專利名稱：雅致放射毛霉zgb1及其在微生物合成atp中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株能夠合成ATP的新菌株一雅致放射毛霉(Actinomucor elegans) ZGBl，及其在微生物合成ATP中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
ATP即腺苷三磷酸，作為一種生化藥物，已被用于肌肉萎縮、心肌梗塞、肝炎等和各種急救病癥的治療或輔助治療。目前國內(nèi)外主要采用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)ATP，具體有采用腺苷和腺嘌呤為前體原料的兩種主要生產(chǎn)方法。已經(jīng)公開報(bào)道的采用腺嘌呤為前體原料的微生物轉(zhuǎn)化合成ATP的方法主要有日本協(xié)和發(fā)酵公司采用產(chǎn)氨桿菌(Cornebacterium ammoniagenes)轉(zhuǎn)化合成 ATP (Biosci. Boitechnol. Biochem.，65(3)，644 650，2001)；國內(nèi)中山大學(xué)采用啤酒酵母轉(zhuǎn)化合成ATP (中山大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版，3，15 沈，1975)；詹谷宇等采用生香毛霉(Mucor armaticus)等7株毛霉菌轉(zhuǎn)化合成ATP (西北大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版，02，118 129，1980) 等，至今還沒有以腺嘌呤為前體原料采用雅致放射毛霉菌種轉(zhuǎn)化合成ATP的文獻(xiàn)或?qū)＠麍?bào)道。腺嘌呤目前已經(jīng)采用化學(xué)合成法大量生產(chǎn)，因此采用腺嘌呤為前體原料的生產(chǎn)方法，具有原料價(jià)格較低、來源豐富、合成ATP的理論轉(zhuǎn)化率較高等優(yōu)點(diǎn)，以毛霉轉(zhuǎn)化合成ATP 還具有菌體培養(yǎng)基原料簡單，菌體容易分離等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一株篩選到的能夠合成ATP的新菌株一雅致放射毛霉 (Actinomucor elegans) ZGBl，及其在微生物合成ATP中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是雅致放射毛霉(Actinomucor elegans) ZGB1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所， 郵編100101，保藏編號=CGMCC No. 4313，保藏日期:2010年11月8日。本申請發(fā)明人通過菌種培養(yǎng)搖瓶轉(zhuǎn)化，然后用紙電泳法測定轉(zhuǎn)化液中ATP含量的方法，篩選具有合成ATP能力的微生物時(shí)，篩選到了該菌種。在根據(jù)平板菌落特征、菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子形態(tài)等對其鑒定的基礎(chǔ)上，結(jié)合18S rDNA序列分析對比(測序公司生工生物工程(上海)有限公司)，確定該菌為雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)。至今未見有以腺嘌呤為前體原料采用雅致放射毛霉菌種轉(zhuǎn)化合成ATP的文獻(xiàn)或?qū)＠麍?bào)道。本發(fā)明菌株的18S rDNA部分序列(SEQ ID No. 1)如下TAGGATTCCTCGTTGAGAGCAATAATTACAATGCTCTATCCCCAGCACGATGAAGTTTCAAAAGTTTAC CCAGACCTTCCGGCCAAGGTTATAAACTCGCTGACTTCATCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGC ATCACAGACCTGTTATTGCCTAAAACTTCCTTCGGCTTGAAGCCGATAGTCTCTCTAAGAAGCCAGATAGATAAATC TATTCACCAACTAAAAAGTTGGCCTGCCTATTTAGCAGAATAAGGTCTCGTTCGTTATCGGAATTAACCAGACAAAT
3CACTCCACGAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCATAGAATCTAGAAAGAGCTTTCAATCTGTCAATCCTTACT ATGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACTCCTGGTGGTGCCCTTCCGTC AATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGTCCCATACTCCCCCCAGAACCCAAAAACTTTACTTTCGCTAAGATGCTGAGC CAGTCATAATAAACAGGCCCAATCTCTAGTCGGCATAGTTTGTGGTTAAGACTACGACGGTATCTAATCGTCTTCGA TCCCTTAACTTTAGACCTTGATCAATGAAAACGTCCTGGGTCAAATGCTTTCGCAGTAGTTTGTCTTCGGTCAATCC AAGAATTTCACCTCTAGCGACCAAATACAAATGCCCCCAACCGTTTCTATTCATCATTACTCAAGTTCCTGAACCAA CGAAATAGGGACTAGAGTCATATTTCATTATTCCATGCTAACACATTCAAGCTTGAAAGCCTGCTTTAAACACTCTG ATTTGCTCATGGTAATCATTTGGCTAGAGACTATAGGCGACCGAAGCCACCCATAGCATAACCAAATACAAAAGCCT CGGCAGAAGCGAGCTTGATCAATGAAGACCAGGCCACCTCGCCTAAAGGCTAAAGTTTGACTACGGACGTTTTAACT GCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGATCCT CGTTAAGGGATTTAAATTGTACTCATTCCAATTGCAAGACCTTAAAGGCCCTGCATTGTTATTTATTGTCACTACCT CACCATGTCGGTATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCC GGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGTAGGCATTGTAAGCCTCTATCTTACAATCTCAACCATGATAGGGC AGAAAATCGAGTGGACCGTCGCCAGCACAAGGCCATGCGATCCGCTTAATTATTATGAATCACCAAGGGAAACTGGT TTTACCCAGCGTTGGCTTTATCTAATAAGTGCACCCCTTCCGAAGTCAGGGCTTTTTTGCATGTATTAGCTCTAGAA TTACCACGGTTATCCAAGTAGTAAAGAATATGTCACGTAGATCATAACTGATTAATGAGCCATCGCA。ZGBl菌株形態(tài)特征及培養(yǎng)方法1.形態(tài)特征菌落形態(tài)(參見圖1 圖4)與一般毛霉近似，棉絮狀，氣生菌絲高度超過lcm， 初期為純白色，后逐漸轉(zhuǎn)為灰黃色，有匍匐菌絲和不發(fā)達(dá)的假根，孢囊梗直立，直徑10. 5 26. 3 μ m。主枝頂端有一較大的孢子囊，其下常有3 8個(gè)輪生分枝，每一分支頂端都生有孢子囊。孢子囊呈球形或洋梨形，表面絨毛狀，成熟后呈黑褐色，大小不一，直徑30 70 μ m0囊壁易消解，有囊領(lǐng)，囊軸圓形、卵圓形或梨形，表面光滑，大小不均，直徑Q5.0 60. 0) X 5 55. 0) μ m，大者可達(dá)67. 3 66. Iym0孢囊孢子呈短卵形和球形、略透明、 表面光滑，大小不均，大小為(10. 5 21. 0) X (7. 9 24. 0) μ m,大者可達(dá)28. 9X28. 9 Um0 孢囊孢子萌發(fā)時(shí)膨大，呈典型的單極萌發(fā)。能形成厚垣孢子。該菌最適生長溫度觀1，371生長受抑制，401幾乎不生長。2.采用的培養(yǎng)基固體斜面培養(yǎng)基1 馬鈴薯、葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。固體斜面培養(yǎng)基2:葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，瓊脂 20g/L，溶劑為水，pH 6. 0 6. 5。液體種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，溶劑為 7jC, pH 6· 0 6· 5。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖30 50g/L，酵母膏1 6g/L，玉米漿5 20g/L，MgSO4 ·7Η20 0· 5 2g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 05 0. 5g/L, NH4Cl 1 5g/L，K2HPO4 · 3H20 1 5g/L，溶劑為水，pH 6. 0 6. 5。3.培養(yǎng)條件經(jīng)^°C、3 4d培養(yǎng)的斜面菌種制成孢子懸液，以10% (V/V)的接種量接入液體種子培養(yǎng)基中，置于^°C，160r/min旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)12h。以10% (V/V)的接種量將液
4體種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于，160r/min旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)12h，發(fā)酵結(jié)束。本發(fā)明還涉及所述的雅致放射毛霉ZGBl在微生物合成ATP中的應(yīng)用。具體的，所述應(yīng)用為以腺嘌呤為底物，以雅致放射毛霉ZGBl發(fā)酵獲得的菌體為酶源，于25 35°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)6 M小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中ATP產(chǎn)物含量可以達(dá)到10g/L以上。按常規(guī)離交、濃縮、結(jié)晶等分離純化方法處理即可得到所述產(chǎn)物ATP。優(yōu)選的，所述應(yīng)用方法如下(1)雅致放射毛霉ZGBl接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，28 30°C培養(yǎng)12 18小時(shí)，發(fā)酵液分離收集菌體，清洗、濾干后40 80°C恒溫干燥2 4小時(shí)，得到雅致放射毛霉ZGBl菌體； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖30 50g/L，酵母膏1 6g/L，玉米漿5 20g/L， MgSO4 · 7Η20 0· 5 2g/L, FeSO4 · 7H20 0. 05 0. 5g/L, NH4Cl 1 5g/L, K2HPO4 · 3H20 1 5g/L，pH 6. 0 6. 5 ；發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液經(jīng)過濾收集的菌體先經(jīng)通透化處理(即恒溫干燥箱40 80°C干燥處理2 4h)。由于毛霉菌過濾收集菌體非常方便，使用該通透化處理方法具有操作簡便、轉(zhuǎn)化活性高的特點(diǎn)，由于不需要在轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中添加二甲苯等處理方法， 還具有環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)；(2)取步驟(1)雅致放射毛霉ZGBl菌體與底物配制轉(zhuǎn)化反應(yīng)液，于30 35°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)6 M小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液經(jīng)后處理得到所述ATP ；所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)液初始組成如下葡萄糖 60 90g/L, Na2HPO4 · Iffl2O 30 90g/L, MgCl2 · 6H203 6g/L，腺嘌呤2 6g/L，毛霉菌體50 100g/L。反應(yīng)Mi后，每隔池用紙電泳法跟蹤檢測轉(zhuǎn)化情況， 適時(shí)終止反應(yīng)。反應(yīng)液中的ATP可以達(dá)到10g/L以上，已有毛霉菌轉(zhuǎn)化文獻(xiàn)報(bào)道最高ATP 產(chǎn)率在8g/L左右。轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)物分析及計(jì)算方法取樣5 20 μ L，點(diǎn)樣在20mm寬的普通濾紙上，以pH 2. 5的檸檬酸-檸檬酸鈉溶液為緩沖液，電壓400V，電泳時(shí)間為30 60min。電泳結(jié)束后，用電吹風(fēng)吹干濾紙，在紫外分析儀下描出與標(biāo)準(zhǔn)ATP斑點(diǎn)相同位置的產(chǎn)物斑點(diǎn)，將斑點(diǎn)剪成2mm左右的細(xì)條，用5ml 0. 01mol/L的HCl溶液在^°C，160r/min旋轉(zhuǎn)式搖床中浸提4h，測定浸提液在^Onm處吸光度(OD26tl),按摩爾吸光系數(shù)計(jì)算ATP產(chǎn)率。ATP產(chǎn)率計(jì)算公式ATP 產(chǎn)率=OD260 · MrATP · C/EATP式中MrATP為ATP分子量，C為稀釋倍數(shù)，Eatp為ATP摩爾吸光系數(shù)。轉(zhuǎn)化率，等于摩爾轉(zhuǎn)化率，數(shù)值等于實(shí)際ATP產(chǎn)率與理論ATP產(chǎn)率之比。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在篩選獲得一株能夠合成ATP的新菌株一雅致放射毛霉(Actinomucor elegans) ZGBl，利用該菌株可以腺嘌呤為前體合成ATP，具有原料價(jià)格較低、來源豐富、菌體培養(yǎng)基原料簡單、菌體容易分離等優(yōu)點(diǎn)，且轉(zhuǎn)化效率高在含有3g/ L以上腺嘌呤的反應(yīng)液中能夠產(chǎn)生10g/L以上的ATP。


圖1為本發(fā)明菌株?duì)I養(yǎng)菌絲電鏡照片(10X4倍)圖2本發(fā)明菌株氣生菌絲電鏡照片(10X4倍)圖3本發(fā)明菌株呈總狀分枝的孢囊梗電鏡照片(10X 10倍)
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圖4本發(fā)明菌株囊壁開始消融的孢子囊電鏡照片(10X40倍)。 具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1 雅致放射毛霉ZGBl (CGMCC No. 4313)接種至PDA斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 4d，以生理鹽水洗滌制成孢子懸液(約IO6 IO7CfuAiL)；孢子懸液以10% (V/V)的接種量接入液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，蛋白胨 10g/L，酵母膏 5g/L，NaCl 5g/L，溶劑為水，pH 6. 0 6. 5)中，置于 ，160r/min 旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)12h，得到液體種子液；液體種子液以10% (V/V)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖40g/L，酵母膏3g/L， 玉米漿 10g/L, MgSO4 · 7H20 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. 2g/L, NH4Cl 3g/L, K2HPO4 · 3H20 3g/L，溶劑為水，pH 6.0 6. 5)中，置于觀1，1601·/!^!!旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)12h，發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵液經(jīng)抽濾收集菌體，并用無菌水沖洗濾干，濾干菌體再經(jīng)過恒溫干燥箱65°C 干燥池的細(xì)胞通透化處理，得毛霉菌體備用。轉(zhuǎn)化反應(yīng)液組成葡萄糖90g/L，Na2HPO4 · 12H20 90g/L, MgCl2 · 6H20 4g/L，腺嘌呤 3g/L，毛霉菌體80g/L。上述配制的轉(zhuǎn)化反應(yīng)液于33°C、160r/min旋轉(zhuǎn)式搖床中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，IOh時(shí)以 ATP · 2Na計(jì)的產(chǎn)量為11. 14g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率可達(dá)91. 07%。實(shí)施例2 雅致放射毛霉ZGBl (CGMCC No. 4313)固體斜面培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，蛋白胨IOg/ L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，瓊脂20g/L，溶劑為水，pH 6. 0 6. 5)，培養(yǎng)3 4d，以生理鹽水洗滌制成孢子懸液(約IO6 107CfU/mL)；孢子懸液以10% (V/V)的接種量接入液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，蛋白胨 10g/L，酵母膏 5g/L，NaCl 5g/L，溶劑為水，pH 6. 0 6. 5)中，置于 ，160r/min 旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)12h，得到液體種子液；液體種子液以10% (V/V)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖40g/L，酵母膏3g/L， 玉米漿 10g/L, MgSO4 · 7H20 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. 2g/L, NH4Cl 3g/L, K2HPO4 · 3H20 3g/L，溶劑為水，pH 6.0 6. 5)中，置于觀1，1601·/!^!!旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)12h，發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵液經(jīng)抽濾收集菌體，并用無菌水沖洗濾干，濾干菌體再經(jīng)過恒溫干燥箱60°C 干燥池的細(xì)胞通透化處理，得毛霉菌體備用。轉(zhuǎn)化反應(yīng)液葡萄糖90g/L，Na2HPO4 · 12H20 90g/L, MgCl2 · 6H20 4g/L，腺嘌呤 4g/ L，毛霉菌體80g/L。上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)液于33°C、160r/min旋轉(zhuǎn)式搖床中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)20h時(shí) ATP · 2Na 產(chǎn)量為 13. 64g/L, ATP · 2Na 的摩爾轉(zhuǎn)化率 83. 63%。
權(quán)利要求
1.雅致放射毛霉(Actinomucorelegans) ZGB1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號:CGMCCNo. 4313，保藏日期2010年11月8日。
2.如權(quán)利要求1所述的雅致放射毛霉ZGBl在微生物合成ATP中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為以腺嘌呤為底物，以雅致放射毛霉ZGBl發(fā)酵獲得的菌體為酶源，于25 35°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)6 M小時(shí)，轉(zhuǎn)化液經(jīng)后處理得到所述ATP。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用如下(1)雅致放射毛霉ZGBl接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，28 30°C培養(yǎng)12 18小時(shí)，發(fā)酵液分離收集菌體，清洗、濾干后40 80°C恒溫干燥2 4小時(shí)，得到雅致放射毛霉ZGBl菌體； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖30 50g/L，酵母膏1 6g/L，玉米漿5 20g/L， MgSO4 · 7Η20 0· 5 2g/L, FeSO4 · 7H20 0. 05 0. 5g/L, NH4Cl 1 5g/L, K2HPO4 · 3H20 1 5g/L, pH 6. 0 6. 5 ;(2)取步驟(1)雅致放射毛霉ZGBl菌體與底物配制轉(zhuǎn)化反應(yīng)液，于30 35°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)6 M小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液經(jīng)后處理得到所述ATP ；所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)液初始組成如下葡萄糖 60 90g/L, Na2HPO4 · Iffl2O 30 90g/L, MgCl2 · 6H203 6g/L，腺嘌呤 2 6g/L，雅致放射毛霉ZGBl菌體50 100g/L。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株能夠合成ATP的新菌株——雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)ZGB1及其應(yīng)用。該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號CGMCC No.4313，保藏日期2010年11月8日。本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在利用該菌株可以腺嘌呤為前體合成ATP，具有原料價(jià)格較低、來源豐富、菌體培養(yǎng)基原料簡單、菌體容易分離等優(yōu)點(diǎn)，且轉(zhuǎn)化效率高在含有3g/L以上腺嘌呤的反應(yīng)液中能夠產(chǎn)生10g/L以上的ATP。
文檔編號C12N1/14GK102154117SQ20101061570
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者朱家榮, 楊光輝, 楊善巖 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)