專利名稱：一種培育蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
背景技術(shù)：
植物表皮蠟質(zhì)是覆蓋在植物表面最外層，不溶解于水而溶解于有機(jī)溶劑(氯仿等)的一類混合物的總稱，它們是由表皮細(xì)胞所合成和分泌，一般認(rèn)為表皮蠟質(zhì)具有阻止植物組織內(nèi)水分的非氣孔性散失、維持植物表面清潔與植物表面防水、防止植物被有害光線損傷、保護(hù)植物避免被病菌侵害和防止某些昆蟲的蠶食等功能。此外，表皮蠟質(zhì)的含量通常會(huì)影響表皮結(jié)構(gòu)的變化，而表皮結(jié)構(gòu)的變化通常會(huì)影響表皮對(duì)水分子的吸附和滲透，例如，表皮蠟質(zhì)的含量會(huì)影響水稻葉片GUS染色的效果，疏水性的表皮蠟質(zhì)含量越高，GUS染色液就越難被葉表皮吸附和滲透，水稻葉片GUS染色的效果就越差，導(dǎo)致只有葉片的切口邊緣很小一部分區(qū)域能被染色，其他大部分區(qū)域很難被染色。而蠟質(zhì)含量越少，就越有利于 ⑶S染色液的吸附和滲透，⑶S染色的效果就越好。同時(shí)對(duì)一些作物的研究結(jié)果表明，作物表皮蠟質(zhì)與作物水分利用效率、產(chǎn)量、收獲指數(shù)和角質(zhì)蒸騰等都有較好的相關(guān)性，有蠟質(zhì)表型的材料其抗旱節(jié)水性和產(chǎn)量都要高于無蠟質(zhì)表型的材料。水稻是世界三大糧食作物之一，但水稻生產(chǎn)需要大量的水，干旱已成為缺水地區(qū)水稻生產(chǎn)最大的限制性因子，因此耐旱相關(guān)基因的挖掘和抗旱品種培育，是目前穩(wěn)定糧食生產(chǎn)的最有效途徑。目前，利用正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)的方法，人們已經(jīng)從許多物種中克隆出了蠟質(zhì)相關(guān)基因并進(jìn)行了相關(guān)的功能分析。根據(jù)這些基因的功能可將它們分為以下幾類蠟質(zhì)合成基因，蠟質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)基因，蠟質(zhì)調(diào)控基因等。雖然這方面的研究取得了不少進(jìn)展，但目前與耐旱性狀相關(guān)的水稻葉片蠟質(zhì)缺失突變體卻鮮有報(bào)道，因此利用水稻葉片蠟質(zhì)缺失突變體克隆與葉片蠟質(zhì)形成相關(guān)的基因，并分析其功能，進(jìn)一步了解水稻葉表皮蠟質(zhì)與耐旱性之間的相關(guān)性，具有重要的理論意義和實(shí)際意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種與蠟質(zhì)形成相關(guān)的RNA分子。本發(fā)明所提供的RNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。表達(dá)上述RNA分子的重組干擾載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述重組干擾載體按照包括如下步驟的方法得到將SEQ ID NO 3所示DNA片段插入出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)，得到所述重組干擾載體。上述重組干擾載體中，所述出發(fā)載體為pCaml30X ；所述pCaml30X按照包括如下步驟的方法制備得到將CaMV35S啟動(dòng)子片段插入載體pCAMBIA1300的I3St I和Hind III的識(shí)別位點(diǎn)間，得到的重組載體記作pCaml30XM ；將 Nos終止子片段插入載體pCaml30XM的EcoR I和Mc I識(shí)別位點(diǎn)間，得到的重組載體即為 pCaml30Xo本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
本發(fā)明所提供的培育蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟使出發(fā)植物中的SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因的功能喪失，得到蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物。上述方法中，所述使出發(fā)植物中的SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因的功能喪失的方法為抑制出發(fā)植物中的SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因表達(dá)。上述方法中，所述抑制出發(fā)植物中的SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因表達(dá)的方法包括如下步驟向所述出發(fā)植物中導(dǎo)入上述任一所述重組干擾載體。上述方法中，所述蠟質(zhì)為植物表皮蠟質(zhì)；所述植物表皮蠟質(zhì)可為植物葉片表面蠟質(zhì)；上述方法中，所述植物為單子葉植物。所述單子葉植物為水稻。上述方法中，所述SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。SEQ ID NO :1所示蛋白或SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因在調(diào)節(jié)植物中蠟質(zhì)形成中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQ ID NO :1所示蛋白或SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因在培育耐旱植物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述應(yīng)用中，所述蠟質(zhì)為植物表皮蠟質(zhì)；所述植物表皮蠟質(zhì)可為植物葉片表面蠟質(zhì)；上述應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物。所述單子葉植物為水稻。上述應(yīng)用中，所述SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明基因影響葉片蠟質(zhì)形成，是一個(gè)控制葉片蠟質(zhì)形成的基因，具體是對(duì)葉片蠟質(zhì)形成起正調(diào)控作用。本發(fā)明基因?qū)α私馑救~片蠟質(zhì)形成的機(jī)制具有重要的應(yīng)用價(jià)值，可以探索將其用于水稻育種，通過基因工程手段改良水稻葉表皮性狀從而提高抗旱能力。此外，本發(fā)明的基因和蛋白控制表皮蠟質(zhì)的含量，表皮蠟質(zhì)的含量會(huì)影響水稻葉片GUS 染色的效果，降低表皮蠟質(zhì)的含量可以增強(qiáng)水稻葉片GUS染色的效果，因此可利用該基因來培育檢測(cè)外源基因在葉片表達(dá)情況的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)材料。


圖1為野生型與突變體osgll植株和葉片表型。圖2為野生型3037和突變體osgll的表型。圖3為野生型3037與突變體osgll的葉表皮屬性分析。圖4為干旱對(duì)野生型3037與突變體osgll的影響。圖5為互補(bǔ)表達(dá)載體的構(gòu)建。圖6為野生型與pGLlRNAi轉(zhuǎn)基因植株及其葉片表型。圖7為野生型日本晴(WT)和轉(zhuǎn)pGLlRNAi植株OsGLl基因表達(dá)量。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實(shí)施例1、基因的發(fā)現(xiàn)1、水稻蠟質(zhì)缺失突變體osgll的表型分析水稻蠟質(zhì)缺失突變體osgll是野生型3037的自然突變體。在正常情況下，突變體 osgll與野生型3037相比沒有明顯差異(圖1A)，但在在下雨天或者人工淋浴的情況下，突變體osgll的葉片表現(xiàn)出高度親水的表型。在野生型3037中，由于葉表皮蠟質(zhì)的大量存在，水分子往往會(huì)在葉表面聚合形成球形狀的水珠，只要稍微抖動(dòng)一下葉片，都會(huì)導(dǎo)致葉片上這些水珠的滴落。而在突變體osgll中，由于葉片高度親水，水分子將會(huì)均勻散布在整個(gè)葉表面而不形成水珠(圖1B)。圖1中，左為野生型，右為突變體。2、突變體osgll的電鏡觀察分析通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型3037相比(圖2A，B)，突變體osgll葉表皮近軸端與遠(yuǎn)軸端的蠟質(zhì)嚴(yán)重減少(圖2D，E)，而透射電鏡的研究結(jié)果表明，野生型3037表皮膜可分為兩層結(jié)構(gòu)，最外層為透明層，最內(nèi)層為非透明層(圖2C)，與野生型3037相比，突變體 osgll葉表皮膜變薄，最外層的透明層消失，只含有最內(nèi)層的非透明層(圖2F)。圖2中，A 為野生型3037的遠(yuǎn)軸端葉片表面；B為為野生型3037的近軸端葉片表面；C為野生型3037 的表皮膜結(jié)構(gòu)；D為突變體osgll的遠(yuǎn)軸端葉片表面；E為為突變體osgll的近軸端葉片表面；F為突變體osgll的表皮膜結(jié)構(gòu)。P 乳突細(xì)胞；CW 細(xì)胞壁；TL :透明層；OL 非透明層。3、水稻蠟質(zhì)缺失突變體osgll葉表皮屬性的分析葉表皮屬性分析的檢測(cè)包括葉綠體滲透實(shí)驗(yàn)和葉片的水分散失實(shí)驗(yàn)，對(duì)于葉綠體滲透實(shí)驗(yàn)，主要在暗室中進(jìn)行，我們以抽穗期每個(gè)水稻分蘗的倒三葉為研究對(duì)象，將葉片切割成3厘米長(zhǎng)并侵泡在濃度為80%的30毫升乙醇中，在1-12小時(shí)內(nèi)，每隔1小時(shí)測(cè)定葉綠素的含量，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的葉綠素滲透率，以該時(shí)間點(diǎn)滲透出來的葉綠素含量占第12個(gè)小時(shí)滲透出來的葉綠素含量的百分比表示。對(duì)于水分散失實(shí)驗(yàn)，也是在暗室中進(jìn)行，也是以抽穗期每個(gè)水稻分蘗的倒三葉為研究對(duì)象，在O小時(shí)，0. 5小時(shí)，1小時(shí)，1. 5小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)， 4小時(shí)，5小時(shí)，6小時(shí)，7小時(shí)，8小時(shí)這11個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別測(cè)定樣品的重量，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的水分散失率，以該時(shí)間點(diǎn)損失的水分重量占最初樣品重量的百分比表示。水稻蠟質(zhì)缺失突變體osgll與野生型3037的葉綠體滲透率、水分散失率的測(cè)定結(jié)果如圖3所示，表明蠟質(zhì)缺失突變體osgll與野生型3037相比，葉綠體滲透型降低，而水分散失率增加。圖3中，A為野生型3037與突變體osgll的葉綠體滲透實(shí)驗(yàn)；B為野生型3037與突變體osgll的水分散失實(shí)驗(yàn)。每個(gè)樣品重復(fù)三次。W:野生型3037 ;M:突變體osgll。4、水稻蠟質(zhì)缺失突變體osgll的干旱實(shí)驗(yàn)分析將野生型3037和突變體osgll種在同一個(gè)盆里，在正常情況下生長(zhǎng)6周后，停止給他們澆水，干旱持續(xù)12天后再給他們澆水，觀察他們表型的變化。結(jié)果表明，野生型3037 的大部分葉片能夠恢復(fù)正常，而突變體osgll只有少部分葉片能夠恢復(fù)正常(圖4)，這表明突變體osgll對(duì)于干旱更敏感。圖4中，A為干旱實(shí)驗(yàn)開始之前的野生型3037(左)與突變體osgll(右)；B為干旱實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的野生型3037(左)與突變體osgll(右)。5、水稻蠟質(zhì)缺失突變體osgll的遺傳分析水稻蠟質(zhì)缺失突變體osgll和粳型野生型材料中花11，二品種雜交得Fl代，F(xiàn)l代自交產(chǎn)生F2代，對(duì)F2代植株進(jìn)行表型鑒定，中花11和osgll分別作為正、負(fù)對(duì)照，F(xiàn)2代植株的表型鑒定結(jié)果如表1所示，表明水稻蠟質(zhì)缺失這一性狀符合單基因控制遺傳規(guī)律。表1中，正常株數(shù)是指具有中花11表型的株數(shù)，蠟質(zhì)缺失osgll株數(shù)是指具有osgll表型的株數(shù)。表1水稻蠟質(zhì)缺失突變體osgll的遺傳分析
權(quán)利要求
1.一種RNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
2.表達(dá)權(quán)利要求1所述RNA分子的重組干擾載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組干擾載體，其特征在于所述重組干擾載體按照包括如下步驟的方法得到將SEQ ID NO :3所示DNA片段插入出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)，得到所述重組干擾載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的重組干擾載體，其特征在于所述出發(fā)載體為pCaml30X；所述pCaml30X按照包括如下步驟的方法制備得到將CaMV35S啟動(dòng)子片段插入載體pCAMBIA1300的I3St I和Hind III的識(shí)別位點(diǎn)間，得到的重組載體記作pCaml30XM ；將 Nos終止子片段插入載體pCaml30XM的EcoR I和Mc I識(shí)別位點(diǎn)間，得到的重組載體即為 pCaml30Xo
5.一種培育蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟使出發(fā)植物中的SEQID NO 1所示蛋白的編碼基因的功能喪失，得到蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述使出發(fā)植物中的SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因的功能喪失的方法為抑制出發(fā)植物中的SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因表達(dá)；所述抑制出發(fā)植物中的SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因表達(dá)的方法包括如下步驟 向所述出發(fā)植物中導(dǎo)入權(quán)利要求2-4中任一所述重組干擾載體。
7.SEQ ID NO :1所示蛋白或SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因在調(diào)節(jié)植物中蠟質(zhì)形成中的應(yīng)用；SEQ ID NO :1所示蛋白或SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因在培育耐旱植物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一所述的方法或應(yīng)用，其特征在于所述蠟質(zhì)為植物表皮蠟質(zhì)；所述植物為單子葉植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一所述的方法或應(yīng)用，其特征在于所述植物表皮蠟質(zhì)為植物葉片表面蠟質(zhì)；所述單子葉植物為水稻。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-9中任一所述的方法或應(yīng)用，其特征在于所述SEQID N0:1所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物的方法。該培育蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟使出發(fā)植物中的SEQ ID NO1所示蛋白的編碼基因的功能喪失，得到蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明基因影響葉片蠟質(zhì)形成，是一個(gè)控制葉片蠟質(zhì)形成的基因，具體是對(duì)葉片蠟質(zhì)形成起正調(diào)控作用。本發(fā)明基因?qū)α私馑救~片蠟質(zhì)形成的機(jī)制具有重要的應(yīng)用價(jià)值，可以探索將其用于水稻育種，通過基因工程手段改良水稻葉表皮性狀從而提高抗旱能力。此外，本發(fā)明的基因和蛋白控制表皮蠟質(zhì)的含量，表皮蠟質(zhì)的含量會(huì)影響水稻葉片GUS染色的效果，降低表皮蠟質(zhì)的含量可以增強(qiáng)水稻葉片GUS染色的效果，因此可利用該基因來培育檢測(cè)外源基因在葉片表達(dá)情況的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)材料。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102168083SQ20101061060
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者唐丁, 李明, 王克劍, 程祝寬, 覃寶祥 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所