專利名稱：與水稻粒重相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高水稻粒重的蛋白及其編碼基因與它們的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是重要的糧食作物，世界上接近50%的人口以水稻為食，不斷提高水稻產(chǎn)量是人類不斷追求的目標。研究表明影響水稻產(chǎn)量的構(gòu)成要素主要有三個分蘗數(shù)、穗粒數(shù)和粒重。粒重作為影響水稻產(chǎn)量的重要因素之一漸漸受到人們的廣泛重視。水稻在自然演化及人工馴化的過程中，不斷滿足了人類糧食需求的同時，等位基因的數(shù)目也在不斷減少，近年來，隨著水稻分子設(shè)計育種技術(shù)的完善，迫切需要根據(jù)目前的水稻資源的情況，有效地從中選育出有增加粒重潛力的品種加以遺傳改良，或?qū)ζ淇刂屏Ｖ氐幕蜻M行分離和克隆， 具有十分重要的理論意義和實踐價值，也是解決當(dāng)前水稻育種難題的一條行之有效的途徑。我國水稻遺傳資源豐富，從這些豐富的資源中發(fā)掘、定位提高水稻粒重的新基因， 不僅為培育高產(chǎn)水稻新品種提供理論支持，而且對加強我國水稻基因資源的保護，將資源優(yōu)勢變成經(jīng)濟優(yōu)勢具有重要意義。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種提高水稻粒重的蛋白及其編碼基因與它們的應(yīng)用。本發(fā)明提供的提高水稻粒重的蛋白，名稱為GS6_t，來源于稻屬普通栽培稻 (0. sativa.)秈稻93-11的突變體，是下述1)或2)所述的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID Na 1的氨基酸殘基序列；幻將序列表中的SEQ ID N2 :1氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID No 1的氨基酸殘基序列相同活性的蛋白質(zhì)。序列表中序列SEQ ID No 1氨基酸殘基序列是由115個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的提高水稻粒重的蛋白的編碼基因(gs6_t)，其核苷酸序列是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID Na 2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID Na 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與1)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。4)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。所述高嚴謹條件為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。序列表中序列SEQ ID N2 :2的DNA序列由348個核苷酸組成，為該基因的讀碼框或翻譯從ATG起始至TGA終止密碼子結(jié)束，氨基酸產(chǎn)物即序列表中序列SEQID N2 :1。含有本發(fā)明基因的表達載體、細胞系及工程菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。擴增
3gs6_t中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。上述gs6_t基因在培育顆粒重提高的轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用也是本發(fā)明的保護內(nèi)容。本發(fā)明還提供一種提高水稻粒重的方法，該方法，是以水稻(Oryza sativa) gs6CGMCC No . 4458作為供體親本，以待提高粒重水稻品種為受體親本，通過雜交或回交純合，篩選隱性純合植株，即得到粒重高于所述待提高粒重水稻品種的水稻植株。水稻(Oryza sativa) gs6于2010年12月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號分別為CGMCC Na . 4458。使用gs6_t構(gòu)建植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、泛生素基因WDiquitin啟動子(ρ^ )等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學(xué)試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。攜帶有本發(fā)明編碼提高水稻籽粒寬度的基因gs6_t的植物表達載體可通過使用 Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化水稻細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的水稻細胞或組織培育成植株。本發(fā)明的發(fā)明人在利用甲基磺酸乙酯(EMS)誘變秈稻93-11選擇突變體育種材料時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一個原始水稻基因(L0C_0s06g03710)編碼區(qū)+348位點處堿基G突變?yōu)閴A基A 后(G348A)，造成原始基因翻譯的提前終止和功能的喪失，并引起粒重的顯著增加，從而產(chǎn)生了本發(fā)明的可以提高水稻粒重的基因gs6-t。實驗證明，將含有該突變基因gs6-t的編碼框的水稻突變體gs6通過回交方式轉(zhuǎn)入水稻后，可以顯著提高水稻粒寬和粒重。該基因?qū)τ谒咀蚜挾确肿訖C制的研究，水稻高產(chǎn)新品種的選育具有重要的理論及實際意義，并為改良作物的千粒重提供了一條經(jīng)濟、快速、有效的途徑。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場前景。下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。


圖1為秈稻93-11與突變體gs6籽粒在抽穗期(a)、成熟后(b)和成熟后去殼籽粒 (c)的比較；圖2為秈稻93-11與突變體gs6籽粒成熟后粒寬、粒長、粒厚和千粒重的比較；圖3將突變體gs6與秈稻93-11、秈稻特青通過回交自交的方法獲得隱性純合植株的粒重的比較。
圖4為突變體gs6與秈稻93-11的雜交。圖5為突變體gs6與秈稻特青的回交。
具體實施例方式實施例1、提高水稻粒重的基因gs6_t的獲得及其功能驗證一、提高水稻粒重的基因gs6_t的獲得1、水稻(Oryza sativa)突變體gs6的獲得及其表型鑒定我們首先利用化學(xué)誘變劑EMS對秈稻93-11 (購自國家種質(zhì)資源庫)的種子進行誘變處理，對種子(M0)進行無毒化處理后，然后按常規(guī)田間管理方式播種、施肥和防治病蟲害，成熟后分單株收獲，突變體gs6 (M1)的表型得到初步鑒定粒重較野生型對照(即秈稻 93-11)顯著增加約19%。經(jīng)過仏和禮代重復(fù)鑒定，突變體gs6粒型表現(xiàn)為穩(wěn)定遺傳，如圖 1展示了秈稻93-11和突變體gs6開花前和成熟后籽粒表型特征。同時選取20株成熟后的秈稻93-11和突變體gs6的籽粒進行表型鑒定(粒寬、粒長、粒厚和千粒重)，如圖2所示。水稻(Oryza sativa) gs6于2010年12月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號分別為CGMCC No . 4458。2、提高水稻粒重的新基因gs6_t的獲得構(gòu)建水稻(Oryza sativa)突變體gs6與秈稻特青(購自國家種質(zhì)資源庫)的F2 分離群體，利用圖位克隆的方法進行基因定位，經(jīng)過對15. 7kb候選區(qū)域的測序得知突變體 gs6這種表型的獲得是由于秈稻93-11中一個原始水稻基因(LOC 0s06g03710)編碼區(qū)+348 位點處堿基G突變?yōu)閴A基A后(G348A)(自序列表中序列2的5'端第348位核苷酸)，造成原始基因翻譯的提前終止和功能的喪失(GRAS基因家族保守結(jié)構(gòu)域的完全喪失)，并引起粒重的顯著增加。因此，通過上述實驗表明，上述通過突變形成的一個新的編碼框編碼一個提高水稻粒重的新蛋白。利用引物序列為GS6TF 和 GS6TR(GS6TF:5' ATGTTGGCGGGTTGCTCGTT 3 ‘ , GS6TR 5' CCATACCTCATCGCCGTCG 3')可以擴增上述突變后獲得的新基因gs6_t編碼序列，具體方法如下所述以突變體gs6基因組DNA為模板，以GS6TF和GS6TR為引物，進行PCR擴增，擴增得到348bp的基因片段，測序表明，該片段具有序列表中序列2的核苷酸序列。該片段編碼序列表中序列1所示的蛋白，即本發(fā)明提高水稻粒重的蛋白，名稱為GS6-t。二、提高水稻粒重的基因gs6_t的功能驗證1、突變體gs6與誘變親本秈稻93-11的回交驗證我們以水稻(Oryza sativa)突變體gs6為父本(供體)，以誘變親本秈稻93-11 為母本(受體)進行雜交(F1),在110株&分離群體中得到觀個純合隱性單株(F2，粒型等其它農(nóng)藝性狀均與突變體gs6相同)，野生型與突變型的分離比為3 Kx2 = 0.0121), 說明造成水稻突變體gs6粒寬粒重較誘變親本秈稻93-11增加的表型變異是由單個隱性基因控制的，即突變基因gs6-t。抽穗期將觀個純合隱性單株套袋自交后分單株收獲后(F3) 進行F3代種植，每個F3家系粒型無分離，具體過程如圖4所示。植株成熟后對每個隱性純合F3家系混合收獲，選取100粒種子，利用電子天平稱其重量，并重復(fù)3次，取3次平均值后換算成千粒重。結(jié)果如圖所示3，各家系與突變體gs6 在粒重?zé)o顯著差異，但與93-11相比較粒重平均增加19%。2、突變體gs6與秈稻特青的回交驗證我們以水稻(Oryza sativa)突變體gs6為父本(供體)，以秈稻特青(受體)為母本進行雜交(F1)，在600株分離群體中選取粒型與突變體gs6完全相同的10株純合隱性單株(BC1F1),再與秈稻特青進行回交(BC2F1),在各個F2分離群體中(每個F2群體規(guī)模在 100株-120之間)，再選取所有粒型與突變體gs6相同的共約150個純合隱性單株(BC2F2)， 揚花期套袋自交后分單株收獲后進行BC2F3代種植，田間觀察發(fā)現(xiàn)每個BC2F3家系粒型均無分離，具體過程如圖5所示。植株成熟后對每個隱性純合BC2F3家系混合收獲，選取100粒種子，利用電子天平稱其重量，并重復(fù)3次，取3次平均值后換算成千粒重。結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明隱性純合植株的千粒重不僅顯著高于回交親本秈稻特青，而且顯著高于誘變親本秈稻93-11，增加可達11. 6%。
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是下述1)和幻所述的蛋白質(zhì)1)由序列表中的SEQID No 1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的SEQID N2 :1氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有SEQ ID N2 :1的氨基酸殘基序列相同活性的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述編碼基因，其核苷酸序列是下列核苷酸序列之一1)自序列表中SEQID Na 2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID No 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與1)或2)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達載體、重組工程菌或轉(zhuǎn)基因細胞系。
5.權(quán)利要求2或3所述基因在培育粒重提高的植物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為水稻。
7.一種提高水稻粒重的方法，是以水稻(Oryza sativa)gs6 CGMCC Ns. 4458作為供體親本，以待提高粒重水稻品種為受體親本，通過雜交或回交純合，篩選隱性純合植株，即得到粒重高于所述待提高粒重水稻品種的水稻植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高水稻粒重的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白，是下述1)或2)所述的蛋白質(zhì)1)由序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的SEQ ID №.1氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID №.1的氨基酸殘基序列相同活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的基因可用于培育粒重增加的水稻新品種，具有重要意義。
文檔編號C12N15/29GK102532289SQ20101061632
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者付永彩, 劉鳳霞, 孫傳清, 孫連軍, 朱作峰, 李曉嬌, 謝道昕, 譚祿賓 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)