專利名稱：一種萎縮芽孢桿菌及其制劑和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)應用微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種萎縮芽孢桿菌以及利用該萎縮芽孢桿菌生產(chǎn)微生物制劑及其制備方法和應用。
背景技術(shù)：
腸道益生菌是一種大多來源于消化道又作用于消化道的活菌制劑，能有效補充動物消化道內(nèi)的有益微生物，抑制病原菌的生長，改善消化道菌群平衡，提高水產(chǎn)動物的免疫機能或者生長速度。刺參(Apostichopus japonicus Liao，又稱仿刺參)，屬無脊椎動物，棘皮動物門， 海參綱，仿刺參屬。因其營養(yǎng)價值高，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，目前已經(jīng)發(fā)展成為我國沿海最大的海水養(yǎng)殖品種之一。近年來由于刺參高密度養(yǎng)殖和不規(guī)范運作以及病害防治技術(shù)的相對滯后，病害問題日趨突出，尤其養(yǎng)殖刺參“腐皮綜合征”的暴發(fā)，造成了嚴重的經(jīng)濟損失，制約了該產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。由于刺參特殊的生活習性和養(yǎng)殖特點，且抗生素藥物等疾病預防措施本身又存在一些缺點和局限性，故采用微生態(tài)制劑將成為防止刺參養(yǎng)殖疾病發(fā)生的有效措施之一。芽孢桿菌是目前最常用的益生菌種類。本發(fā)明根據(jù)來源于自然，回歸自然的原則， 從海參腸道篩選出具有拮抗刺參病原菌和高產(chǎn)酶活性的一株萎縮芽孢桿菌，并開發(fā)成微生態(tài)制劑，有效避免不同來源益生菌菌株之間的差異，保證微生態(tài)制劑的安全性和高效性，對海參健康養(yǎng)殖有現(xiàn)實意義。根據(jù)來源于自然，回歸自然的原則，篩選與原宿主、原生境、原微生態(tài)區(qū)系、原微生物種群相適應的菌種是開發(fā)微生態(tài)制劑的最好途徑。面對目前海參專用微生態(tài)制劑匱乏的局面，從海參腸道篩選益生菌并開發(fā)成微生態(tài)制劑，避免了不同菌株之間的差異，保證微生態(tài)制劑的安全性和高效性。因此，從海參腸道中分離土著益生菌，通過對相關(guān)菌株的配伍達到抗菌、免疫、促生長的多重效果，對海參健康養(yǎng)殖有現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，提供適應于海參腸道的萎縮芽孢桿菌菌株，并給出以該菌株制備微生物制劑的生產(chǎn)方法和該制劑在海參養(yǎng)殖中的使用方法。本發(fā)明微生物制劑作為飼料添加劑，能提高海參特定生長率、降低海參死亡率、增強海參的免疫能力和腸道的消化酶活力，同時提高海參的抗病力，達到了抗菌、免疫、促生長多重效果，可減少和取代抗生素的使用，對提高養(yǎng)殖成活率和產(chǎn)品質(zhì)量，保障該產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)具有十分重要的意義。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種萎縮芽孢桿菌菌株Aj080319IA_12，所述菌株分離于野生刺參腸道，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2010316。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種飼料添加劑，包括萎縮芽孢桿菌菌株 Aj080319IA-12，所述菌株分離于野生刺參腸道，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為 CCTCC M 2010316。所述飼料添加劑的制備方法可以包括以下步驟A.平板培養(yǎng)復壯將低溫保存的萎縮芽孢桿菌菌株Aj080319IA-12接種于TSB固體平板培養(yǎng)基上，于20 35°C培養(yǎng)12 36h，使菌種復壯并形成單菌落；然后挑取單菌落接種于TSB斜面培養(yǎng)基上，于20 35°C培養(yǎng)12 36h ；B.種子液的制備將步驟A培養(yǎng)的菌種用5 30%。滅菌的生理鹽水制成 IX 105CFU/mL的菌懸液，以2 10%的接種量接種于TSB液體培養(yǎng)基中，20 !35°C，100 200rpm振蕩培養(yǎng)18 20h，獲得種子液；C.發(fā)酵培養(yǎng)將步驟B中的種子液以2 10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中， 20 ;35°C，100 200rpm振蕩培養(yǎng)50 150h，至活菌數(shù)為0. 2 8X109CFU/mL，中止發(fā)酵；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及其重量百分比分別為葡萄糖1 5%，大豆粉餅1 5%，氯化鈉1 3%，其余為水；D.微生物制劑的制備向步驟C的發(fā)酵液中加入沸石粉，每IOOmL發(fā)酵液中加入5 30g沸石粉，100 200rpm振蕩20 60min后靜止20 60min，將上述發(fā)酵液于 40C 6000rpm離心20min，棄上清，每IOOg沉淀中加入20 40g沸石粉混勻后，于30 60°C 烘干2 5h。所述飼料添加劑優(yōu)選為用于海參的飼料添加劑，添加劑量可以為海參飼料總重量的 0. 5 7%0。所述飼料添加劑可以為固態(tài)粉狀制劑。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明又提供了一種微生物制劑，所述微生物制劑的制備方法包括以下步驟A.平板培養(yǎng)復壯將低溫保存的菌株接種于TSB固體平板培養(yǎng)基上，于22 33°C 培養(yǎng)14 38h，使菌種復壯并形成單菌落；然后挑取單菌落接種于TSB斜面培養(yǎng)基上，于 22 33°C培養(yǎng)14 36h ；B.種子液的制備將步驟A培養(yǎng)的菌種用5 30%。滅菌的生理鹽水制成 IX 105CFU/mL的菌懸液，以3 10%的接種量接種于TSB液體培養(yǎng)基中，20 !35°C，100 200rpm振蕩培養(yǎng)18 22h，獲得種子液；C.發(fā)酵培養(yǎng)將步驟B中的種子液以3 10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中， 23 ;35°C，100 200rpm振蕩培養(yǎng)60 150h，至活菌數(shù)為0. 2 8X109CFU/mL，中止發(fā)酵；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及其重量百分比分別為葡萄糖1 5%，大豆粉餅1 5%，氯化鈉1 3%，其余為水；D.微生物制劑的制備向步驟C的發(fā)酵液中加入沸石粉，每IOOmL發(fā)酵液中加入6 30g沸石粉，100 200rpm振蕩20 60min后靜止20 60min，將上述發(fā)酵液于 40C 6000rpm離心20min，棄上清，每IOOg沉淀中加入20 40g沸石粉混勻后，于30 60°C 烘干2 5h。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明再提供了一種微生物制劑的制備方法，包括以下步驟
A.平板培養(yǎng)復壯將低溫保存的菌株接種于TSB固體平板培養(yǎng)基上，于18 37°C 培養(yǎng)14 36h，使菌種復壯并形成單菌落；然后挑取單菌落接種于TSB斜面培養(yǎng)基上，于 24 38°C培養(yǎng)12 36h ；B.種子液的制備將步驟A培養(yǎng)的菌種用5 30%。滅菌的生理鹽水制成 1 X 105CFU/mL的菌懸液，以3 9%的接種量接種于TSB液體培養(yǎng)基中，20 ，100 200rpm振蕩培養(yǎng)18 20h，獲得種子液；C.發(fā)酵培養(yǎng)將步驟B中的種子液以2 10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中， 20 ;35°C，100 200rpm振蕩培養(yǎng)50 150h，至活菌數(shù)為0. 2 8X 109CFU/mL，中止發(fā)酵；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及其重量百分比分別為葡萄糖1 5%，大豆粉餅1 4%，氯化鈉1 3%，其余為水；D.微生物制劑的制備向步驟C的發(fā)酵液中加入沸石粉，每IOOmL發(fā)酵液中加入7 30g沸石粉，100 200rpm振蕩20 60min后靜止20 60min，將上述發(fā)酵液于 40C 6000rpm離心20min，棄上清，每IOOg沉淀中加入20 40g沸石粉混勻后，于32 60°C 烘干2 5h。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明也提供了一種所述萎縮芽孢桿菌菌株 Aj080319IA-12作為飼料添加劑和/或微生物制劑的應用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種所述萎縮芽孢桿菌菌株 Aj080319IA-12作為腸道益生元的應用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明另提供了一種所述萎縮芽孢桿菌菌株 Aj080319IA-12在飼料添加劑、微生物制劑和/或腸道益生元的制備中的應用。本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果1)所篩選的萎縮芽胞桿菌對海參病原菌有顯著的拮抗作用，并且具有提高刺參生長速度、免疫力和腸道消化酶活力的功能。2)所篩選萎縮芽胞桿菌是從海參腸道中篩選的土著菌，對海參安全無毒、繁殖速度快、易于培養(yǎng)、對環(huán)境適應能力強，能較快的繁殖形成優(yōu)勢菌。3)所研制的微生物制劑使用操作方法簡便，只需將該制劑添加到飼料中進行投喂即可，適用于幼參養(yǎng)殖培育和各種模式的刺參養(yǎng)殖過程中的疾病控制。4)使用本發(fā)明可減少或替代抗生素的使用，對減少藥殘、提高海參商品質(zhì)量、保障食品安全具有重要作用。


圖1為本發(fā)明實施例所述根據(jù)16S rDNA序列用PHYLIP軟件獲得的進化樹結(jié)果圖；圖2為本發(fā)明實施例所述萎縮芽孢桿菌菌株Aj080319IA_12制劑對海參體腔液酶活力的影響結(jié)果圖；圖3為本發(fā)明實施例所述Aj080319IA_12萎縮芽孢桿菌制劑對海參腸道酶活力的影響結(jié)果圖。
具體實施例方式以下將結(jié)合附圖及實施例來詳細說明本發(fā)明的實施方式，借此對本發(fā)明如何應用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題，并達成技術(shù)效果的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。實施例1 AJ080319IA-12菌株的篩選分離過程Aj080319IA_12菌株是中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所從野生刺參腸道中分離得到的。2008年中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所從青島太平角海域抓獲的野生刺參，在無菌條件下對刺參進行活體解剖，取其腸道，擠出腸道內(nèi)容物，用滅菌的15%。的生理鹽水沖洗腸道三次，將沖洗后的腸道勻漿，等比稀釋后涂布在TSB培養(yǎng)基和2216E海水瓊脂培養(yǎng)基上，選擇合適稀釋度的平板進行細菌的分離并通過多次劃線培養(yǎng)純化細菌，記錄細菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)、數(shù)量并拍照；以刺參常見病原菌-燦爛弧菌(Vibrio splendidus)、假交替單胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)禾口嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophlia)為指示菌，利用點種法、十字交叉法和牛津杯法檢測所分離細菌對刺參病原菌的抑菌作用，將其抑菌效果與抗生素的抑菌效果對比，篩選出抑菌效果顯著的菌株；同時利用點種法和牛津杯法測定具有拮抗作用菌株的產(chǎn)酶能力；結(jié)果從中篩選出1個抑菌作用大于或接近抗生素抑菌效且產(chǎn)酶能力強的菌株，編號為Aj080319IA-12。實施例2 AJ080319IA-12菌株的形態(tài)特征菌株Aj080319IA_12的細胞革蘭氏染色為陽性，菌體為桿狀，芽孢染色結(jié)果顯示有芽孢，莢膜染色顯示菌體無莢膜。在TSB固體平板培養(yǎng)基上菌落黃色，表面有皺折，拉絲狀，不透明，邊緣不整齊，凸起，培養(yǎng)4 后菌落周圍發(fā)黑色，液體培養(yǎng)時有菌膜且有沉淀生成。實施例3 16S rDNA 序列測定如圖1所示，為本發(fā)明實施例所述根據(jù)16S rDNA序列用PHYLIP軟件獲得的進化樹結(jié)果圖。用于擴增細菌16S rDNA 的通用引物為 27F 5，-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3，和反向引物 1492R :5，-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3‘。以 Aj080319IA_12 菌株的基因組 DNA為模板擴增16S rDNA并進行轉(zhuǎn)化測序，所得的序列見序列表。將所得的Aj080319IA-12 菌株的16SrDNA序列在Genbank中進行同源性比較，采用Clustalw軟件進行多序列匹配排列，用系統(tǒng)發(fā)生推斷軟件包PHYLIP4. O進行統(tǒng)計分析和聚類分析，采用鄰位相連法獲得發(fā)育系統(tǒng)樹(圖1)，通過自舉分析進行系統(tǒng)進化樹的評估，自舉的數(shù)據(jù)集為1000次。同源性比較結(jié)果表明，Aj080319IA_12菌株與萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)的同源性達到 99. 93%。實施例4:生理生化特征采用法國梅里埃公司API ID 32E鑒定試劑條分析菌株的生理生化特性，對于不確定的反應，采用北京陸橋技術(shù)有限責任公司的菌種鑒定管進行測定結(jié)果分別見表1。根據(jù) ((Bergey' s Manual of Determinative Bacteriology))(第 9 片反)禾口 Gordon 〈〈芽子包桿菌》屬的特征對菌株進行分類地位鑒定，該菌株具有萎縮芽孢桿菌生理生化特征，同時結(jié)合16S rDNA序列同源性分析結(jié)果，說明Aj080319IA-12菌株屬于一種萎縮芽孢桿菌。表1 :Aj080319IA-12菌株API ID 32E生理生化反應結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種萎縮芽孢桿菌菌株Aj080319IA-12，其特征在于，所述菌株分離于野生刺參腸道，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M2010316。
2.一種飼料添加劑，其特征在于，包括萎縮芽孢桿菌菌株Aj080319IA-12，所述菌株分離于野生刺參腸道，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2010316。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述飼料添加劑，其特征在于，所述飼料添加劑的制備方法包括以下步驟A.平板培養(yǎng)復壯將低溫保存的萎縮芽孢桿菌菌株Aj080319IA-12接種于TSB固體平板培養(yǎng)基上，于20 35°C培養(yǎng)12 36h，使菌種復壯并形成單菌落；然后挑取單菌落接種于TSB斜面培養(yǎng)基上，于20 ;35°C培養(yǎng)12 36h ；B.種子液的制備將步驟A培養(yǎng)的菌種用5 30%。滅菌的生理鹽水制成IX105CFU/mL 的菌懸液，以2 10%的接種量接種于TSB液體培養(yǎng)基中，20 35°C，100 200rpm振蕩培養(yǎng)18 20h，獲得種子液；C.發(fā)酵培養(yǎng)將步驟B中的種子液以2 10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，20 35°C, 100 200rpm振蕩培養(yǎng)50 150h，至活菌數(shù)為0. 2 SXlOtFU/mL，中止發(fā)酵；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及其重量百分比分別為葡萄糖1 5%，大豆粉餅1 5%， 氯化鈉1 3%，其余為水；D.微生物制劑的制備向步驟C的發(fā)酵液中加入沸石粉，每IOOmL發(fā)酵液中加入5 30g沸石粉，100 200rpm振蕩20 60min后靜止20 60min，將上述發(fā)酵液于4°C 6000rpm 離心20min，棄上清，每IOOg沉淀中加入20 40g沸石粉混勻后，于30 60°C烘干2 5h。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的飼料添加劑，其特征在于，所述飼料添加劑為用于海參的飼料添加劑，添加劑量為海參飼料總重量的0. 5 7%0。
5.根據(jù)權(quán)利要求2 4中任一項所述的飼料添加劑，其特征在于，所述飼料添加劑為固態(tài)粉狀制劑。
6.一種微生物制劑，其特征在于，所述微生物制劑的制備方法包括以下步驟A.平板培養(yǎng)復壯將低溫保存的菌株接種于TSB固體平板培養(yǎng)基上，于22 33°C培養(yǎng) 14 38h，使菌種復壯并形成單菌落；然后挑取單菌落接種于TSB斜面培養(yǎng)基上，于22 33°C 培養(yǎng) 14 36h ；B.種子液的制備將步驟A培養(yǎng)的菌種用5 30%。滅菌的生理鹽水制成1X 105CFU/mL 的菌懸液，以3 10%的接種量接種于TSB液體培養(yǎng)基中，20 35°C，100 200rpm振蕩培養(yǎng)18 22h，獲得種子液；C.發(fā)酵培養(yǎng)將步驟B中的種子液以3 10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，23 350C，100 200rpm振蕩培養(yǎng)60 150h，至活菌數(shù)為0. 2 8 X 109CFU/mL,中止發(fā)酵；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及其重量百分比分別為葡萄糖1 5%，大豆粉餅1 5%， 氯化鈉1 3%，其余為水；D.微生物制劑的制備向步驟C的發(fā)酵液中加入沸石粉，每IOOmL發(fā)酵液中加入6 30g沸石粉，100 200rpm振蕩20 60min后靜止20 60min，將上述發(fā)酵液于4°C 6000rpm 離心20min，棄上清，每IOOg沉淀中加入20 40g沸石粉混勻后，于30 60°C烘干2 5h。
7.—種微生物制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟A.平板培養(yǎng)復壯將低溫保存的菌株接種于TSB固體平板培養(yǎng)基上，于18 37°C培養(yǎng) 14 36h，使菌種復壯并形成單菌落；然后挑取單菌落接種于TSB斜面培養(yǎng)基上，于M 38°C培養(yǎng) 12 36h ；B.種子液的制備將步驟A培養(yǎng)的菌種用5 30%。滅菌的生理鹽水制成1X 105CFU/mL 的菌懸液，以3 9%的接種量接種于TSB液體培養(yǎng)基中，20 35°C，100 200rpm振蕩培養(yǎng)18 20h，獲得種子液；C.發(fā)酵培養(yǎng)將步驟B中的種子液以2 10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，20 35°C, 100 200rpm振蕩培養(yǎng)50 150h，至活菌數(shù)為0. 2 SXlOtFU/mL，中止發(fā)酵；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及其重量百分比分別為葡萄糖1 5%，大豆粉餅1 4%， 氯化鈉1 3%，其余為水；D.微生物制劑的制備向步驟C的發(fā)酵液中加入沸石粉，每IOOmL發(fā)酵液中加入7 30g沸石粉，100 200rpm振蕩20 60min后靜止20 60min，將上述發(fā)酵液于4°C 6000rpm 離心20min，棄上清，每IOOg沉淀中加入20 40g沸石粉混勻后，于32 60°C烘干2 5h。
8.一種如權(quán)利要求1所述萎縮芽孢桿菌菌株Aj080319IA-12作為飼料添加劑和/或微生物制劑的應用。
9.一種如權(quán)利要求1所述萎縮芽孢桿菌菌株Aj080319IA-12作為腸道益生元的應用。
10.一種如權(quán)利要求1所述萎縮芽孢桿菌菌株Aj080319IA-12在飼料添加劑、微生物制劑和/或腸道益生元的制備中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種萎縮芽孢桿菌菌株Aj080319IA-12，其特征在于，所述菌株分離于野生刺參腸道，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2010316。本發(fā)明所篩選的萎縮芽胞桿菌對海參病原菌有顯著的拮抗作用，并且具有提高刺參生長速度、免疫力和腸道消化酶活力的功能。是從海參腸道中篩選的土著菌，對海參安全無毒、繁殖速度快、易于培養(yǎng)、對環(huán)境適應能力強，能較快的繁殖形成優(yōu)勢菌。本發(fā)明微生物制劑作為飼料添加劑，能提高海參特定生長率、降低海參死亡率、增強海參的免疫能力和腸道的消化酶活力，同時提高海參的抗病力，達到了抗菌、免疫、促生長多重效果，可減少和取代抗生素的使用。
文檔編號C12N1/20GK102559533SQ201010602309
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者廖梅杰, 張正, 曲江波, 李彬, 王印庚, 王嵐, 王崇明, 榮小軍, 陳貴平, 陳霞 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所