專利名稱：一種hbv基因的核苷酸突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因組學(xué)和分子生物學(xué)中有機(jī)生物分子領(lǐng)域，具體而言涉及HBV基因 的核苷酸突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
自然界大多數(shù)生物體的遺傳信息均包含在脫氧核糖核酸(DNA)中，人類全基因組 中30億個(gè)堿基，約4萬(wàn)個(gè)基因，分布在M對(duì)染色體上。每個(gè)基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯，編碼特異 的蛋白質(zhì)，調(diào)控生物體內(nèi)特定的生化反應(yīng)，發(fā)揮特異的生物學(xué)功能。DNA序列的改變，即基 因突變，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能的改變或缺失，進(jìn)而引起相關(guān)的遺傳疾病?；蛲蛔儼?DNA分子中發(fā)生堿基對(duì)的插入、缺失和改變(點(diǎn)突變)。研究表明許多疾病的發(fā)生，如血友病、地中海貧血、杜氏型肌營(yíng)養(yǎng)不良、亨廷頓舞 蹈癥、老年癡呆癥、糖尿病、肥胖癥、心血管疾病以及自身免疫等3000多個(gè)疾病與基因突變 密切相關(guān)。另外，近年來(lái)人們逐漸認(rèn)識(shí)到癌癥的發(fā)生發(fā)展也是基因累積突變的結(jié)果。在人類基因組中，約90%的差異是以單個(gè)核苷酸的差異體現(xiàn)出來(lái)的，主要由單個(gè) 堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所引起，這樣的差異位點(diǎn)稱作單核苷酸 多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism, SNP)。在人群中，這種變異的發(fā)生頻率至少要 大于1%，否則被認(rèn)為是點(diǎn)突變。SNP位點(diǎn)大多數(shù)為雙態(tài)，即在一個(gè)位點(diǎn)上僅有兩種表現(xiàn)形 式，并且在人類基因組中廣泛存在，平均每500-1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá) 300萬(wàn)個(gè)甚至更多。這些差異極有可能是造成個(gè)體差異的遺傳因素，因此發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)可廣 泛地應(yīng)用于遺傳標(biāo)記的研究、評(píng)估個(gè)體遺傳關(guān)系、評(píng)估物種進(jìn)化等研究領(lǐng)域。目前檢測(cè)SNP和基因突變的方法有許多種，如直接PCR測(cè)序、RFLP、基因芯片和熒 光定量PCR等。其中，RFLP分析只能檢測(cè)出在病毒總體中大于5%的突變株，但是對(duì)于每個(gè) 感興趣的突變，必須特別設(shè)計(jì)單獨(dú)的核酸內(nèi)切酶。針對(duì)某些突變的特異性內(nèi)切酶可能并不 存在，因此RFLP分析并不適用于所有的突變。基因芯片技術(shù)利用寡核苷酸微點(diǎn)陣，可以檢 測(cè)新發(fā)現(xiàn)的突變，但這種方法代價(jià)昂貴，沒(méi)有得到廣泛應(yīng)用。總之，上述這些方法不是費(fèi)時(shí) 費(fèi)力，靈敏度低，準(zhǔn)確度低，就是成本高，不適合大規(guī)模篩查。乙型肝炎病毒(HBV)及其基因全球有超過(guò)350萬(wàn)人患有慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染，每年由于感染HBV死亡 的人數(shù)有50萬(wàn)到120萬(wàn)，而約有75%的乙肝患者在亞洲。我國(guó)是HBV感染高發(fā)區(qū)，因此對(duì) 乙肝的治療刻不容緩。乙肝病毒是一種易高度變異的病毒，在其逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程中因RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn) 錄酶缺乏校正功能，可發(fā)生一個(gè)或多個(gè)核苷酸的變異。HBV-DNA可以在慢性持續(xù)性感染過(guò)程 中自然變異，也可以在免疫壓力下發(fā)生變異，甚至在各種抗病毒治療藥物誘導(dǎo)下變異。近年 來(lái)，核苷類藥物已成為乙型肝炎治療的主要方法之一，目前最常用的核苷類藥物是拉米夫 定(LAM)、阿德福韋酯(ADV)、恩替卡韋(ENT)、替比夫定(LdT)、恩曲他濱(FTC)和替諾福韋 酯(TDF)。由于HBV病毒復(fù)制能力極強(qiáng)，因此也極易產(chǎn)生耐藥，而一旦耐藥可能會(huì)有爆發(fā)性肝炎的危險(xiǎn)。因此對(duì)這六種核苷類藥物耐藥突變的檢測(cè)應(yīng)該有更加重要的臨床意義。HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的測(cè)序檢測(cè)目前本領(lǐng)域中已有使用測(cè)序分析進(jìn)行核苷酸突變位點(diǎn)檢測(cè)的方法，但是在現(xiàn)有的 方法中通常對(duì)低拷貝數(shù)的樣品無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)。因此，本領(lǐng)域中亟需新的檢測(cè)HBV基因的核 苷酸突變位點(diǎn)的方法，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)HBV基因的多個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)和突變型的靈敏、快速、 簡(jiǎn)便并且成本低廉的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一方面提供一種待測(cè)樣本中HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法， 包括如下步驟(1)針對(duì)HBV基因序列可能存在的突變位點(diǎn)在序列中的位置設(shè)計(jì)兩對(duì)巢式PCR擴(kuò) 增引物，用所述第一對(duì)PCR擴(kuò)增引物對(duì)待測(cè)樣本中的DNA進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，然后再以第 一輪PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用所述第二對(duì)PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；(2)對(duì)在步驟⑴中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；(3)對(duì)在步驟O)中得到的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，確定突變位點(diǎn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一對(duì)PCR擴(kuò)增引物為上游5，-TCCTGCTGGTGGCTCCAGT-3，(SEQID NO 1)；下游5，-GCAACGGGGTAAAGGTTCA-3，(SEQID NO 2)；所述第二對(duì)PCR擴(kuò)增引物為上游5，-TGGACTTCTCTCAATTTTCT-3，(SEQID NO 3)；下游5，-TGACAGACTTTCCAATCAAT-3，(SEQID NO :4)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述待測(cè)樣本選自血漿、血清、全血、純病毒培養(yǎng)物和 攜帶此類病毒的媒介生物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述測(cè)序方法為第一代測(cè)序方法；在更優(yōu)選的實(shí)施方 案中，所述測(cè)序方法為Sanger法；在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用3730測(cè)序儀(ABI)進(jìn)行 測(cè)序。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述測(cè)序方法為第二代測(cè)序方法；在更優(yōu)選的實(shí)施方 案中，所述測(cè)序方法為SOLEXA測(cè)序或4M測(cè)序法。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核苷酸突變位點(diǎn)包括rtL80I/V、rtl 169T、 rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F、rtA194T、rtS202I/G、 rtM204V/I 和 rtM250V/I/L。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在步驟1)和步驟2)之間純化所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；在更 優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(1)和步驟(2)之間用凝膠電泳切膠純化法純化所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明的第二方面提供一種HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒 包括兩對(duì)巢式PCR擴(kuò)增引物，可按照在本發(fā)明第一方面中描述的方法對(duì)HBV基因的核苷酸 突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在本發(fā)明試劑盒中
所述第一對(duì)PCR擴(kuò)增引物為上游5，-TCCTGCTGGTGGCTCCAGT-3，(SEQID NO 1)；下游5，-GCAACGGGGTAAAGGTTCA-3，(SEQID NO 2)；所述第二對(duì)PCR擴(kuò)增引物為上游5，-TGGACTTCTCTCAATTTTCT-3，(SEQID NO 3)；下游5，-TGACAGACTTTCCAATCAAT-3，(SEQID NO :4)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒還包括PCR試劑、測(cè)序試劑、陰性及陽(yáng)性 對(duì)照和說(shuō)明書等。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒檢測(cè)的核苷酸突變位點(diǎn)包括rtL80I/V、 rtl169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T/V,rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F、rtA194T、rtS202I/ G、rtM204V/I 和 rtM250V/I/L。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒檢測(cè)的待測(cè)樣本選自血漿、血清、全血、 純病毒培養(yǎng)物和攜帶此類病毒的媒介生物。本發(fā)明的第三方面提供本發(fā)明試劑盒用于檢測(cè)HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的用 途。本發(fā)明的第四方面提供SEQ ID NO :1_4的核苷酸序列。本發(fā)明的第五方面提供SEQ ID NO :1-4的核苷酸序列作為擴(kuò)增引物用于HBV基因 的核苷酸突變位點(diǎn)的檢測(cè)的用途。


在參考HBV S基因不同蛋白功能區(qū)分以及目前HIV聚合酶蛋白編號(hào)方式的基礎(chǔ) 上，2001年開(kāi)始HBV聚合酶編號(hào)自每個(gè)區(qū)域的第一氨基酸開(kāi)始的標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)系統(tǒng)，HBV聚合 酶可以分成末端蛋白、間隔區(qū)、逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)及核糖核酸酶4個(gè)區(qū)域，依次縮寫為TP、SD、RT、 RNase。逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)從高度保守的EDWGPCDEHG氨基酸序列開(kāi)始，E (谷氨酸)作為逆轉(zhuǎn)錄酶 區(qū)的第一個(gè)氨基酸，可以寫為rt El.例如rt L80V，其中rt代表逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)，數(shù)字1代表 該區(qū)第一個(gè)氨基酸，1前面的是野生型氨基酸的縮寫，后面是突變型氨基酸的縮寫。進(jìn)一步 詳細(xì)說(shuō)明各位點(diǎn)的附圖。附圖是對(duì)所述各種突變位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果。圖1中逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第80個(gè)氨基酸(即80位點(diǎn))野生型氨基酸為亮氨酸(簡(jiǎn)寫為 L)，在HBV病毒基因中對(duì)應(yīng)的密碼子為TTA或CTA，測(cè)序結(jié)果顯示該樣品的80位點(diǎn)的密碼子 一個(gè)核苷酸突變?yōu)镚，密碼子GTA對(duì)應(yīng)的氨基酸為纈氨酸(簡(jiǎn)寫為V)，故而寫成rt L80V.圖2中逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第169個(gè)氨基酸(即169位點(diǎn))野生型氨基酸為異亮氨酸(簡(jiǎn) 寫為I)，在HBV病毒基因中對(duì)應(yīng)的密碼子為ATA或ATT，測(cè)序結(jié)果顯示該樣品的169位點(diǎn)的 密碼子ATT，對(duì)應(yīng)的氨基酸未發(fā)生變化，故而寫成rt 11691.圖3中逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第173個(gè)氨基酸(即173位點(diǎn))野生型氨基酸為纈氨酸(簡(jiǎn)寫 為V)，在HBV病毒基因中對(duì)應(yīng)的密碼子為GTG，測(cè)序結(jié)果顯示該樣品的173位點(diǎn)為TTG，對(duì)應(yīng) 的氨基酸為亮氨酸(簡(jiǎn)寫為L(zhǎng))，故而寫成rt V173L.圖4中逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第180個(gè)氨基酸(即180位點(diǎn))野生型氨基酸為亮氨酸(簡(jiǎn)寫 為L(zhǎng))，在HBV病毒基因中對(duì)應(yīng)的密碼子為TTG或CTG，測(cè)序結(jié)果顯示該樣品的180位點(diǎn)的密 碼子一個(gè)核苷酸為C和A的嵌合峰，說(shuō)明HBV準(zhǔn)種中有少部分病毒的基因在該位點(diǎn)為突變型ATG，大部分為CTG，野生型與突變型同時(shí)存在，故而寫成rt L180L/M.圖5中逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第181個(gè)氨基酸(即181位點(diǎn))野生型氨基酸為丙氨酸(簡(jiǎn)寫 為A)，在HBV病毒基因中對(duì)應(yīng)的密碼子為GCT，測(cè)序結(jié)果顯示該該樣品的181位點(diǎn)為GTT，對(duì) 應(yīng)的氨基酸為纈氨酸(簡(jiǎn)寫為V)，故而寫成rt A181V.圖6中逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第184個(gè)氨基酸(即184位點(diǎn))野生型氨基酸為蘇氨酸(簡(jiǎn)寫 為T)，在HBV病毒基因中對(duì)應(yīng)的密碼子為ACT，測(cè)序結(jié)果顯示該樣品的184位點(diǎn)為CTT，對(duì)應(yīng) 的氨基酸為亮氨酸(簡(jiǎn)寫為L(zhǎng))，故而寫成rt T184L.圖7中逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第194個(gè)氨基酸(即194位點(diǎn))野生型氨基酸為丙氨酸(簡(jiǎn)寫 為A)，在HBV病毒基因中對(duì)應(yīng)的密碼子為GCT，測(cè)序結(jié)果顯示該樣品的194位點(diǎn)為GCT，未發(fā) 生變化，故而寫成rt A194A.圖8中逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第202個(gè)氨基酸(即202位點(diǎn))野生型氨基酸為絲氨酸(簡(jiǎn)寫 為S)，在HBV病毒基因中對(duì)應(yīng)的密碼子為AGT，測(cè)序結(jié)果顯示該樣品的202位點(diǎn)為AGT，未發(fā) 生變化，故而寫成rt S202S.圖9中逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第204個(gè)氨基酸(即204位點(diǎn))野生型氨基酸為甲硫氨酸(簡(jiǎn) 寫為M)，在HBV病毒基因中對(duì)應(yīng)的密碼子為ATG，測(cè)序結(jié)果顯示該樣品的204位點(diǎn)的密碼子 有四種可能GTG、ATT、ATG、GTT，說(shuō)明HBV準(zhǔn)種中有少部分病毒的基因在該位點(diǎn)野生型與突 變型同時(shí)存在，結(jié)合該位點(diǎn)常見(jiàn)密碼子為ATC、ATG、GTG,故而寫成rtM204M/V/I. 圖10中逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第236個(gè)氨基酸(即236位點(diǎn))野生型氨基酸為天冬氨酸(簡(jiǎn) 寫為N)，在HBV病毒基因中對(duì)應(yīng)的密碼子為AAC，測(cè)序結(jié)果顯示該樣品的236位點(diǎn)為ACC，對(duì) 應(yīng)的氨基酸為蘇氨酸(簡(jiǎn)寫為T)，故而寫成rt A236T.圖11中逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第250個(gè)氨基酸(即250位點(diǎn))野生型氨基酸為天冬氨酸(簡(jiǎn) 寫為M)，在HBV病毒基因中對(duì)應(yīng)的密碼子為ATG，測(cè)序結(jié)果顯示該樣品的250位點(diǎn)為GTG，對(duì) 應(yīng)的氨基酸為異亮氨酸(簡(jiǎn)寫為V)，故而寫成rt M250V.
具體實(shí)施例方式在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法包括如 下步驟(1)針對(duì)HBV基因序列可能存在的突變位點(diǎn)在序列中的位置設(shè)計(jì)兩對(duì)巢式PCR擴(kuò) 增引物，用所述第一對(duì)設(shè)計(jì)引物對(duì)待測(cè)樣本中的DNA進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，然后再以所述第 一對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用所述第二對(duì)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；(2)對(duì)在步驟⑴中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；(2. 1)以在步驟(1)中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用所述第二對(duì)設(shè)計(jì)引物的上游和 下游引物分別進(jìn)行測(cè)序擴(kuò)增反應(yīng)；(2. 2)對(duì)在步驟2. 1)中得到的測(cè)序擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；(3)對(duì)在步驟(2)中得到的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，確定突變位點(diǎn)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法包括如 下步驟(1)針對(duì)HBV基因序列可能存在的突變位點(diǎn)在序列中的位置設(shè)計(jì)兩對(duì)巢式PCR擴(kuò) 增引物，用所述第一對(duì)設(shè)計(jì)引物對(duì)待測(cè)樣本中的DNA進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，然后再以所述第一對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用所述第二對(duì)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；(2)對(duì)在步驟⑴中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；(2. 1)以在步驟(1)中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用所述第二對(duì)設(shè)計(jì)引物的上游和 下游引物分別進(jìn)行測(cè)序擴(kuò)增反應(yīng)；(2. 2)對(duì)在步驟2. 1)中得到的測(cè)序擴(kuò)增產(chǎn)物用3730測(cè)序儀直接進(jìn)行測(cè)序；(3)對(duì)在步驟(2)中得到的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，確定突變位點(diǎn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案采用3730直接測(cè)序方法檢測(cè)HBV耐藥位點(diǎn)，測(cè)序 過(guò)程中使用的試劑耗材相對(duì)簡(jiǎn)單且相對(duì)穩(wěn)定，并在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用了巢式PCR的方法，保 證低拷貝數(shù)樣品可以檢測(cè)出來(lái)，提高了檢測(cè)的靈敏度。此外，該檢測(cè)方法成本低廉，通量較 高，可以對(duì)現(xiàn)有的所有主要耐藥位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)并且可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)新的耐藥位點(diǎn)。適合用于 常規(guī)的臨床耐藥檢測(cè)。以下實(shí)施例以舉例的方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋，但并不意圖限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例采用3730測(cè)序技術(shù)對(duì)病人血清中HBV樣品進(jìn)行耐藥檢測(cè)，對(duì)于該突變位點(diǎn)的測(cè) 序檢測(cè)，我們檢測(cè)的耐藥位點(diǎn)包括rtL80I/V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、 rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F、rtA194T、rtS202I/G、rtM204V/I、rtM250V/I/L。首先根據(jù) NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中乙肝病毒基因組的序列(NCBI登錄號(hào)NC 003977)綜合比對(duì)后，選取保守的 區(qū)域設(shè)計(jì)了兩對(duì)巢式PCR引物。第一輪PCR擴(kuò)增引物為上游5，-TCCTGCTGGTGGCTCCAGT-3，(SEQID NO 1)；下游5，-GCAACGGGGTAAAGGTTCA-3，(SEQID NO 2)；第二輪PCR擴(kuò)增引物為上游5，-TGGACTTCTCTCAATTTTCT-3，(SEQID NO 3)；下游5，-TGACAGACTTTCCAATCAAT-3，(SEQID NO :4)。檢測(cè)步驟如下1.待測(cè)樣本中的HBV-DNA的提取按廠商說(shuō)明書操作，用TIANamp病毒基因組DNA提取試劑盒(購(gòu)自天根生化科技 有限公司)提取乙肝血清樣本HBV-DNA。2. PCR擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)在步驟(1)中提取的HBV-DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑的配置 見(jiàn)下表。PCR試劑均購(gòu)自takara公司，即寶生物工程有限公司，試劑包括IOx PCR緩沖液、 dNTP混合物、Taq (5U/ μ L)。引物均委托上海英俊生物有限公司合成。第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑的配置為
權(quán)利要求
1.一種待測(cè)樣本中HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法，包括如下步驟(1)針對(duì)HBV基因序列可能存在的突變位點(diǎn)在序列中的位置設(shè)計(jì)兩對(duì)巢式PCR擴(kuò)增引 物，用所述第一對(duì)PCR擴(kuò)增引物對(duì)待測(cè)樣本中的DNA進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，然后再以第一輪 PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用所述第二對(duì)PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；(2)對(duì)在步驟(1)中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；(3)對(duì)在步驟O)中得到的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，確定突變位點(diǎn)。
2.權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其中 所述第一對(duì)PCR擴(kuò)增引物為上游5，-TCCTGCTGGTGGCTCCAGT-3，(SEQ ID NO 1)； 下游5，-GCAACGGGGTAAAGGTTCA-3，(SEQ ID NO 2)； 所述第二對(duì)PCR擴(kuò)增引物為上游5，-TGGACTTCTCTCAATTTTCT-3，(SEQ ID NO 3)； 下游5，-TGACAGACTTTCCAATCAAT-3，(SEQ ID NO :4)。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述測(cè)序采用第一代測(cè)序方法，優(yōu)選地采用Sanger法， 特別優(yōu)選地采用3730測(cè)序儀(ABI)進(jìn)行測(cè)序。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述測(cè)序采用第二代測(cè)序方法，例如采用SOLEXA測(cè)序 法或4M測(cè)序法。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述待測(cè)樣本選自血漿、血清、全血、純病毒培養(yǎng) 物和攜帶此類病毒的媒介生物。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述核苷酸突變位點(diǎn)包括rtL80I/V、rtI169T、 rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F、rtA194T、rtS202I/G、 rtM204V/I 和 rtM250V/I/L。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在步驟⑴和步驟(2)之間純化所述PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物，優(yōu)選采用凝膠電泳后切膠純化法純化所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
8.一種待測(cè)樣本中HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒，包括兩對(duì)巢式PCR擴(kuò)增 引物，其中所述第一對(duì)PCR擴(kuò)增引物為上游5，-TCCTGCTGGTGGCTCCAGT-3，(SEQ ID NO :1)； 下游5，-GCAACGGGGTAAAGGTTCA-3，(SEQ ID NO :2)； 所述第二對(duì)PCR擴(kuò)增引物為上游5，-TGGACTTCTCTCAATTTTCT-3，(SEQ ID NO :3)； 下游5，-TGACAGACTTTCCAATCAAT-3，(SEQ ID NO :4)；該檢測(cè)試劑盒優(yōu)選地還包括PCR試劑、測(cè)序試劑、陰性及陽(yáng)性對(duì)照和說(shuō)明書等；其中所 述核苷酸突變位點(diǎn)優(yōu)選地包括 rtL80I/V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、rtN236T、 rtT184G/S/A/I/L/F、rtA194T、rtS202I/G、rtM204V/I 和 rtM250V/I/L· ；所述待測(cè)樣本優(yōu)選 地選自血漿、血清、全血、純病毒培養(yǎng)物和攜帶此類病毒的媒介生物。
9.權(quán)利要求8的試劑盒用于檢測(cè)HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的用途。
10.SEQ ID NO :1-4的核苷酸序列及其作為引物用于HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的檢 測(cè)的用途。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法，所述方法包括如下步驟(1)針對(duì)HBV基因序列可能存在的突變位點(diǎn)在序列中的位置設(shè)計(jì)兩對(duì)巢式PCR擴(kuò)增引物，用所述第一對(duì)PCR擴(kuò)增引物對(duì)待測(cè)樣本中的DNA進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，然后再以第一輪PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用所述第二對(duì)PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；(2)對(duì)在步驟(1)中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；(3)對(duì)在步驟(2)中得到的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，確定突變位點(diǎn)。本發(fā)明還公開(kāi)了利用上述方法進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102140534SQ20101060991
公開(kāi)日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者易鑫, 趙艷敏, 韓穎鑫 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司