專利名稱：一種以木質(zhì)纖維素為原料聯(lián)產(chǎn)乙醇和微生物油脂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，涉及一種以木質(zhì)纖維素為原料聯(lián)產(chǎn)乙醇和微生物油脂的方法，進(jìn)一步可將微生物油脂轉(zhuǎn)化為生物柴油，因而實(shí)現(xiàn)以木質(zhì)纖維素為原料聯(lián)產(chǎn)乙醇和生物柴油。
背景技術(shù)：
近年來，由于化石能源日趨枯竭以及其燃燒后產(chǎn)生的二氧化碳、氧化氮、氧化硫以及排放的黑煙等導(dǎo)致了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，開發(fā)可再生的替代能源，例如生物燃料，受到了世界各國的廣泛關(guān)注。其中，生物乙醇和生物柴油是最受關(guān)注的兩種生物燃料。生物乙醇可由玉米、小麥等淀粉質(zhì)原料經(jīng)過微生物發(fā)酵生產(chǎn)，但以糧食為原料生產(chǎn)生物乙醇會(huì)引起“與人爭糧、與糧爭地”等問題。采用來源廣泛、價(jià)格低廉的木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)乙醇是為人們看好的生物乙醇發(fā)展方向。木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源，據(jù)估計(jì)木質(zhì)纖維素原料占世界總生物質(zhì)量的50%。由木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇越來越引起世界各國的廣泛關(guān)注。但以木質(zhì)纖維素為原料大規(guī)模生產(chǎn)模纖維素乙醇仍面臨著多個(gè)問題，其中一個(gè)主要瓶頸是傳統(tǒng)酵母菌不能將五碳糖轉(zhuǎn)化為乙醇。五碳糖是半纖維素的主要水解產(chǎn)物，半纖維素通常占木質(zhì)纖維素原料組分總量的10% -40%。因此，這部分糖不加以利用將會(huì)造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。雖然可以通過基因工程改造酵母菌體使其可利用五碳糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，但該基因操作往往耗時(shí)耗力而且難以得到遺傳穩(wěn)定的基因工程菌種。 因此，如能將五碳糖轉(zhuǎn)化為其它高附加值產(chǎn)品，一方面可以獲得更高的收益，另一方面也可以推動(dòng)纖維素乙醇的發(fā)展。生物柴油是由生物油脂原料通過轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)生成的長鏈脂肪酸酯類化合物。生物柴油生產(chǎn)過程中原料的成本占總成本的70%以上。與生物乙醇的發(fā)展類似，生物柴油的大規(guī)模生產(chǎn)不可能以大豆油等食用油為原料，因此必須尋找一種可再生的油脂原料。雖然采用邊際土體種植木本油料植物以提供生物柴油生產(chǎn)的油脂原料，但木本油料植物生長緩慢、管理困難，而且受到地域、氣候等條件限制，短時(shí)間內(nèi)難以大規(guī)模開發(fā)和利用。而許多微生物，如酵母、霉菌和藻類等，在一定條件下能將碳水化合物轉(zhuǎn)化為油脂貯存在菌體內(nèi)，即微生物油脂，又叫單細(xì)胞油脂。大部分微生物油脂的脂肪酸組成和一般植物油相近，以C16 和C18系脂肪酸，如油酸、棕櫚酸、亞油酸和硬脂酸為主。微生物油脂發(fā)酵周期短，不受場地、季節(jié)、氣候變化等的影響，一年四季除設(shè)備維修外，都可連續(xù)生產(chǎn)；而且產(chǎn)油微生物菌種資源豐富，能利用和轉(zhuǎn)化各種農(nóng)林廢棄木質(zhì)纖維素原材料。因此，利用微生物轉(zhuǎn)化法獲取油脂具有非常大的發(fā)展?jié)摿?。更為重要的是，很多微生物可以將五碳糖，例如木糖轉(zhuǎn)化為油脂，而五碳糖是木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物的一個(gè)主要可發(fā)酵糖。傳統(tǒng)的釀酒酵母不能將其轉(zhuǎn)化為乙醇，而結(jié)合微生物油脂發(fā)酵，可以將木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化為乙醇和微生物油脂，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素聯(lián)產(chǎn)乙醇和生物柴油。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以木質(zhì)纖維素為原料聯(lián)產(chǎn)乙醇和微生物油脂的方法， 將原料中的六碳糖轉(zhuǎn)化為乙醇，而五碳糖轉(zhuǎn)化為微生物油脂，進(jìn)而可實(shí)現(xiàn)生物乙醇和生物柴油的聯(lián)產(chǎn)。本發(fā)明的目的是采用以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明提供的一種以木質(zhì)纖維素為原料聯(lián)產(chǎn)乙醇和微生物油脂的方法，主要包括如下步驟(1)木質(zhì)纖維素經(jīng)過預(yù)處理后得到易于酶解的纖維素固體和含糖水解液；(2)將步驟(1)得到的纖維素固體用于乙醇發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)過濾后得到固體物質(zhì)和乙醇醪液；(3)將步驟( 得到的乙醇醪液進(jìn)行乙醇回收，得到高濃度乙醇溶液和廢液1 ；(4)將步驟(1)得到的含糖水解液用于微生物油脂發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)過分離后得到油脂菌體和廢液2 ；(5)將步驟(3)中得到廢液1和步驟⑷中得到的廢液2循環(huán)用于步驟⑷中的微生物油脂發(fā)酵；(6)從步驟(4)中得到的油脂菌體中提取出微生物油脂，同時(shí)得到菌體殘?jiān)?7)將步驟⑵中得到的固體物質(zhì)和步驟(6)得到的菌體殘?jiān)M(jìn)行水解后循環(huán)用于步驟( 和/或步驟的發(fā)酵過程。優(yōu)選地，所述步驟(1)中木質(zhì)纖維素的預(yù)處理方法選自稀酸預(yù)處理、堿處理、高壓熱水預(yù)處理和/或有機(jī)溶劑預(yù)處理；優(yōu)選地，所述預(yù)處理過程溫度為60-220°C，處理時(shí)間為 30-180min。優(yōu)選地，所述步驟O)中纖維素固體用于發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是以分步糖化發(fā)酵或同步糖化發(fā)酵實(shí)現(xiàn)的。優(yōu)選地，所述步驟中含糖水解液用于微生物油脂發(fā)酵前先經(jīng)過脫毒和中和處理；優(yōu)選地，所述脫毒和中和處理是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的含糖水解液首先通過泡沫分離除去部分木質(zhì)素降解產(chǎn)物，剩余液體進(jìn)行濃縮后調(diào)節(jié)PH值至1. 0-3. 0，過濾除去不溶固體后采用活性炭吸附脫毒處理，過濾活性炭后調(diào)節(jié)PH值至6. 0-7. 0。優(yōu)選地，所述含糖水解液首先通過泡沫分離除去部分木質(zhì)素降解產(chǎn)物的處理?xiàng)l件如下通氣量為2-15升氣體/升溶液/小時(shí)，通氣時(shí)間為0. 5-3. 0小時(shí)；優(yōu)選地，所述剩余液體進(jìn)行濃縮的倍數(shù)為2-10倍；優(yōu)選地，所述活性炭脫毒處理?xiàng)l件如下溫度50-90°C，時(shí)間20-60min，活性炭用量為基于液體重量的0. 5_5%。優(yōu)選地，所述步驟(3)中微生物油脂發(fā)酵過程是通過批式限氮培養(yǎng)或批式補(bǔ)料培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)的；優(yōu)選地，所述批式補(bǔ)料培養(yǎng)是通過先進(jìn)行菌體生物量積累再流加過量含糖水解液進(jìn)行限氮培養(yǎng)的兩步過程實(shí)現(xiàn)的；更優(yōu)選地，所述限氮培養(yǎng)中的碳氮比為 50 1-400 1。優(yōu)選地，所述步驟(5)中將步驟(3)中得到廢液1和步驟⑷中得到的廢液2循環(huán)用于步驟(4)中的微生物油脂發(fā)酵前先經(jīng)過濃縮以提高碳源濃度至20-100g/L。優(yōu)選地，所述步驟(6)中從菌體中提取油脂是通過酸熱法、溶劑法和/或擠壓法實(shí)現(xiàn)的。優(yōu)選地，所述步驟(7)中菌體水解選自熱酸水解、熱堿水解、酶水解和/或水熱解
5中一種或多種。采用本發(fā)明方法制備得到的微生物油脂可用作生物柴油生產(chǎn)原料，用于脂肪酸甲酯(生物柴油)生產(chǎn)。通過本發(fā)明提供的方法可以將木質(zhì)纖維素原料轉(zhuǎn)化為乙醇和微生物油脂，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)乙醇和生物柴油兩種生物燃料的聯(lián)產(chǎn)。木質(zhì)纖維素原料來源廣泛、價(jià)格低廉，如簡單地進(jìn)行焚燒一方面造成資源浪費(fèi)，另一方面焚燒產(chǎn)生的煙霧會(huì)造成空氣污染。而將其轉(zhuǎn)化為乙醇和微生物油脂，不僅可以解決其焚燒帶來的環(huán)境污染問題，還可以將其高值化利用于生物燃料生產(chǎn)，部分替代化石燃料。本發(fā)明提供的以木質(zhì)纖維素原料聯(lián)產(chǎn)乙醇和微生物油脂方法具體詳述如下木質(zhì)纖維素原料，例如玉米秸稈、麥稈、甘蔗渣等，經(jīng)過預(yù)處理后可得到纖維素固體和含糖水解液。纖維素固體主要成分為纖維素、殘余半纖維素和木素。經(jīng)過預(yù)處理后纖維素固體中葡聚糖酶解性能顯著提高，采用分步糖化發(fā)酵或者同步糖化發(fā)酵的方法可將其中大部分葡聚糖轉(zhuǎn)化為乙醇。同時(shí)，纖維素固體中殘余半纖維素(主要是木聚糖)在酶解過程中也會(huì)發(fā)生水解生成木糖等五碳糖，但其不能被本領(lǐng)域熟知的野生型酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液通過過濾或離心除去殘余固體和菌體后得到乙醇醪液和固體物質(zhì)。 進(jìn)一步將乙醇醪液通過減壓蒸發(fā)或精餾得到高濃度乙醇溶液及廢液1。廢液1主要含有木糖等五碳糖、殘余乙醇和一些菌體代謝產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述預(yù)處理過程主要是破壞木質(zhì)纖維素原料的剛性致密結(jié)構(gòu)，以提高纖維素的酶解性能。同時(shí)，所述預(yù)處理過程也是將原料中的半纖維素部分水解為可發(fā)酵糖的過程。因此，優(yōu)選的預(yù)處理方法為稀酸預(yù)處理、堿處理、高壓熱水預(yù)處理或有機(jī)溶劑預(yù)處理。 所得含糖水解液中的可發(fā)酵糖以五碳糖為主，同時(shí)含有部分葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖等。正如前面所說，五碳糖不能被本領(lǐng)域熟知的野生型酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，但其可以被油脂酵母菌轉(zhuǎn)化為微生物油脂。但這部分含糖水解液中同時(shí)也存在乙酸、糠醛、羥甲基糠醛、木素降解產(chǎn)物等對菌體生長有抑制作用的化合物，因此需經(jīng)過脫毒處理。含糖水解液首先在泡沫分離裝置中通過泡沫分離法部分除去其中一些具有表面活性(主要是木質(zhì)素降解產(chǎn)物)的物質(zhì)，剩余液體再進(jìn)行減壓蒸發(fā)濃縮，調(diào)節(jié)PH值、過濾除去固體后采用一定量的活性炭吸附脫毒處理。過濾除去固體后再調(diào)節(jié)PH值至中性即可用于微生物油脂發(fā)酵。優(yōu)選地，含糖水解液首先經(jīng)過泡沫分離除去一部分木素降解產(chǎn)物可以降低后續(xù)活性炭的用量，從而降低脫毒成本。所述含糖水解液首先通過泡沫分離除去部分木質(zhì)素降解產(chǎn)物的過程是在通氣量為2-15升氣體/升溶液/小時(shí)、通氣時(shí)間為0. 5-3. 0小時(shí)的條件下進(jìn)行的；經(jīng)過泡沫分離后的剩余液體在減壓條件下進(jìn)行濃縮2-10倍后調(diào)節(jié)其pH值至 1. 0-2. 0。優(yōu)選地，所用的試劑選自氫氧化鈉、氫氧化鈣、碳酸鈣、氫氧化鉀和/或氨水中的一種或多種組合。隨后，采用一定量的活性炭進(jìn)行吸附脫毒處理。優(yōu)選地，所述活性炭脫毒過程中活性炭用量為基于液體重量的0. 5-5%，溫度為50-90°C，時(shí)間為20-60min。優(yōu)選地，含糖水解液經(jīng)過脫毒處理后用于微生物油脂的發(fā)酵過程是以一步限氮培養(yǎng)或者批式補(bǔ)料培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)以一步限氮培養(yǎng)發(fā)酵時(shí)，調(diào)節(jié)脫毒后的含糖水解液使其總糖濃度為20-100g/L，同時(shí)添加一定量的氮源使培養(yǎng)基中的碳氮比為50-400 1 ；所述氮源選自氨水、硫酸銨、酵母粉、蛋白胨、玉米漿、尿素、酵母菌體水解物等一種和/或多種組合。優(yōu)選地，所述微生物油脂發(fā)酵培養(yǎng)基中還添加其他一些化合物以促進(jìn)菌體生長和油脂積累，所述化合物包括硫酸鎂、氯化鈣、氯化鋅、氯化錳、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、吐溫-20、 吐溫-80、木質(zhì)素磺酸鈉、曲拉通100等中的一種或多種。當(dāng)采用補(bǔ)料批式培養(yǎng)時(shí)，微生物油脂發(fā)酵過程首先進(jìn)行菌體生物量的積累，此時(shí)培養(yǎng)基的主要成分與一步限氮培養(yǎng)類似，只是將碳氮比降低至5-50 1，以使菌體有更多的氮源用于細(xì)胞生長。一定時(shí)間后流加糖濃度為100-200g/L，碳氮比為200-400 1的培養(yǎng)基用于油脂的積累。微生物油脂發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)過過濾或離心收集油脂菌體，同時(shí)得到廢液2。廢液2 中還有未被利用的殘?zhí)?，其與廢液1 一起經(jīng)適當(dāng)濃縮至糖濃度為20-100g/L后回用于微生物油脂發(fā)酵。油脂菌體通過酸熱法、溶劑法或擠壓法提取出油脂后得到菌體殘?jiān)?。該菌體殘?jiān)c乙醇發(fā)酵液過濾或離心后的固體物質(zhì)經(jīng)水解后可用作氮源回用于乙醇發(fā)酵和油脂發(fā)酵。優(yōu)選地，所述水解過程為熱酸水解、熱堿水解、酶水解和/或水熱解，且在回用于發(fā)酵之前調(diào)節(jié)PH值至6. 0-7.0。微生物油脂提取出來后可采用本領(lǐng)域熟知的方法將其轉(zhuǎn)化為生物柴油。本發(fā)明提供的方法可以以木質(zhì)纖維素為原料，聯(lián)產(chǎn)生物乙醇和微生物油脂，進(jìn)而聯(lián)產(chǎn)乙醇和生物柴油兩種生物燃料。一方面，傳統(tǒng)釀酒酵母不能將木糖等五碳糖轉(zhuǎn)化為乙醇，這部分糖如果直接排放不僅造成資源浪費(fèi)，而且會(huì)造成環(huán)境污染。雖然目前可以通過基因工程方法改造酵母菌種使其能利用木糖等五碳糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，但這種改造往往耗時(shí)耗力且難以構(gòu)建成功且遺傳穩(wěn)定的菌株。另一方面，將這部分糖用于微生物油脂生產(chǎn)，不僅可以減少乙醇生產(chǎn)過程的廢液排放，同時(shí)可以將其高值化利用，為生物柴油產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供原料來源。同時(shí)，將乙醇發(fā)酵的酵母菌體和油脂提取后的菌體殘?jiān)夂罂色@得氨基酸等水解產(chǎn)物，這部分水解產(chǎn)物回用于乙醇發(fā)酵和油脂發(fā)酵過程，可以部分或完全取代額外添加的氮源，從而降低氮源成本。因此，本發(fā)明提供的方法既可以將低品位的木質(zhì)纖維素原料轉(zhuǎn)化為生物燃料，同時(shí)通過發(fā)酵殘?zhí)呛途w蛋白水解后循環(huán)利用，既減少了污染物的排放，又提高了產(chǎn)品附加值。


圖1為本發(fā)明提供的以木質(zhì)纖維素為原料聯(lián)產(chǎn)乙醇和微生物油脂的方法的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1所用木質(zhì)纖維原料為甘蔗渣，原產(chǎn)地為廣西南寧市。參照《制漿造紙分析與檢測》 (石淑蘭，制漿造紙分析與檢測，北京中國輕工業(yè)出版社，2003.)中相關(guān)測定方法對甘蔗渣組分進(jìn)行分析，分析結(jié)果為該甘蔗渣中，灰分含量為1. 38%，熱水抽提物為5. 16%，1% NaOH抽提物為34. 20 %，苯-醇抽提物為3. 17 %，纖維素含量為44. 98 %，綜纖維素含量為 76. 76 %，酸不溶木素含量為18. 45 %，酸溶木素含量為1. 80 %。甘蔗渣與硫酸溶液按10 1液固比混合后在160°C下預(yù)處理0. 5h。預(yù)處理后的纖維素固體經(jīng)分析，其中葡聚糖、木聚糖和總木素含量分別為56. 0%、2. 37%和 40.6%。該固體以15% (w/v)的固體含量添加含2g/L硫酸銨、5g/L磷酸二氫鉀、5g/L酵母浸粉、lg/L無水硫酸鎂和0. 2g/L氯化鈣的液體培養(yǎng)基后，先在121°C下滅菌20min，再采用20FPU/g固體的纖維素酶用量于50°C下預(yù)水解Mh，隨后按10%接種量接種釀酒酵母 (Saccharomices cerevisiae CICC 31014)，在 34°C下培養(yǎng) 24h，乙醇濃度為 15g/L。發(fā)酵液經(jīng)過濾得到固體物質(zhì)和乙醇醪液。乙醇醪液經(jīng)減壓蒸發(fā)并冷凝后，得到乙醇濃度為140g/L 的乙醇溶液和廢液1。廢液1中木糖濃度、乙醇濃度分別為3. 13g/L和0. 05g/L。實(shí)施例2所用甘蔗渣同實(shí)施例1。甘蔗渣與硫酸溶液按10 1液固比混合后在160°C下預(yù)處理0. ！。收集液相，簡單過濾后倒入泡沫分離裝置中，以IOL氣體/L液體/h的通氣量下從底部通入空氣， 觀察到泡沫產(chǎn)生。半個(gè)小時(shí)后停止通氣，收集非泡沫液(剩余液體)進(jìn)行減壓蒸發(fā)，濃縮10 倍后采用氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH至2.0。過濾除去固體物質(zhì)后采用基于液體重量2%的活性炭在 80°C下攪拌脫毒處理30min后過濾，得澄清液體。采用氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH至6. 0后，再次過濾，得含糖水解液。采用高效液相色譜測得其中葡萄糖濃度為10. 6g/L，木糖濃度為98. 5g/ L，阿拉伯糖濃度為4. 6g/L，乙酸濃度為1. lg/L。取部分該含糖水解液，加去離子水使其中葡萄糖和木糖的總濃度在65-70g之間。添加硫酸銨、酵母粉、磷酸二氫鉀和硫酸鎂至濃度分別為0. Ig/L、0. 75g/L、0.4g/L和1.5g/L。攪拌均勻后于115°C下滅菌15min。然后按 10%的接種量接入產(chǎn)油酵母菌(圓紅冬孢酵母，Rhodosporidium toruloides AS 2. 1389) 后，在30°C下培養(yǎng)5天。經(jīng)測定知發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛葹槟咎?6. lg/L，阿拉伯糖3.01g/L， 菌體生物量為13. 5g/L。發(fā)酵液經(jīng)離心分離后得到菌體和廢液2。菌體采用酸熱法提取出油脂，分析菌體中油脂含量為48. 5%，油脂得率為20. 5g油脂/IOOg消耗糖，同時(shí)得到菌體殘?jiān)?。?shí)施例3將實(shí)施例1中的廢液1和實(shí)施例2中的廢液2混合后，減壓蒸發(fā)，使其中木糖濃度達(dá)到50g/L。添加硫酸銨、酵母粉、磷酸二氫鉀和硫酸鎂至濃度分別為0. Ig/L、0. 75g/L、 0. 4g/L和1. 5g/L。攪拌均勻后于115°C下滅菌15min。然后按10%的接種量接入產(chǎn)油酵母菌(圓紅冬孢酵母，Rhodosporidium toruloides AS 2. 1389)后，在 30°C下培養(yǎng) 168h。經(jīng)測定知發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛葹槟咎?0. lg/L,阿拉伯糖5. 25g/L，菌體生物量為14. 5g/L。發(fā)酵液經(jīng)離心分離后得到菌體，并采用酸熱法提取出油脂后分析菌體中油脂含量為51. 2%, 油脂得率為18. 6g油脂/IOOg消耗糖，同時(shí)得到菌體殘?jiān)?。?shí)施例4所用含糖水解液同實(shí)施例2。將實(shí)施例1中發(fā)酵液經(jīng)過濾得到的固體物質(zhì)和實(shí)施例2和實(shí)施例3中油脂提取后得到的菌體殘?jiān)旌虾?，加入固體重量50倍的去離子水，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至10. 0，隨后在60°C下熱解證。過濾除去固體物質(zhì)后，分析知其中氮元素含量為45;3mg/L。將該含氮堿解液用硫酸調(diào)節(jié)pH至6. 0后添加等體積的含糖水解液。然后添加硫酸銨、磷酸二氫鉀和硫酸鎂至濃度分別為0. Ig/L、0. 4g/L和1. 5g/L。攪拌均勻后于115°C下滅菌15min。然后按 10%的接種量接入產(chǎn)油酵母菌(圓紅冬孢酵母，Rhodosporidium toruloides AS 2. 1389) 后，在30°C下培養(yǎng)120h。經(jīng)測定知發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛葹槟咎?0. lg/L，阿拉伯糖2. lg/L, 菌體生物量為13. 8g/L。發(fā)酵液經(jīng)離心分離后得到菌體，并采用酸熱法提取出油脂后分析菌體中油脂含量為43. 2%，油脂得率為17. 3g油脂/IOOg消耗糖。
實(shí)施例5所用甘蔗渣同實(shí)施例1。采用堿-過氧乙酸法對甘蔗渣進(jìn)行脫木素預(yù)處理。甘蔗渣與堿液按3 1的液固比混合，其中堿液中氫氧化鈉的質(zhì)量為甘蔗渣質(zhì)量的10%，攪拌均勻后置于90°C的水浴中保溫1.證。所得固體經(jīng)水洗滌至中性后，真空過濾至含水量為75%左右，再加入重量與初始甘蔗渣重量相等的過氧乙酸溶液，其中過氧乙酸的質(zhì)量為初始甘蔗渣質(zhì)量的15%，混合均勻后升溫至75°C并保溫3. Oh。預(yù)處理結(jié)束后采用清水洗滌纖維素固體至中性，經(jīng)分析，其中纖維素含量為78. 5%，半纖維素含量為20%，木素含量為1.5%。該纖維素固體以 15% (w/v)的固體含量添加含2g/L硫酸銨、5g/L磷酸二氫鉀、5g/L酵母浸粉、lg/L無水硫酸鎂和0. 2g/L氯化鈣的液體培養(yǎng)基后，先在121°C下滅菌20min，再采用20FPU/g固體的纖維素酶用量于50°C下預(yù)水解Mh，隨后按10%接種量接種釀酒酵母(Saccharomices cerevisiae CICC 31014)，在;34°C下培養(yǎng) 72h,乙醇濃度為 39. 5g/L，木糖濃度為 30. lg/L。 發(fā)酵液經(jīng)過濾得到固體物質(zhì)和乙醇醪液。乙醇醪液經(jīng)常壓精餾，塔頂?shù)玫劫|(zhì)量分?jǐn)?shù)為80% 的乙醇溶液，塔釜得到含木糖濃度為32g/L的廢液1。廢液1進(jìn)一步進(jìn)行減壓濃縮至木糖濃度為60g/L。再添加硫酸銨、酵母粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、氯化錳、氯化鋅和木質(zhì)素磺酸鈉至濃度分別為0. Ig/L、0. 75g/L、 0. 4g/L、l. 5g/L、0. Ig/L、0. 01g/L、0. Olg/L 禾口 0. 5g/L。攪拌均勻后于 115°C下滅菌 15min。 然后按10%的接種量接入產(chǎn)油酵母菌(圓紅冬孢酵母，Rhodosporidium toruloides AS2. 1389)后，在30°C下培養(yǎng)144h。經(jīng)測定知發(fā)酵液中殘余木糖濃度為16. lg/L，菌體生物量為15. 3g/L。發(fā)酵液經(jīng)離心分離后得到菌體，并采用酸熱法提取出油脂后知菌體中油脂含量為55. 2%，油脂得率為19. 2g油脂/IOOg消耗糖。實(shí)施例6所用甘蔗渣同實(shí)施例1，所用含糖水解液同實(shí)施例2。采用堿-過氧乙酸法對甘蔗渣進(jìn)行脫木素預(yù)處理。甘蔗渣與堿液按3 1的液固比混合，其中堿液中氫氧化鈉的質(zhì)量為甘蔗渣質(zhì)量的10%，攪拌均勻后置于90°C的水浴中保溫1.證。所得固體經(jīng)水洗滌至中性后，真空過濾至含水量為75%左右，再加入重量與初始甘蔗渣重量相等的過氧乙酸溶液，其中過氧乙酸的質(zhì)量為初始甘蔗渣質(zhì)量的15%，混合均勻后升溫至75°C并保溫3. Oh。預(yù)處理結(jié)束后采用清水洗滌纖維素固體至中性，經(jīng)分析，其中纖維素含量為78. 5%，半纖維素含量為20%，木素含量為1.5%。該纖維素固體以 20% (w/v)的固體含量添加含2g/L硫酸銨、5g/L磷酸二氫鉀、5g/L酵母浸粉、lg/L無水硫酸鎂和0. 2g/L氯化鈣的液體培養(yǎng)基后，先在121°C下滅菌20min，再采用30FPU/g固體的纖維素酶用量于50°C下預(yù)水解Mh，隨后按10%接種量接種釀酒酵母(Saccharomices cerevisiae CICC 31014)，在;34°C下培養(yǎng) 48h，乙醇濃度為 59. lg/L，木糖濃度為 36. 7g/L。 發(fā)酵液經(jīng)過濾得到固體物質(zhì)和乙醇醪液。乙醇醪液經(jīng)減壓精餾，塔頂?shù)玫劫|(zhì)量分?jǐn)?shù)為80% 的乙醇溶液，塔釜得到含木糖濃度為38. 9g/L的廢液1，進(jìn)一步將廢液1濃縮至木糖濃度為 100g/L后于115°C下滅菌15min，得濃縮糖液。含糖水解液稀釋至葡萄糖和木糖總濃度為60g/L，再添加硫酸銨、酵母粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、氯化錳、氯化鋅和木質(zhì)素磺酸鈉至濃度分別為0. Ig/L、0. 75g/L、 0. 4g/L、l. 5g/L、0. Ig/L、0. Olg/L,0. Olg/L 和 0. 5g/L。攪拌均勻后于 115°C下滅菌 15min，
9然后按10%的接種量接入產(chǎn)油酵母菌(圓紅冬孢酵母，Rhodosporidium toruloides AS2. 1389)后，在30°C下培養(yǎng)72h，菌體生物量為30g/L。隨后以一定流速流加濃縮糖液，繼續(xù)發(fā)酵96h。測得發(fā)酵液中菌體生物量為45g/L。發(fā)酵液經(jīng)離心分離后得到油脂菌體，并采用酸熱法提取出油脂后知菌體中油脂含量為40. 2%，油脂得率為16. 3g油脂/IOOg消耗糖。實(shí)施例7所用木質(zhì)纖維素原料為小麥秸稈。經(jīng)分析，其葡聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖、乙?；湍舅氐暮糠謩e為31. 2%,22. 8%,2. 71%U. 33%和24. 3%。400克小麥秸稈與乙醇濃度為60% (ν/ν)、ρΗ值為3. O的乙醇溶液按10 1的液固比混合后置于5L帶電動(dòng)機(jī)械攪拌的高壓釜中，升溫至200°C后保溫30min。溫度降至室溫后擠壓除去黑液，得到3. OL預(yù)處理黑液以及預(yù)處理固體。進(jìn)一步采用4L 60% (ν/ν)乙醇溶液洗滌預(yù)處理固體，并擠壓除去液體，得到4. 04L洗滌黑液和洗滌后固體。將預(yù)處理黑液與洗滌黑液混合后過濾，得7. OL黑液。洗滌后固體進(jìn)一步采用清水洗至中性，得到纖維素固體。經(jīng)分析，纖維素固體得率為42. 5%，其中葡聚糖、木聚糖和木素含量分別為74. 1%、 8. 57%禾口 12. 2%。150g纖維素固體與IOOOml含2g/L硫酸銨、5g/L磷酸二氫鉀、5g/L酵母浸粉、 lg/L 無水硫酸鎂和0. 2g/L氯化鈣的液體培養(yǎng)基混合后，先在121 °C下滅菌20min，再采用20FPU/g固體的纖維素酶用量于50°C下預(yù)水解24h，隨后按10%接種量接種釀酒酵母 (Saccharomices cerevisiaeCICC 31014)，在 34°C下培養(yǎng) 24h,乙醇濃度為 40. 9g/L，木糖濃度為10. 7g/L。發(fā)酵液經(jīng)過濾得到固體物質(zhì)和乙醇醪液。乙醇醪液經(jīng)減壓精餾，塔頂?shù)玫劫|(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液50ml，塔釜得到含木糖濃度為11. 6g/L的廢液1980ml。進(jìn)一步將廢液1濃縮，得木糖濃度為60g/L的濃縮糖液190ml。將乙醇預(yù)處理過程中得到的7. OL黑液進(jìn)行減壓精餾回收乙醇，塔釜得到濃縮黑液200ml。往該濃縮黑液中添加600ml去離子水，沉淀出乙醇木素，過濾后得到濾液702ml。 將該濾液與濃縮糖液混合后，用硫酸調(diào)節(jié)濾液pH至2. 0后，采用基于濾液重量3%的活性碳粉在80°C下攪拌處理60min，過濾活性碳粉后，得到870ml清亮透明液體，采用氫氧化鈣調(diào)節(jié)其pH至6. 0后過濾除去不溶物后，得到865ml糖液。經(jīng)分析知該糖液葡萄糖濃度為 5. 2g/L，木糖濃度為75. 5g/L，阿拉伯糖濃度為3. 2g/L，乙醇濃度為1. 3g/L。將該糖液稀釋至IOOOml后。再添加硫酸銨、酵母粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、氯化錳、氯化鋅和木質(zhì)素磺酸鈉至濃度分別為 0. Ig/L、0. 75g/L、0. 4g/L、l. 5g/L、0. Ig/L、0. 01g/L、0. Olg/L 和 0. 5g/L。攪拌均勻后于115°C下滅菌15min，然后按10%的接種量接入產(chǎn)油酵母菌(圓紅冬孢酵母，Rhodosporidium toruloides AS 2.1389)后，在 30°C下培養(yǎng) 120h，測得發(fā)酵液中生物量為18. 2g/L，殘余木糖濃度為12. 5g/L。將發(fā)酵液經(jīng)離心分離后得到油脂菌體，并采用酸熱法提取得微生物油脂8. 7g。實(shí)施例8所述微生物油脂發(fā)酵同實(shí)施例2。將提取的微生物油脂進(jìn)行脂肪酸組成分析，可知其中肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸的含量分別為1.6%、29.0%、0.8%、9. 3%、44.6%、 12. 6%和2. 2%。將該微生物油脂采用脂肪酶(Novozyme 435)催化與甲醇進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)制備生物柴油，脂肪酸甲酯(生物柴油)的得率大于95%。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此， 在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種以木質(zhì)纖維素為原料聯(lián)產(chǎn)乙醇和微生物油脂的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)木質(zhì)纖維素經(jīng)過預(yù)處理后得到易于酶解的纖維素固體和含糖水解液；(2)將步驟(1)得到的纖維素固體用于乙醇發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)過濾后得到固體物質(zhì)和乙醇醪液；(3)將步驟( 得到的乙醇醪液進(jìn)行乙醇回收，得到高濃度乙醇溶液和廢液1；(4)將步驟(1)得到的含糖水解液用于微生物油脂發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)過分離后得到油脂菌體和廢液2 ；(5)將步驟(3)中得到廢液1和步驟中得到的廢液2循環(huán)用于步驟中的微生物油脂發(fā)酵；(6)從步驟中得到的油脂菌體中提取出微生物油脂，同時(shí)得到菌體殘?jiān)?7)將步驟O)中得到的固體物質(zhì)和步驟(6)得到的菌體殘?jiān)M(jìn)行水解后循環(huán)用于步驟⑵和/或步驟(4)的發(fā)酵過程。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中木質(zhì)纖維素的預(yù)處理方法選自稀酸預(yù)處理、堿處理、高壓熱水預(yù)處理和/或有機(jī)溶劑預(yù)處理；所述預(yù)處理過程溫度為 60-220°C，處理時(shí)間為 30-180min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中纖維素固體用于發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是以分步糖化發(fā)酵或同步糖化發(fā)酵實(shí)現(xiàn)的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟中含糖水解液用于微生物油脂發(fā)酵前先經(jīng)過脫毒和中和處理；所述脫毒和中和處理是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的含糖水解液首先通過泡沫分離除去部分木質(zhì)素降解產(chǎn)物，剩余液體進(jìn)行濃縮后調(diào)節(jié)PH值至1.0-3.0，過濾除去不溶固體后采用活性炭吸附脫毒處理，過濾活性炭后調(diào)節(jié)pH值至 6. 0-7. O0
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述含糖水解液首先通過泡沫分離除去部分木質(zhì)素降解產(chǎn)物的條件如下通氣量為2-15升氣體/升溶液/小時(shí)，通氣時(shí)間為 0. 5-3. O小時(shí)；所述剩余液體進(jìn)行濃縮的倍數(shù)為2-10倍；所述活性炭脫毒處理的條件如下 溫度50-90°C，時(shí)間20-60min，活性炭用量為基于液體重量的0. 5_5%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中微生物油脂發(fā)酵過程是通過批式限氮培養(yǎng)或批式補(bǔ)料培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)的；所述批式補(bǔ)料培養(yǎng)是通過先進(jìn)行菌體生物量積累再流加過量含糖水解液進(jìn)行限氮培養(yǎng)的兩步過程實(shí)現(xiàn)的；所述限氮培養(yǎng)中的碳氮比為 50 1-400 1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟( 中將步驟C3)中得到廢液1 和步驟(4)中得到的廢液2循環(huán)用于步驟(4)中的微生物油脂發(fā)酵前先經(jīng)過濃縮以提高碳源濃度至20-100g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(6)中從菌體中提取油脂是通過酸熱法、溶劑法和/或擠壓法實(shí)現(xiàn)的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(7)中菌體水解選自熱酸水解、 熱堿水解、酶水解和/或水熱解中的一種或多種。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的方法制備得到的微生物油脂在生物柴油生產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以木質(zhì)纖維素為原料聯(lián)產(chǎn)生物乙醇和微生物油脂的方法，進(jìn)而可以實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素原料聯(lián)產(chǎn)乙醇和生物柴油。本發(fā)明提供的方法是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的(1)將木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理后得到的纖維素固體進(jìn)行乙醇發(fā)酵；(2)預(yù)處理過程中半纖維素水解產(chǎn)物用于微生物油脂發(fā)酵；(3)乙醇發(fā)酵液進(jìn)行乙醇回收后的廢液以及微生物油脂發(fā)酵后的廢液循環(huán)用于微生物油脂發(fā)酵；(4)乙醇發(fā)酵的酵母菌體和油脂提取后的菌體殘?jiān)?jīng)水解后用作氮源回用于乙醇發(fā)酵和微生物發(fā)酵過程。本發(fā)明提供的方法可以將低品位的木質(zhì)纖維素原料轉(zhuǎn)化為生物乙醇和生物柴油兩種生物燃料，同時(shí)可以減少乙醇生產(chǎn)中的廢水排放。
文檔編號(hào)C12P7/10GK102154381SQ201010609409
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者劉德華, 徐靜陽, 杜偉, 趙雪冰 申請人:清華大學(xué)