專利名稱：一種辣椒dn突變體及其載體的構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種辣椒DN-CaROPl突變體及其超表達載體的構(gòu)建及在基因工程中 的應(yīng)用，更具體地涉及到了該辣椒突變體在茄科植物煙草抗衰老基因工程中的應(yīng)用，屬于 植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物生長、發(fā)育和對環(huán)境應(yīng)答是其特定的遺傳系統(tǒng)和所處的環(huán)境條件相互作用下 通過復(fù)雜的生理生化過程實現(xiàn)的，總是受到較為嚴(yán)密的調(diào)控以使其產(chǎn)生足夠的光合產(chǎn)物并 合理的分配和使用這些光合產(chǎn)物，最終使植物在特定的環(huán)境下獲得最大的生存和傳衍的機 會。由鈣信使系統(tǒng)、植物內(nèi)源激素、磷酸激酶系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄因子等組成的信號傳導(dǎo)是植物生長、 發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境調(diào)控的重要環(huán)節(jié)，植物細(xì)胞可感知外界環(huán)境各種信息并進行信號的整合、 傳遞，最終將信號傳遞進入細(xì)胞核調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，使植物產(chǎn)生有利于其生存和傳衍 的生理生化反應(yīng)。辣椒(Capsicum annuum L.)是典型的茄科植物，也是具有重要經(jīng)濟價值的蔬菜。 辣椒的生產(chǎn)長期受到病害及其它各種逆境的困擾，對農(nóng)藥和化肥等的過分依賴導(dǎo)致的環(huán) 境、健康方面的隱患促使人們從遺傳改良上或從栽培管理上采取更加可持續(xù)的、切實可行 的對策，需要從分子水平上對辣椒等茄科植物的抗逆分子機制作更深入的剖析和了解。從 應(yīng)答逆境的信號傳遞入手是剖析辣椒抗逆分子機制的重要途徑，因此，辣椒抗逆信號傳遞 分子機制研究已經(jīng)引起了人們的高度重視，并在膜定位相關(guān)受體蛋白(An et al.,2008), 鈣信使相關(guān)蛋白(Choi et al. , 2009)、激酶(Chung et al.，2004)、轉(zhuǎn)錄因子(Lee at al.)等多個信號傳遞聯(lián)結(jié)開展了大量的研究，但人們的對辣椒抗逆及其與生長發(fā)育之間的 關(guān)系及其分子機制的認(rèn)識還相當(dāng)有限。鑒于ROP位于調(diào)控植物生長發(fā)育和抗逆信號傳遞途徑的上游，在植物生長發(fā)育及 對環(huán)境逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，從辣椒的ROP分離和功能鑒定入手可能是揭示 辣椒等茄科植物抗逆分子機制的重要契入點。自在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)ROP以來，已有越來越多研究發(fā)現(xiàn)ROP在植物體內(nèi)多種信號途 徑中起關(guān)鍵作用，每一成員可能作用于不同的途徑，幾種不同的途徑可能融合于同一個ROP (Jones et al.，2005 ；Yalovsky et al.，2008)，同時在植物中也存在ROP的功能冗余，導(dǎo) 致缺少某一種ROP時很少有明顯的表型變化，所以在研究ROP時很少只單獨采用基因功能 敲除法進行研究。研究ROP功能的重要手段之一就是構(gòu)建DN (dominant negative)和 CA (constitutive active)突變體，前者是使ROP鎖定在⑶P結(jié)合態(tài)形成失活型突變體， 后者是將ROP鎖定于GTP束縛態(tài)形成激活型突變體(Kost et al.，1999 ；Li et al.，1999 ； Lemichez et al. , 2001 ；Li et al.，2001)，這種突變體蛋白的表達打亂了內(nèi)源ROP蛋白的 激活態(tài)和失活態(tài)之間的平衡，有助于ROP蛋白的功能分析(Yang，2002)。目前尚未有利用DN 突變體研究植物抗衰老的文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)現(xiàn)提供了一種辣椒DN突變體及其超表達載體構(gòu)建和在基因工程中的應(yīng)用， 將大力促進煙草抗衰老基因工程的發(fā)展與應(yīng)用。本發(fā)明的辣椒DN突變體為DN-CaROPl突變體，該突變體基因至少含有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。構(gòu)建方法如下
將辣椒DN-CaROPl突變體與CaMV35S啟動子核心序列融合，構(gòu)建成DN-CaROPl的超表 達載體。所述辣椒DN-CaROPl是從UV-B輻射辣椒葉片的cDNA文庫中分離獲得的CaROPl 基因的DN突變體。構(gòu)建的超表達載體在茄科植物煙草抗衰老基因工程中的應(yīng)用。將所述超表達載體 轉(zhuǎn)化EHA105農(nóng)桿菌，采用葉盤遺傳轉(zhuǎn)化法侵染煙草得到轉(zhuǎn)基因煙草，提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗 衰老能力。本發(fā)明的顯著優(yōu)點
本發(fā)明的辣椒DN-CaROPl突變體在煙草中的超表達與野生型煙草相比，顯著提高了轉(zhuǎn) 基因煙草的抗衰老能力，該突變體在植物抗衰老基因工程中具有十分重要的應(yīng)用價值。


圖1為CaROPl中的保守功能域；
圖2為CaROPl與其它ROP家族成員的系統(tǒng)發(fā)育樹； 圖3為CaROPl定點突變圖； 圖4為入門載體pD0NR207 ； 圖5為超表達載體PK7WG2 ；
圖6為DN-CaROPl轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株的生長狀況； 圖7為DN-CaROPl轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株的葉片的葉綠素含量測定。
具體實施例方式1載體構(gòu)建過程 1. 1材料
辣椒品種為江西省蓮花縣的地方辣椒品種120#，由福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室 保存；烤煙品種K326品種由福建農(nóng)林大學(xué)病毒所惠贈；UV -B處理的辣椒葉片的cDNA 文庫(UV-B紫外線處理將植株置于離紫外燈(UV— B)下25cm處照射2h、6h、12h、24h和 48h，所有不同處理時間段處理的植物用液氮進行速凍處理后放入一 80°C冰箱保存)為福 建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室構(gòu)建(根據(jù)Irwitrogen公司試劑盒上的說明操作)，滴度高 達 IX IO7; CloneMiner cDNA Library Construction Kit和Gateway載體構(gòu)建試劑盒均 購自美國Irwitrogen公司。B型質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自北京博大泰克生物基因技 術(shù)有限責(zé)任公司，PCR相關(guān)dNTP、Taq酶、PCR buffer購自大連TaKaRa公司產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄及 Real-Time PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司。慶大霉素、卡那霉素、利福平、羧卞青霉素等 為Sigma公司產(chǎn)品。其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)化學(xué)純。
1.2 方法1. 2. 1辣椒CaROPl獲選基因的分離
首先以擬南芥ROP的氨基酸序列(NP_190698)作為探針序列，對GenBank中的 辣椒EST數(shù)據(jù)庫進行同源性比較，對獲得的辣椒EST用DNAMAN進行重疊群分析并確 定ROP保守域共有序列，根據(jù)共有序列，進行特異性引物設(shè)計與合成，引物序列為Pl 5，AGGCAACAACCTATTCAACAGCAG-3，；P2 :GTTCCAACAAGCACTATTGGGA
C-3’。然后采用基于PCR技術(shù)的96孔板法從cDNA文庫中篩選cDNA陽性克隆，測序 結(jié)果表明，該cDNA陽性克隆的長度為1149 bp，含有1個長度為197個氨基酸的開放讀碼框 (SEQ. NO. 2 所示)(DQ257288)。Blastp搜索結(jié)果表明，該cDNA陽性克隆的推定氨基酸序列中含有所有保守的ROP 功能域(Li et al.，2001)，與其它植物中所鑒定的小G蛋白的同源性高達70%以上(圖1)， 將該cDNA陽性克隆暫命名為CaROPl。進一步序列分析發(fā)現(xiàn)CaROPl的C端與其擬南芥等其 它植物中分離鑒定的ROP基因家族成員之間有比較大的多樣性。而以擬南芥ROP家族為參 照的系統(tǒng)發(fā)育樹分析雖可將CaROPl歸為類IV組(Winge et al.,2000; Zheng ang Yang, 2000b; Christensen et al.，2003)，但在系統(tǒng)發(fā)育樹的分枝中CaROPl與同組的其它成員 之間的距離明顯較遠(yuǎn)(圖2)，這些區(qū)別意味著CaROPl在功能及其分子機制上既存在與其它 同源基因相似之處，又可能具有自身特定的功能(Nibau et al.，2006)。1. 2. 2辣椒DN-CaROPl突變體的構(gòu)建
為了排除功能冗余給研究ROP功能帶來的影響，本發(fā)明構(gòu)建了 CaROPl的DN(dominant negative)突變體。在構(gòu)建突變體時，首先參考(Liet al.，1999; Valster et al. , 2000;Zheng and Yang, 2000)等的方法分別設(shè)計定點突變引物DN_F、DN-R,結(jié)合CaROPl基因內(nèi)側(cè)特異引物 (見 1. 2. 1 引物序列 Pl 和 P2)進行 PCR 擴增(94°C，5 min;94°C，30s, 55°C，30s, 68°C，Imi n, 35cycles ； 68°C，7min)產(chǎn)生T20N位點突變的PCR產(chǎn)物(這里的PCR產(chǎn)物即為DN突變體 DN-CaROPl )，T20N位點突變使ROP始終處于GDP結(jié)合態(tài)即得到DN突變體DN-CaROPl。定 點突變引物序列如下
DN-F 5' -CAATAAACAATTCTTGCCAAC-3‘ DN-R 5， -gttggcaagaAttgtttattg-3‘ 定點突變擴增方案如圖3。1. 2. 3辣椒DN-CaROPl基因超表達載體構(gòu)建
本發(fā)明采用gateway技術(shù)(Walhout et al.，2000)，構(gòu)建雙子葉植物轉(zhuǎn)基因用超表達載體。首先根據(jù)gateway載體構(gòu)建技術(shù)設(shè)計并合成內(nèi)側(cè)特異引物ROPF 5’- AAAA AGCAGGCTTTATGAGTGCTTCCAGGTT -3， ；ROPR 5’ -AGAAAGCTGGGTATCACAATATCGA GCAGGC-3， (第一輪)和外側(cè)接頭引物 aiiBl 5，-G GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T -3，； attm 5'-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT _3，(第二輪)。然后根據(jù)添加aiiB 接頭的兩輪PCR擴增程序，在DN-CaROPl基因兩側(cè)添加attB接頭，兩輪PCR擴增程序程序 如下
第一輪為了充分得到添加^iB接頭的PCR產(chǎn)物，在50μ1 PCR反應(yīng)體系中內(nèi)側(cè)特異 引物每種最多只能添加10 pmoles，擴增參數(shù)為預(yù)變性Imin 變性 15 s 退火 30 s 延伸 1 min
變性 15 s 退火 30 s 延伸 1 min
95° C 1 cycle 94° C 45° C
68° C 5 cycles
94° C 55° C
68° C 15-20 cycles 瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶質(zhì)量并膠回收純化aiiB-PCR產(chǎn)物。
I性火伸 ■變退延
2min 95° C 1 cycle 15 s 94° C 30s 55° C 1 min 68° C 10 cycles 第二輪轉(zhuǎn)移第一輪PCR產(chǎn)物10 μ 1至含有40pmoles aiiBl和aiiB2外側(cè)接頭引 物的40ylPCR混合液中，連續(xù)使用先低溫度退火再高溫特異退火的兩套擴增參數(shù)為然后通過BP反應(yīng)體系將目的基因克隆到入門載體pD0NR207(見圖4)上形成 入門克隆，PD0NR207-R0P,測序檢測目的基因序列無誤后，再通過LR反應(yīng)體系將目的基因 克隆轉(zhuǎn)移到超表達載體pk7WG2 (如圖5)，這樣也就將目的基因克隆于Ti質(zhì)粒的CaMV35S 啟動子下游，形成含目的基因的超表達載體，可實現(xiàn)其在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)的超表達，最后參 照分子克隆指南將含目的基因的超表達載體進一步轉(zhuǎn)化EHA105農(nóng)桿菌，以備用于煙草遺 傳轉(zhuǎn)化。BP反應(yīng)體系
PCR products100 ng
Vector (pD0NR207)30-50 ng
5X Buffer1 μ 1
BP enzyme mix0. 3 μ 1
Add water to total5 μ 1
25°C溫浴過夜，反應(yīng)結(jié)束后加入蛋白酶K，37°C消化lOmin，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感 受態(tài)細(xì)胞。LR反應(yīng)體系
Entry clone50-100 ng
Destination vector100 ng
LR Enzyme mix0. 5 μ 1
Add water to total5 μ 1
25°C溫浴過夜，反應(yīng)結(jié)束后加入蛋白酶K，37°C消化lOmin，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受 態(tài)細(xì)胞。煙草轉(zhuǎn)基因植株的獲得與抗性分析
2. 1煙草遺傳轉(zhuǎn)化及Tl代轉(zhuǎn)基因種子的收獲
采用葉盤遺傳轉(zhuǎn)化法(徐剛標(biāo)等，2007 ；植物基因工程(第二版))，利用1.2.3中所構(gòu) 建的含目的基因的超表達載體的農(nóng)桿菌，侵染2個月的無菌野生型煙草K326小苗的葉盤 (0. 5cmX0. 5cm)。在含卡那霉素(100 mg/L)的MS培養(yǎng)基上篩選抗性小苗，并對抗性小苗的基因組DNA進行PCR檢測，以確定卡那霉素篩選的可靠性。獲得一系列的轉(zhuǎn)基因株系，其 中得到DN 36株。所有的DN株系均用套袋自交收獲Tl代轉(zhuǎn)基因種子。利用Tl代轉(zhuǎn)基因 種子進行轉(zhuǎn)基因煙草表型分析與功能鑒定。2. 2轉(zhuǎn)基因煙草的抗衰老分析
將收獲的Tl代轉(zhuǎn)基因種子及K326野生型成熟種子分別用75%酒精表面滅菌lmin，無 菌水沖洗2遍后，用H2O2有效含量為10%的消毒液浸泡10 min，然后無菌水沖洗3_5遍后 用濾紙吸干，分別播種于含卡那霉素的無外源激素的MS培養(yǎng)基上，25° C下16 h光照/ 8 h黑暗培養(yǎng)。待煙草長到11葉期的時候離體暗培養(yǎng)煙草葉片，7d后轉(zhuǎn)DN-CaROPl植株的葉 片未見明顯變化，植株未見異常，而野生型植株則發(fā)生明顯的黃化甚至白化(圖6)，而且通 過葉片的葉綠素測定顯示，DN-CaROPl植株的整體含量為野生型植株的兩倍左右(圖7)。3 結(jié)果
本發(fā)明的辣椒DN-CaROPl基因的突變體在煙草中的超表達與野生型煙草相比能顯著 提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗衰老能力，該基因在植物抗衰老基因工程中具有十分重要的應(yīng)用價值。
權(quán)利要求
1.一種辣椒DN突變體，其特征在于所述辣椒DN突變體為DN-CaROPl突 變體，該突變體基因至少含有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.一種如權(quán)利1要求所述突變體的超表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于將辣椒 DN-CaROPl突變體與CaMV35S啟動子核心序列融合，構(gòu)建成DN-CaROPl的超表達載體。
3.一種含有權(quán)利要求1所述的突變體或由權(quán)利要求2或3所述的方法構(gòu)建的超表達載 體在茄科植物煙草抗衰老基因工程中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種辣椒DN突變體及其載體的構(gòu)建和應(yīng)用，所述辣椒DN突變體為DN-CaROP1突變體，該突變體基因至少含有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，構(gòu)建方法是將辣椒DN-CaROP1突變體與CaMV35S啟動子核心序列融合，構(gòu)建成DN-CaROP1的超表達載體，該超表達載體在茄科植物煙草抗衰老基因工程中的應(yīng)用。本發(fā)明的辣椒DN-CaROP1突變體在煙草中的超表達與野生型煙草相比，顯著提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗衰老能力，該突變體在植物抗衰老基因工程中具有十分重要的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/11GK102127544SQ20101060936
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月28日
發(fā)明者何水林, 劉志欽, 劉林林, 官德義, 牟少亮, 蔡漢陽, 邱愛連, 陳彥生 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)