTGG CGCCCGTGGC 2460CCCGCCGGAC CCCAAGGCCC CCGTGGTGAC MGGGTGAGA CAGGCGMCA GGGCGAC2517本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明采用畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)大規(guī)模 生產(chǎn)重組類人膠原蛋白，它與傳統(tǒng)的大腸桿菌表達(dá)體系相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明的表達(dá)載體利用醇氧化酶基因啟動子，細(xì)胞生長速度快，所以該表達(dá)系 統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白產(chǎn)量很高，其表達(dá)量比其它系統(tǒng)高10倍甚至100倍，這在表達(dá)量方面是 一大突破，在發(fā)酵罐中的表達(dá)量可達(dá)到5. Og/L，單個(gè)批次50升罐可生產(chǎn)粗蛋白150g左右， 粗蛋白純度在80 %以上，雜蛋白很少。2、本發(fā)明的培養(yǎng)基采用無機(jī)鹽，配制簡單、價(jià)格低廉。3、本發(fā)明的表達(dá)載體不是以游離的質(zhì)粒存在，而是整合在染色體上，構(gòu)建的菌株 十分穩(wěn)定。4、本發(fā)明的重組類人膠原蛋白具有良好的親水性及穩(wěn)定性，其氨基酸組成與天然 膠原蛋白氨基酸序列相應(yīng)部分100%相同，同天然膠原蛋白相比，具有相近的結(jié)構(gòu)和生物活 性，無需變性和復(fù)性，應(yīng)用于人體當(dāng)中不會造成免疫排斥，可以廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)用材料、 化妝品等領(lǐng)域。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。


圖1為本發(fā)明載體pPIC9K-C03al-C0lal構(gòu)建的路線圖譜。圖2為本發(fā)明菌落PCR鑒定重組畢赤酵母的電泳圖。圖3為本發(fā)明pPIC9K-C03al-C0lal重組畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)后的電泳圖。
具體實(shí)施例方式一種重組類人膠原蛋白，其序列(SEQ ID NO. 1)如下AGNTGAPGSP GVSGPKGDAG QPGEKGSPGA QGPPGAPGPL GIAGITGARGRGSPGPQGVK GESGKPGANG LSGERGPPGP QGLPGLAGTA GEPGRDGNPGPGGKGDRGEN GSPGAPGAPG HPGPPGPVGP AGKSGDRGES GPAGPAGAPGQGPRGDKGET GERGMGIKG HRGFPGNPGA PGSPGPAGQQ GAIGSPGPAEGPAGERGSPG PAGPKGSPGE AGRPGEAGLP GAKGLTGSPG SPGPDGKTGPGPPGPPGARG QAGVMGFPGP KGMGEPGKA GERGVPGPPG AVGPAGKDGEGPAGERGEQG PAGSPGFQGL PGPAGPPGEA GKPGEQGVPG DLGAPGPSGAGVQGPPGPAG PRGANGAPGN DGAKGDAGAP GAPGSQGAPG LQGMPGERGAGDAGPKGADG SPGKDGVRGL TGPIGPPGPA GAPGDKGESG PSGPAGPTGAGPPGPAGFAG PPGADGQPGA KGEPGDAGAK GDAGPPGPAG PAGPPGPIGNGSAGPPGATG FPGMGRVGP PGPSGNAGPP GPPGPAGKEG GKGPRGETGP
LAGPPGMPGP60SDGLPGRDGS120PAGSRGAPGP180FGADGVAGPK240PGPAGQDGRP300AGAQGPPGPA360RGERGFPGER420AGLPGPKGDR480RGAPGDRGEP540VGAPGAKGAR600AGRPGEVGPP660
GPPGPAGEKG SPGADGPAGA PGTPGPQGIA GQRGVVGLPG QRGERGFPGL PGPSGEPGKQ 720GPSGASGERG PPGPMGPPGL AGPPGESGRE GAPGAEGSPG RDGSPGAKGD RGETGPAGPP 780GAPGAPGAPG PVGPAGKSGD RGETGPAGPA GPVGPVGARG PAGPQGPRGD KGETGEQGD 839該重組類人膠原蛋白的結(jié)構(gòu)為單鏈、單螺旋結(jié)構(gòu)，其氨基酸為839個(gè)，其中1-241 為III型肽段，242-839為I型肽段。該重組類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法包括以畢赤酵母SMD1168為出發(fā)菌株，進(jìn)行畢赤酵母基因工程菌的構(gòu)建；畢赤酵母基 因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)；重組類人膠原蛋白的提純，獲得目的蛋白。
0103]所涉及的培養(yǎng)基組成分別為0104]YPD培養(yǎng)基0105]酵母浸出粉10g/L胰蛋白胨20g/L0106]葡萄糖20g/L。0107]BMGY培養(yǎng)基0108]酵母浸出粉10g/L胰蛋白胨20g/L0109]ρΗ6· 0磷酸鉀緩沖 賺 1OOmmo1/LYNB13. 4g/L0110]Biotin0. 2mg/L甘油10mL/L。0111]BMMY培養(yǎng)基0112]酵母浸出粉lOg/L胰蛋白胨20g/L0113]ρΗ6· 0磷酸鉀緩沖 賺 IOOmmo1/LYNB 13.lg/L0114]Biotin0. 2mg/L甲醇 IOmL/ZL。0115]一、畢赤酵母基因工程菌的構(gòu)建0116](一)、重組表達(dá)載體的構(gòu)建0117]從新生兒胎盤組織中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA ；根據(jù)GenBank已發(fā)表的人膠原
蛋白I型和III型基因序列，按照引物設(shè)計(jì)原則，利用PrimerPremier 5. 0和DNAMAN軟件， 設(shè)計(jì) col Ial 和 col3al 基因 PCR 擴(kuò)增引物 Fl (SEQ ID NO. 3), Rl (SEQ ID NO. 4)，F(xiàn)2 (SEQ ID NO. 5)、R2 (SEQ IDNO. 6)，引物序列分別為Fl :5，-CTGGCGCAGA TGGTGTTG-3，；Rl 5，-CCACGGTGAC CCTTTATGC-3，。F2 :5’ -GAATCTGTGA ATCATGCCCT AC-3’ ；R2 :5， -GAAGTCATAA TCTCATCGGT GTT—3，。將I型和III型膠原蛋白基因螺旋區(qū)部分?jǐn)U增出來并且在基因的兩頭用合適的 酶切位點(diǎn)做成接頭得到重組DNA，并縫合到畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K中獲得重組表達(dá)載體 pPIC9K-co3al-colal ；該重組 DNA 的序列(SEQID N0. 2)如下GCGGGTAACA CTGGTGCTCC TGGCAGCCCT GGAGTGTCTG GACCAAMGG TGATGCTGGC 60CMCCAGGAG AGMGGGATC GCCTGGTGCC CAGGGCCCAC CAGGAGCTCC AGGCCCACTT 120GGGATTGCTG GGATCACTGG AGCACGGGGT CTTGCAGGAC CACCAGGCAT GCCAGGTCCT 180AGGGGMGCC CTGGCCCTCA GGGTGTCMG GGTGAMGTG GGAAACCAGG AGCTAACGGT 240CTCAGTGGAG MCGTGGTCC CCCTGGACCC CAGGGTCTTC CTGGTCTGGC TGGTACAGCT 300GGTGAACCTG GAAGAGATGG AMCCCTGGA TCAGATGGTC TTCCAGGCCG AGATGGATCT 360
CCTGGTGGCAAGGGTGATCGTGGTGAAMTGGCTCTCCTGGTGCCCCTGGCGCTCCTGGT420
CATCCAGGCCCACCTGGTCCTGTCGGTCCAGCTGGAAAGAGTGGTGACAGAGGAGAAAGT480
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CMGGCCCACGTGGTGACMAGGTGAAACAGGTGAACGTGGAGCTGCTGGCATCAMGGA600
CATCGAGGATTCCCTGGTMTCCAGGTGCCCCAGGTTCTCCAGGCCCTGCTGGTCAGCAG660
GGTGCMTCGGCAGTCCAGG ACCTGCAGAATTCGGCGCAGATGGTGTTGCTGGTCCCMG720
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GCTGGTCGTCCCGGTGMGCTGGTCTGCCTGGTGCCAAGGGTCTGACTGGAAGCCCTGGC840
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GGACCCCCAGGCCCACCTGGTGCCCGTGGTCAGGCTGGTGTGATGGGATT CCCTGGACCT960
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GGTCCCGCTGGCGAGAGAGGTGAACMGGCCCTGCTGGCTCCCCCGGATTCCAGGGTCTC1140
CCTGGTCCTGCTGGTCCTCCAGGTGMGCAGGCAAACCTGGTGAACAGGGTGTTCCTGGA1200
GACCTTGGCGCCCCTGGCCCCTCTGGAGCAAGAGGCGAGAGAGGTTTCCCTGGCGAGCGT1260
GGTGTGCMGGTCCCCCTGGTCCTGCTGGTCCCCGAGGGGCCMCGGTGCTCCCGGCMC1320
GATGGTGCTAAGGGTGATGCTGGTGCCCCTGGAGCTCCCGGTAGCCAGGGCGCCCCTGGC1380
CTTCAGGGAATGCCTGGTGA ACGTGGTGCAGCTGGTCTTCCAGGGCCTMGGGTGACAGA1440
GGTGATGCTGGTCCCAMGGTGCTGATGGCTCTCCTGGCAMGATGGCGTCCGTGGTCTG1500
ACTGGCCCCATTGGTCCTCCTGGCCCTGCTGGTGCCCCTGGTGACAAGGGTGAMGTGGT1560
CCCAGCGGCCCTGCTGGTCCCACTGGAGCTCGTGGTGCCCCCGGAGACCGTGGTGAGCCT1620
GGTCCCCCCGGCCCTGCTGGCTTTGCTGGCCCCCCTGGTGCTGACGGCCA ACCTGGTGCT1680
AMGGCGMCCTGGTGATGCTGGTGCTAAAGGCGATGCTGGTCCCCCTGG CCCTGCCGGA1740
CCCGCTGGACCCCCTGGCCCCATTGGTMTGTTGGTGCTCCTGGAGCCM AGGTGCTCGC1800
GGCAGCGCTGGTCCCCCTGGTGCTACTGGTTTCCCTGGTGCTGCTGGCCG AGTCGGTCCT1860
CCTGGCCCCTCTGGAAATGCTGGACCCCCTGGCCCTCCTGGTCCTGCTGGCAAAGMGGC1920
GGCAAAGGTCCCCGTGGTGAGACTGGCCCTGCTGGACGTCCTGGTGMGTTGGTCCCCCT1980
GGTCCCCCTGGCCCTGCTGGCGAGAMGGATCCCCTGGTGCTGATGGTCCTGCTGGTGCT2040
CCTGGTACTCCCGGGCCTCAAGGTATTGCTGGACAGCGTGGTGTGGTCGGCCTGCCTGGT2100
CAGAGAGGAGAGAGAGGCTTCCCTGGTCTTCCTGGCCCCTCTGGTGMCCTGGCAMCAA2160
GGTCCCTCTGGAGCMGTGGTGAACGTGGTCCCCCTGGTCCCATGGGCCCCCCTGGATTG2220
GCTGGACCCCCTGGTGMTCTGGACGTGAGGGGGCTCCTGGTGCCGMGGTTCCCCTGGA2280
CGAGACGGTTCTCCTGGCGCCMGGGTGACCGTGGTGAGACCGGCCCCGCTGGACCCCCT2340
GGTGCTCCTGGTGCTCCTGGTGCCCCTGGCCCCGTTGGCCCTGCTGGCMGAGTGGTGAT2400
CGTGGTGAGACTGGTCCTGCTGGTCCCGCCGGTCCTGTCGGCCCTGTTGGCGCCCGTGGC2460
CCCGCCGGACCCCAAGGCCCCCGTGGTGACMGGGTGAGACAGGCGMCAGGGCGAC2517( 二)、大量制備重組質(zhì)粒 pPIC9K-co3al_colal將載體菌株在含有卡那霉素抗性的培養(yǎng)基上培養(yǎng)20個(gè)小時(shí)左右、8000r/min離心 10分鐘，去掉上清，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA。
(三)、pPIC9K-co3al_colal 質(zhì)粒的線性化取限制性內(nèi)切酶Sail 10 μ L，pPIC9K-co3al_colal 質(zhì)粒 20 μ g 左右，加入 100 μ L buffer H，加水補(bǔ)足到1000 μ L后混勻，37°C水浴消化5h，終止反應(yīng)前先取出5 μ L反應(yīng)液， 以0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測是否酶切完全，酶切完全后，用質(zhì)粒提取試劑盒對線性化質(zhì)粒 進(jìn)行質(zhì)粒提取。提取完成時(shí)，線性化質(zhì)粒的體積要在10 μ L以上，濃度為1. 0μ g/μ L以上。 用去離子水溶解，用于下一步的電轉(zhuǎn)化。(四)、轉(zhuǎn)畢赤酵母方法1.畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取畢赤酵母(SMD1168)單菌落，接種至含有5mL YPD培養(yǎng)基試管中，30°C， 250rpm 300rpm培養(yǎng)過夜；取50 μ L的培養(yǎng)物接種至含有50mL新鮮YPD培養(yǎng)基的300mL 三角瓶中，28°C 30°C，250rpm 300rpm培養(yǎng)過夜，至0D600值達(dá)到1. 1 1. 3 ；將細(xì)胞培 養(yǎng)物于4°C，1500g離心5min，用50mL的冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉淀重懸；重復(fù)離心之后按 照相同方法用20mL的冰預(yù)冷的lmol/L山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，離心，用0. 3mL的冰預(yù) 冷的lmol/L山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為0. 5mL,分裝為80 μ L —份，-70°C 保存。2.畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化將感受態(tài)細(xì)胞解凍并冰浴，將10 μ g左右的線性化DNA與80 μ L的畢赤酵母感受 態(tài)細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn)至0. 2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，在電壓為1. 5kV，電容為25 μ F，電阻為200 Ω 條件下電擊4msec IOmsec ；電擊完畢后，加入ImL冰預(yù)冷的lmol/L山梨醇溶液將菌體混 勻形成菌懸液，轉(zhuǎn)至1. 5mL離心管中；將菌懸液涂布于MD平板上，每100 μ L 200 μ L涂布 一塊平板，然后置于30°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。3.多拷貝插入重組子的篩選(1)在生長有轉(zhuǎn)化子的MD平板表面加入2mL滅菌雙蒸水，然后用無菌三角涂布器 在His+轉(zhuǎn)化子表面輕輕涂刮，并轉(zhuǎn)移到50mL離心管中；(2)向步驟(1)中所述離心管中加入20mL滅菌雙蒸水稀釋，混勻后測定0D600值 (10D600 = 5X 107cells/mL)；(3)取IO5個(gè)轉(zhuǎn)化子涂布于含有0. 5mg/mL G418的YPD平板上，倒置，30°C培養(yǎng) 72h 96h ；(4)在無菌96孔板中每孔加入200 μ L YPD液體培養(yǎng)基；(5)用接菌牙簽往步驟⑷中所述96孔板中分別接入步驟(3)中培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化 子，混勻，于30°C培養(yǎng)48h;(6)取一塊新的無菌96孔板，每孔加入190yL YPD液體培養(yǎng)基，然后在相應(yīng)孔中 加入10 μ L步驟(5)中96孔板所得的培養(yǎng)物，于30°C培養(yǎng)24h ；(7)再取一塊新的無菌96孔板，每孔加入190yL YPD液體培養(yǎng)基，在相應(yīng)孔中加 AlOyL步驟(6)中96孔板所得的培養(yǎng)物，于30°C培養(yǎng)24h ；(8)分別從步驟(7)中的96孔板中取出1 μ L培養(yǎng)液，點(diǎn)在含有1. Omg/mL和 4. 0mg/mL G418的YPD平板上，于30°C培養(yǎng)96h 120h，畢赤酵母SMD1168轉(zhuǎn)化子若能 在含越高濃度G418的培養(yǎng)基上生長，說明該轉(zhuǎn)化子含有越多拷貝的目的基因，即有多個(gè) pPIC9K-co3al-colal片斷轉(zhuǎn)化進(jìn)了畢赤酵母SMD1168并整合到畢赤酵母SMD1168的染色體上，經(jīng)過這一步篩選得到的高拷貝的重組畢赤酵母將更有可能實(shí)現(xiàn)目的蛋白的高效表達(dá)。4.菌落PCR鑒定重組畢赤酵母挑取待測畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，按下述方法進(jìn)行PCR模板的預(yù)制(1)挑取高拷貝轉(zhuǎn)化子的單菌落，置于裝有200 μ L去離子水的1.5mL離心管中， 2000g離心5min，棄上清；(2)將裝有菌體的離心管置于微波爐中檔加熱aiiin，然后轉(zhuǎn)移到-80°C冰凍 5min ；(3)再置于微波爐中檔加熱aiiin后轉(zhuǎn)移到_80°C冰凍5min，最后再移至微波爐中 檔加熱2min ；(4)向步驟(3)中加熱后的離心管中加入30 μ L去離子水，于IOOOOg離心Imin, 吸取上清作為PCR反應(yīng)的模板；(5)使用 9k-coll 鑒定引物 F(SEQ ID NO. 7)、R(SEQ ID NO. 8)，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；其 中9k-coll鑒定引物序列為F 5' -GCTGAAGCTG TCATCGGTTA CTCA-3，；R 5，-TCGCTCTCCA GCCTTGCCG-3，。(6)PCR結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測，在1155bp左右出現(xiàn)條帶的，可以初步確定 為陽性轉(zhuǎn)化子。(五)、蛋白表達(dá)分析將從高抗性平板(含G418的YPD平板)上篩選到的并且經(jīng)過驗(yàn)證的陽性菌株按 照如下程序進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)將陽性菌株接種于5mL YPD培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)12h，然后轉(zhuǎn)接入20mLBMGY培養(yǎng)基 中，30°C，250rpm培養(yǎng)12h，4000rpm離心IOmin后倒掉上清，用無菌水清洗菌體，4000rpm離 心lOmin，加入適量的BMMY培養(yǎng)基使菌液的0D600為1. 0，在30°C，250rpm條件下，甲醇誘 導(dǎo)120h(每隔24h添加培養(yǎng)基總體積的的甲醇)，按時(shí)間點(diǎn)分別取菌液樣品，取樣量為 1.011^，置于1. 5mL離心管中，常溫，12000rpm離心5min，收集上清，時(shí)間點(diǎn)一般取:12h,24h, 36h、48h、60h 和 72h。(六)、重組類人膠原蛋白N端測序?qū)⑹占纳锨寮兓筮M(jìn)行SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析，并以考馬斯亮 藍(lán)G-250染色得單一條帶，可見分子量在100KD，比理論分子量大，將重組蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜 上并剪下進(jìn)行N端測序，對N端氨基酸進(jìn)行測定的結(jié)果為A-G-N-T-G，與基因設(shè)計(jì)一致。(七)、重組類人膠原蛋白質(zhì)譜分析將純化后的上清用AXIMA-CFR plUS基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行質(zhì)譜儀測得 的類人膠原蛋白分子量為74019. 02，與計(jì)算分子量74213. 9相對誤差為-0.沈％，準(zhǔn)確度 < 士0. 5%。(八)、DNA序列分析提取陽性菌株基因組，以此為模板，采用PCR方法擴(kuò)增重組類人膠原蛋白基因，擴(kuò) 增產(chǎn)物經(jīng)過純化進(jìn)行DNA測序分析，PCR方法擴(kuò)增的重組DNA測定結(jié)果與基因設(shè)計(jì)一致，確 定該陽性菌株為畢赤酵母基因工程菌(巴斯德畢赤酵母Pichiapastoris C13，保藏編號為 CGMCC No. 4437)。
二、畢赤酵母基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)挑取畢赤酵母基因工程菌單菌落，置于裝有30mL BMGY培養(yǎng)基的150mL三角瓶中， 于 28°C 30°C、250rpm 300rpm培養(yǎng)至 0D600 為 2 6 ；室溫下 1500g 3000g 離心 5min， 收集菌體，用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，使重懸后的菌體0D600為1. 0 ；將重懸菌體所得的菌液 置于500mL的三角瓶中，用四層紗布封口，于28°C 30°C，250rpm 300rpm的搖床上繼續(xù) 培養(yǎng)；每24h向培養(yǎng)基中添加無水甲醇至培養(yǎng)基中，無水甲醇的添加量為培養(yǎng)基總體積的 1% ；按時(shí)間點(diǎn)分別取菌液樣品，取樣量為l.OmL，置于1.5mL離心管中，常溫，12000rpm離 心5min，收集上清，分析目的蛋白的表達(dá)量和菌液最佳收獲時(shí)間，時(shí)間點(diǎn)一般取12h、24h、 36h、48h、60h和72h，待檢測樣品于-70 V保存?zhèn)溆?。三、重組類人膠原蛋白的提純分離純化工藝將培養(yǎng)的畢赤酵母基因工程菌菌液經(jīng)過離心分離后收集上清液，上清液經(jīng)層析柱 SlOO除去顏色物質(zhì)和腥味，再經(jīng)脫鹽柱G75去掉多余的鹽分，脫鹽后超濾濃縮，收集蛋白冷 凍干燥。本發(fā)明從已知序列的人體膠原蛋白基因I型和III型的螺旋區(qū)中精選水溶性、穩(wěn) 定性強(qiáng)的核苷酸序列，將這兩段基因插入畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化畢赤酵母篩選得到高 表達(dá)畢赤酵母基因工程菌，經(jīng)過發(fā)酵罐大規(guī)模發(fā)酵分泌表達(dá)及一系列的純化步驟，得到高 純度的重組類人膠原蛋白。實(shí)驗(yàn)證明該法生產(chǎn)的重組類人膠原蛋白具有良好的親水性及穩(wěn) 定性，由于其結(jié)構(gòu)與天然膠原蛋白基因序列相應(yīng)部分100%相同，所以應(yīng)用于人體當(dāng)中不會 造成免疫排斥，可以廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)用材料、化妝品等領(lǐng)域。該發(fā)明獲得的類人膠原蛋白 表達(dá)量高，純化方便，在發(fā)酵罐中的表達(dá)量可達(dá)到5. Og/L,單個(gè)批次50升罐可生產(chǎn)粗蛋白 150g左右，由于表達(dá)量高，粗蛋白純度在80%以上，雜蛋白很少，只有畢赤酵母常見的副產(chǎn) 物以及腥味等需要去除，這樣給純化帶來很大的方便。本發(fā)明采用的是分泌型表達(dá)載體，成 功實(shí)現(xiàn)了重組類人膠原蛋白的分泌型表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分泌在上清液中，方便純化，具有其他 重組類人膠原蛋白生產(chǎn)所不具備的優(yōu)勢，便于規(guī)?；a(chǎn)操作。由于載體電轉(zhuǎn)入畢赤酵母 之后，基因整合在畢赤酵母基因組上，所以重組菌的穩(wěn)定性好，經(jīng)過多次傳代基因不容易發(fā) 生流失并能保持高效表達(dá)的性狀，能夠很好的實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定生產(chǎn)，畢赤酵母生產(chǎn)方法為好氧發(fā) 酵，菌體密度高，表達(dá)量還有很大的提升空間。圖1是載體pPIC9K-C03al-C0lal的構(gòu)建路線圖co3al表示III型膠原蛋白螺 旋區(qū)部分基因，colal表示I型膠原蛋白螺旋區(qū)部分基因，pPIC9k表示畢赤酵母表達(dá)載體。 co3al 和 pPIC9k 經(jīng)雙酶切之后(Xho I 和 EcoR I 雙切)連接成 pPIC9k-co3al，pPIC9k_co3al 和colal用EcoRl單酶切之后連接成pPIC9k-co3al_colal，為最終表達(dá)載體。圖2是菌落PCR鑒定重組畢赤酵母的電泳圖經(jīng)過G418不同濃度的反復(fù)篩選，最 終在高濃度4. Omg/mL條件下篩選到9個(gè)高拷貝重組子，并對其進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果顯 示，9個(gè)重組子都能擴(kuò)增出約1155bp左右的片段，說明重組子篩選結(jié)果正確。圖3是pPIC9K-C03al-C0lal重組畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)后的電泳圖挑選高拷貝重組 子菌株搖瓶發(fā)酵，在甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵后，分別在24h、36h、48h、60h和72h取樣，SDS-PAGE電泳 分析，顯示與預(yù)測的C03al-C0lal基因所表達(dá)的蛋白的表觀分子量為lOOKDa，比理論分子 量大，發(fā)酵至60h表達(dá)量已達(dá)到最高，而且條帶單一，基本無其它雜蛋白，便于后期的純化。
權(quán)利要求
1. 一種重組類人膠原蛋白，其特征在于，其序列如下AGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPLGIAGITGARGLAGPPGMPGP60RGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTAGEPGRDGNPGSDGLPGRDGS120PGGKGDRGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGP180QGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAEFGADGVAGPK240GPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRP300GPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPA360GPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGARGERGFPGER420GVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGDR480GDAGPKGADGSPGKDGVRGLTGPIGPPGPAGAPGDKGESGPSGPAGPTGARGAPGDRGEP540GPPGPAGFAGPPGADGQPGAKGEPGDAGAKGDAGPPGPAGPAGPPGPIGNVGAPGAKGAR600GSAGPPGATGFPGAAGRVGPPGPSGNAGPPGPPGPAGKEGGKGPRGETGPAGRPGEVGPP660GPPGPAGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQ720GPSGASGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGAEGSPGRDGSPGAKGDRGETGPAGPP780GAPGAPGAPGPVGPAGKSGDRGETGPAGPAGPVGPVGARGPAGPQGPRGDKGETGEQGD839所述重組類人膠原蛋白的結(jié)構(gòu)為單鏈、單螺旋結(jié)構(gòu) ，其氨基酸為839個(gè)，其中1-241 為III型肽段，242-839為I型肽段。
2.—種生產(chǎn)如權(quán)利要求1所述的重組類人膠原蛋白的方法，其特征在于，該方法包括 以下步驟(1)畢赤酵母基因工程菌的構(gòu)建；(2)畢赤酵母基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)；(3)重組類人膠原蛋白的誘導(dǎo)和表達(dá)；(4)重組類人膠原蛋白的純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種重組類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟(1)中 所述畢赤酵母基因工程菌的構(gòu)建如下a.將人體已知的I型和III型膠原蛋白基因螺旋區(qū)的一段基因分別抽提出來，然后進(jìn) 行縫合，重組DNA ；b.將重組DNA轉(zhuǎn)入并整合到畢赤酵母的基因組中，篩選得到畢赤酵母基因工程菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種重組類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟(2)中 所述畢赤酵母基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)過程如下挑取畢赤酵母基因工程菌單菌落，置于裝 有30mL BMGY培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，于 30°C，250rpm 300rpm培養(yǎng)至0D600為 2. 0 6. 0，室溫下1500g 3000g離心5min，收集菌體，用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，使重懸后 的菌體0D600為1. 0 ；將重懸菌體所得的菌液置于500mL的三角瓶中，用四層紗布封口，于 30°C、250rpm 300rpm的搖床上繼續(xù)培養(yǎng)，每Mh向培養(yǎng)基中添加無水甲醇；所述 無水甲醇的添加量為培養(yǎng)基總體積的1%。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種重組類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟(4)所 述重組類人膠原蛋白的純化過程為培養(yǎng)的畢赤酵母基因工程菌經(jīng)過離心分離后收集上清 液，收集的上清液經(jīng)層析柱SlOO除去顏色物質(zhì)和腥味，再經(jīng)脫鹽柱G75去掉多余的鹽分，脫 鹽后超濾濃縮，收集蛋白冷凍干燥。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種重組鄉(xiāng)DNA的序列如下GCGGGTAACACTGGTGCTCCTGGCAGCCCTCAACCAGGAGAGAAGGGATCGCCTGGTGCCGGGATTGCTGGGATCACTGGAGCACGGGGTAGGGGAAGCCCTGGCCCTCAGGGTGTCAAGCTCAGTGGAGAACGTGGTCCCCCTGGACCCGGTGAACCTGGAAGAGATGGAAACCCTGGACCTGGTGGCAAGGGTGATCGTGGTGAAAATCATCCAGGCCCACCTGGTCCTGTCGGTCCAGGCCCTGCTGGCCCTGCTGGTGCTCCCGGTCAAGGCCCACGTGGTGACAAAGGTGAAACACATCGAGGATTCCCTGGTAATCCAGGTGCCGGTGCAATCGGCAGTCCAGGACCTGCAGAAGGTCCCGCTGGTGAACGTGGTTCTCCTGGCGCTGGTCGTCCCGGTGAAGCTGGTCTGCCTAGCCCTGGTCCTGATGGCAAAACTGGCCCCGGACCCCCAGGCCCACCTGGTGCCCGTGGTAAAGGTGCTGCTGGAGAGCCCGGCAAGGCTGCTGTCGGTCCTGCTGGCAAAGATGGAGAGGGTCCCGCTGGCGAGAGAGGTGAACAAGGCCCTGGTCCTGCTGGTCCTCCAGGTGAAGCAGACCTTGGCGCCCCTGGCCCCTCTGGAGCAGGTGTGCAAGGTCCCCCTGGTCCTGCTGGTGATGGTGCTAAGGGTGATGCTGGTGCCCCTCTTCAGGGAATGCCTGGTGAACGTGGTGCAGGTGATGCTGGTCCCAAAGGTGCTGATGGCACTGGCCCCATTGGTCCTCCTGGCCCTGCTCCCAGCGGCCCTGCTGGTCCCACTGGAGCTGGTCCCCCCGGCCCTGCTGGCTTTGCTGGCAAAGGCGAACCTGGTGATGCTGGTGCTAAACCCGCTGGACCCCCTGGCCCCATTGGTAATGGCAGCGCTGGTCCCCCTGGTGCTACTGGTCCTGGCCCCTCTGGAAATGCTGGACCCCCTGGCAAAGGTCCCCGTGGTGAGACTGGCCCTGGTCCCCCTGGCCCTGCTGGCGAGAAAGGACCTGGTACTCCCGGGCCTCAAGGTATTGCTCAGAGAGGAGAGAGAGGCTTCCCTGGTCTTGGTCCCTCTGGAGCAAGTGGTGAACGTGGT人膠原蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述重組GGAGTGTCTGGACCAAAAGGTGATGCTGGC60CAGGGCCCACCAGGAGCTCCAGGCCCACTT120CTTGCAGGACCACCAGGCATGCCAGGTCCT180GGTGAAAGTGGGAAACCAGGAGCTAACGGT240CAGGGTCTTCCTGGTCTGGCTGGTACAGCT300TCAGATGGTCTTCCAGGCCGAGATGGATCT360GGCTCTCCTGGTGCCCCTGGCGCTCCTGGT420GCTGGAAAGAGTGGTGACAGAGGAGAAAGT480CCTGCTGGTTCCCGAGGTGCTCCTGGTCCT540GGTGAACGTGGAGCTGCTGGCATCAAAGGA600CCAGGTTCTCCAGGCCCTGCTGGTCAGCAG660TTCGGCGCAGATGGTGTTGCTGGTCCCAAG720CCTGCTGGCCCCAAAGGATCTCCTGGTGAA780GGTGCCAAGGGTCTGACTGGAAGCCCTGGC840CCTGGTCCCGCCGGTCAAGATGGTCGCCCC900CAGGCTGGTGTGATGGGATTCCCTGGACCT960GGAGAGCGAGGTGTTCCCGGACCCCCTGGC1020GCTGGAGCTCAGGGACCCCCTGGCCCTGCT1080CCTGCTGGCTCCCCCGGATTCCAGGGTCTC1140GGCAAACCTGGTGAACAGGGTGTTCCTGGA1200AGAGGCGAGAGAGGTTTCCCTGGCGAGCGT1260CCCCGAGGGGCCAACGGTGCTCCCGGCAAC1320GGAGCTCCCGGTAGCCAGGGCGCCCCTGGC1380GCTGGTCTTCCAGGGCCTAAGGGTGACAGA1440TCTCCTGGCAAAGATGGCGTCCGTGGTCTG1500GGTGCCCCTGGTGACAAGGGTGAAAGTGGT1560CGTGGTGCCCCCGGAGACCGTGGTGAGCCT1620CCCCCTGGTGCTGACGGCCAACCTGGTGCT1680GGCGATGCTGGTCCCCCTGGCCCTGCCGGA1740GTTGGTGCTCCTGGAGCCAAAGGTGCTCGC1800TTCCCTGGTGCTGCTGGCCGAGTCGGTCCT1860GGCCCTCCTGGTCCTGCTGGCAAAGAAGGC1920GCTGGACGTCCTGGTGAAGTTGGTCCCCCT1980TCCCCTGGTGCTGATGGTCCTGCTGGTGCT2040GGACAGCGTGGTGTGGTCGGCCTGCCTGGT2100CCTGGCCCCTCTGGTGAACCTGGCAAACAA2160CCCCCTGGTCCCATGGGCCCCCCTGGATTG2220GCTGGACCCC CTGGTGAATC TGGACGTGAG GGGGCTCCTG GTGCCGAAGG CGAGACGGTT CTCCTGGCGC CAAGGGTGAC CGTGGTGAGA CCGGCCCCGC GGTGCTCCTG GTGCTCCTGG TGCCCCTGGC CCCGTTGGCC CTGCTGGCAA CGTGGTGAGA CTGGTCCTGC TGGTCCCGCC GGTCCTGTCG GCCCTGTTGG CCCGCCGGAC CCCAAGGCCC CCGTGGTGAC AAGGGTGAGA CAGGCGAACA TTCCCCTGGA2280TGGACCCCCT2340GAGTGGTGAT2400CGCCCGTGGC2460GGGCGAC251全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組類人膠原蛋白，該類人膠原蛋白具有良好的親水性及穩(wěn)定性，其結(jié)構(gòu)與天然膠原蛋白基因序列相應(yīng)部分100％相同，應(yīng)用于人體當(dāng)中不會造成免疫排斥，可以廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)用材料、化妝品等領(lǐng)域。本發(fā)明還公開了該重組類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法，包括畢赤酵母基因工程菌的構(gòu)建；畢赤酵母基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)；重組類人膠原蛋白的誘導(dǎo)和表達(dá)；重組類人膠原蛋白的純化。采用本發(fā)明方法生產(chǎn)的類人膠原蛋白表達(dá)量高，純化方便，在發(fā)酵罐中的表達(dá)量可達(dá)到5.0g/L，單個(gè)批次50升罐可生產(chǎn)粗蛋白150g左右，由于表達(dá)量高，粗蛋白純度在80％以上，雜蛋白很少。
文檔編號C12N1/19GK102146135SQ20101060211
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者侯增淼, 張鳳龍, 聶蘇秦 申請人:陜西九州生物醫(yī)藥科技園發(fā)展有限公司