專利名稱：Fq-pcr檢測(cè)嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種FQ-PCR檢測(cè)嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌的試劑盒，屬化 學(xué)中包含酶或微生物的測(cè)定或檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
嗜水氣單胞菌Ueroffloaas hydrophila )在自然界中有廣泛分布，普遍存在于淡 水、污水、淤泥、土壤和人類糞便中，可感染魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類等動(dòng)物，人 也可感染該菌而發(fā)生食物中毒、腹瀉，影響食品安全，并且是免疫抑制患者和肝功能疾病患 者的機(jī)會(huì)致病菌，是一種典型人、獸、魚共患病病原菌，除了對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損 失外，其公共衛(wèi)生學(xué)意義，尤其是在臨床疾病和食品安全方面，日益受到相關(guān)部門重視。溫和氣單胞菌Ueroffloaas sobria)又稱威隆氣單胞菌溫和生物型(A veronii Zmw力ria)，屬常見的腐物寄生菌，廣泛存在于水域、土壤及水生動(dòng)物體內(nèi)，是一種條件性 致病菌，其主要致病因子是溫和氣單胞菌產(chǎn)生的多種溶血素和腸毒素，這些毒素具有多種 生物活性可引起動(dòng)物體發(fā)生復(fù)雜的病理變化。它能單獨(dú)引起魚類、爬行類、兩棲類等冷血?jiǎng)?物發(fā)病或與嗜水氣單胞菌共同引起魚類的敗血病，是危害我國淡水養(yǎng)殖業(yè)的重要病原菌之 一；同時(shí)，該菌也是重要的人、畜、魚共患病病原菌，能引發(fā)腹瀉、傷口感染和敗血癥等癥狀。 基于此，它與嗜水氣單胞菌UeroMWM hydrophila) 一樣也在水產(chǎn)養(yǎng)殖、臨床疾病和食品 安全等諸方面日益受到相關(guān)部門重視。目前，嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌的檢測(cè)方法多為傳統(tǒng)的生理生化鑒定和免疫 學(xué)診斷，由于它們的許多生化特征不穩(wěn)定，血清型也較復(fù)雜，故采用以上方法鑒定時(shí)易產(chǎn)生 誤判。也有針對(duì)細(xì)菌的種特異性基因采用PCR技術(shù)進(jìn)行快速檢測(cè)的手段，但都只能單一地 對(duì)其中一種進(jìn)行檢測(cè)。由于在評(píng)判致病可能性的大小時(shí)是需要一個(gè)總的致病菌含量的，所 以對(duì)于同一樣品要使用兩種不同的試劑盒、經(jīng)過兩次PCR檢測(cè)才能得到該兩種菌的總量數(shù) 據(jù)，在疫情預(yù)報(bào)、預(yù)防、控制等方面顯得不夠快速。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是從嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌中 選擇一個(gè)共有基因?yàn)榘?，提出針?duì)該基因靶的FQ-PCR檢測(cè)嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌 的試劑盒。本發(fā)明提供的FQ-PCR檢測(cè)嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌的試劑盒，內(nèi)有DNA序列 為 5，-TGG CCT TGA CAT GTC TGG AAT CCT-3，的上游引物、DNA 序列為 5，-ACC ATT ACG TGC TGG CAA CAA AGG-3，的下游引物、DNA 序列為 5，- (FAM)-AAT CAG AAC ACA GGT GCT GCA TGG CT- (TAMRA)-3，的iTaqMan探針，各試劑分別密封包裝。本發(fā)明提供的FQ-PCR檢測(cè)嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌的試劑盒，針對(duì)嗜水氣 單胞菌與溫和氣單胞菌中共有的16S rDNA而設(shè)計(jì)，通過FQ-PCR可以檢測(cè)樣品中是否含有 嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌及其所含的總量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明僅采用1對(duì)通用引物，即可同時(shí)定性、定量檢測(cè)溫和氣單胞菌和嗜水氣單胞菌2種致病菌，至少單一致病菌 的檢測(cè)時(shí)間縮短一半，實(shí)現(xiàn)應(yīng)急預(yù)警和突發(fā)疾病處理方面實(shí)時(shí)、快速的效果。16S rDNA中既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域， 其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物進(jìn)化的漫長歷程中保持不變，可看作為生物 演變的時(shí)間鐘，非常適合用于進(jìn)化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究。嗜水氣單胞菌與 溫和氣單胞菌親緣關(guān)系很近，均屬嗜溫、有運(yùn)動(dòng)力的氣單胞菌，故具有對(duì)它們?cè)O(shè)計(jì)通用引物 和探針序列的可能性。所說試劑盒內(nèi)還有密封包裝的內(nèi)含buffer、ExTagHS, dNTP Mixture、Mg2+的2X Premix EX Taq反應(yīng)液；還有密封包裝的無菌雙蒸水；還有密封包裝的DNA快速提取劑，DNA 快速提取劑由重量體積百分比為0. 9%的NaCl、重量體積百分比為0. 01%的SDS、體積百分 比為0. 1%的β -巰基乙醇、其余為水構(gòu)成。所說試劑盒內(nèi)的上游引物濃度為4 μ Μ、下游引物濃度為4 μ M、TaqMan探針濃度為 2 μ M0所說試劑盒內(nèi)包裝的試劑量是各試劑一次試驗(yàn)量的倍數(shù)，各試劑的一次試驗(yàn)量 為
4μ M上游引物0.4 μ L ； 4μΜ下游引物0. 4μ L ； 2 μ M TaqMan 探針 0. 4 μ L ； 2Χ Premix EX Taq 反應(yīng)液 IOyL; 無菌雙蒸水6. 8 μ L ； DNA快速提取劑50 μ L。
具體實(shí)施例方式1、一種FQ-PCR檢測(cè)嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌的試劑盒，由包裝盒和所包裝 的試劑構(gòu)成，每種試劑都由試劑瓶密封包裝。其中所包裝的試劑清單為
4 μ M上游引物4 μ L—支，上游引物的DNA序列為5，-TGG CCT TGA CAT GTC TGG AAT CCT-3，；
4 μ M下游引物4 μ L —支，下游引物的DNA序列為5，-ACC ATT ACG TGC TGG CAA CAA AGG-3，；
2 μ M TaqMan 探針 4 μ L 一支，TaqMan 探針的 DNA 序列為 5，- (FAM)-AAT CAG AAC ACA GGT GCT GCA TGG CT- (TAMRA)-3，。2、除上例試劑外，本例試劑盒內(nèi)還包裝有 2Χ Premix EX Taq 反應(yīng)液 100 μ L 一支； 無菌雙蒸水68 μ L—支。3、除上兩例試劑外，本例試劑盒內(nèi)還包裝有 DNA快速提取劑0. ImL 一支。本發(fā)明提供的試劑盒，其使用方法同通常FQ-PCR方法一致，過程是 一、樣品DNA提取
①取樣品清液Iml加入到1. 5ml無菌印pendorf管中，在15000r/min下高速離心anin后，吸棄上清，保留沉淀；
在沉淀中加入DNA提取劑50 μ 1，將沉淀混勻后100°C加熱處理^iiin ； 15000r/min下高速離心2min，取上清為模板(樣品DNA)。二、PCR
1、擴(kuò)增反應(yīng)液準(zhǔn)備
①從冰箱中取出試劑盒；
②根據(jù)每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)所需的2XPremix EX Taq反應(yīng)液10 μ 1 (內(nèi)含Taq酶、 buffer,dNTP Mixture、Mg2+等)、4 μ M上游引物、4 μ M 下游引物、2 μ M TaciMan 探針各 0. 4 μ L、無菌雙蒸水6. 8 μ L，按實(shí)驗(yàn)所需的反應(yīng)管數(shù)，計(jì)算出所需的試劑量依次加入，渦旋混 勻，按每管ISyL分裝到PCR玻璃毛細(xì)管中。2.加樣
①分別取2μL模板，加入到分裝好擴(kuò)增反應(yīng)液的PCR玻璃毛細(xì)管中；
②蓋好PCR玻璃毛細(xì)管蓋，然后在2000r/m下低速離心30s。3、上機(jī)
①開機(jī)，并進(jìn)行儀器性能自檢；
②將準(zhǔn)備好的PCR玻璃毛細(xì)管，放置在儀器樣本孔相應(yīng)位置；
③在熒光PCR儀器上設(shè)置好以下參數(shù)預(yù)變性95°C30秒一個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增變性 950C 5秒、退火延伸63 V 20秒共35個(gè)循環(huán)；在63°C收集熒光信號(hào)，收集方式設(shè)為“單點(diǎn) 收集(SINGLE)；儀器檢測(cè)通道選擇“F1” ；溫度變化速率選擇20°C /秒。④選擇運(yùn)行(RUN)后，開始進(jìn)行PCR擴(kuò)增。4、閾值設(shè)定與檢測(cè)結(jié)果判定
①閾值設(shè)定原則為超過陰性對(duì)照擴(kuò)增線(無規(guī)則噪音線)的最高點(diǎn)。②ct值< 30時(shí)提示樣本中含有嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌，ct值在3廣35之 間提示為不確定樣本需重新增菌后再次測(cè)定。③無Ct值顯示則提示樣本中不含有嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌或數(shù)量極少 低于檢測(cè)限。④若需定量檢測(cè)時(shí)，要加入4飛個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與樣本同時(shí)檢測(cè)，熒光定量 PCR儀會(huì)根據(jù)各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的Ct值繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線后儀器自動(dòng)計(jì)算陽性標(biāo)本的定量數(shù) 據(jù)，并在電腦界面上顯示濃度。陰性與陽性對(duì)照不能正確顯示Ct值則判定檢測(cè)失敗。使用本發(fā)明提供的試劑盒、用FQ-PCR檢測(cè)嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌還有如 下特點(diǎn)
檢測(cè)速度
模板DNA制備與擴(kuò)增反應(yīng)所需時(shí)間分別為5分鐘與25分鐘，從樣本接收到結(jié)果報(bào)告僅 需30分鐘左右。檢測(cè)靈敏度
檢出限為5.0父10、偽/1111，在5.0\10、偽/1111一5· 4X107cfu/ml的范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線呈 良好的線性關(guān)系。批內(nèi)重復(fù)性分別取5份不同濃度的嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌DNA樣本，每個(gè)濃度分成3份進(jìn) 行測(cè)試，通過用測(cè)定值的均值I計(jì)
算ct值的標(biāo)準(zhǔn)差(S)和變異系數(shù)(cv)來驗(yàn)證批內(nèi)重復(fù)性見下表
權(quán)利要求
1.一種FQ-PCR檢測(cè)嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌的試劑盒，其特征是內(nèi)有DNA序列為 5，-TGG CCT TGA CAT GTC TGG AAT CCT-3，的上游引物、DNA 序列為 5，-ACC ATT ACG TGC TGG CAA CAA AGG-3，的下游引物、DNA 序列為 5，- (FAM)-AAT CAG AAC ACA GGT GCT GCA TGG CT- (TAMRA)-3，的iTaqMan探針，各試劑分別密封包裝。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是還有密封包裝的內(nèi)含buffer、ExTagHS、dNTP Mixture、Mg2+的2X Premix EX Taq反應(yīng)液和/或無菌雙蒸水和/或DNA快速提取劑，DNA 快速提取劑由重量體積百分比為0. 9%的NaCl、重量體積百分比為0. 01%的SDS、體積百分 比為0. 1%的β -巰基乙醇、其余為水構(gòu)成。
3.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征是所說試劑盒內(nèi)的上游引物濃度為μ Μ、 下游引物濃度為4 μ M、TaqMan探針濃度為2 μ Μ。
4.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征是所說所說試劑盒內(nèi)包裝的試劑量是各試 劑一次試驗(yàn)量的倍數(shù)，各試劑的一次試驗(yàn)量為-4μ M上游引物0.4 μ L ；-4μΜ下游引物0. 4μ L ；-2 μ M TaqMan 探針 0. 4 μ L ；-2Χ Premix EX Taq 反應(yīng)液 IOyL;無菌雙蒸水6. 8 μ L ；DNA快速提取劑50 μ L。
全文摘要
本發(fā)明提供的FQ-PCR檢測(cè)嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌的試劑盒，內(nèi)有DNA序列為5’-TGGCCTTGACATGTCTGGAATCCT-3’的上游引物、DNA序列為5’-ACCATTACGTGCTGGCAACAAAGG-3’的下游引物、DNA序列為5’-(FAM)-AATCAGAACACAGGTGCTGCATGGCT-(TAMRA)-3’的TaqMan探針，各試劑分別密封包裝。本發(fā)明所說兩種菌中共有的16SrDNA而設(shè)計(jì)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明僅采用1對(duì)通用引物，即可同時(shí)檢測(cè)該2種致病菌，實(shí)現(xiàn)應(yīng)急預(yù)警和突發(fā)疾病處理方面實(shí)時(shí)、快速的效果。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102134597SQ201010608690
公開日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月28日
發(fā)明者呂敢堂, 王志錚, 王忠發(fā) 申請(qǐng)人:浙江海洋學(xué)院, 舟山市疾病預(yù)防控制中心