專利名稱：一種檢測急性髓系白血病易感性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒，尤其涉及一種檢測急性髓系白血病 易感性的試劑盒，通過檢測絲裂原活化蛋白激酶激酶4 (CD44)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位 點(diǎn)來預(yù)測急性髓系白血病的易感性。
背景技術(shù)：
血液惡性腫瘤全世界發(fā)病例數(shù)約為40萬，占各種惡性腫瘤的第六位。中國年發(fā)新 增病例為25萬左右，占我國惡性腫瘤的第八位。癌癥的發(fā)生是一個多因素，多階段，多基因 變異的過程。作為細(xì)胞表面的功能的關(guān)鍵分子，CD44參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個重要過程。 大量的研究表明，腫瘤免疫調(diào)控相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)可以通過改變這些基因的表達(dá)水 平的方式，影響這些基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。SNP (Single nucleotide polymorphism)，即單核苷酸多態(tài)性，是人類基因組作圖 的第三代遺傳標(biāo)記，主要是指一類基于單堿基變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基轉(zhuǎn) 換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組最廣泛存在的一類多態(tài)性標(biāo)記，已成為 研究基因組多態(tài)性和識別、定位疾病相關(guān)的一種工具。1996年成功研制了 SNP檢測的實時 熒光定量PCR技術(shù)，實現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，還實現(xiàn)了判斷結(jié)果的自動性。可利用 熒光定量PCR技術(shù)研發(fā)檢測疾病易感性的試劑盒。⑶44是細(xì)胞表面最重要的透明質(zhì)酸(HA)受體，通過與HA相互作用促進(jìn)細(xì)胞遷 移、誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在多種惡性腫瘤組織都有表達(dá)，且與腫瘤生長發(fā)展轉(zhuǎn)移相關(guān)，是腫瘤負(fù) 荷和疾病活動度的可靠指標(biāo)。有研究表明，CD44表達(dá)異?？稍缬赗as、p53等抑癌基因的 異常表達(dá)，提示其變異可能與Ras基因激活有關(guān)，可能是參與腫瘤形成的一個因素。近年 來，CD44與血液腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后、治療等方面的關(guān)系逐漸引起關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)， CD44表達(dá)于所有的AML亞型，與特異性單抗或配體HA結(jié)合后可作為信號因子活化細(xì)胞功 能，這些特性都使其成為AML誘導(dǎo)分化的一個可能靶點(diǎn)(參見Jia L, Guo J. Cellular & Molecular. Immunology. 2006 3:359-65)。Gadhoum 等發(fā)現(xiàn)直接針對 CD44 細(xì)胞表面 抗原的特異性單克隆抗體能觸發(fā)AMLl至AML5型白血病細(xì)胞的終末分化，抑制其增殖，有 : ]"以弓Ifeilit:Gadhoum Ζ, Delaunay J, Maquarre Ε, Durand L, Lancereaux V, Qi J, Robert-Lezenes J, Chomienne C, Smadja-Joffe F. Leuk Lymphoma. 2004 45:1501-10. )。Charrad等證實CD44與其單克隆抗體結(jié)合后能誘導(dǎo)THP-I、HL-60和NB4細(xì) 胞終末分化、強(qiáng)烈抑制其增殖、誘導(dǎo)凋亡(參見=Charrad RS，Gadhoum Z, Qi J, Glachant A, Allouche M, Jasmin C, Chomienne C, Smadja-Joffe F. Blood. 2002 99:290—9·)。 Johnsson等以基因芯片技術(shù)分析了幾種對細(xì)胞生長抑制劑耐藥的細(xì)胞系的基因表達(dá)全貌， 發(fā)現(xiàn)在這些細(xì)胞系中CD44表達(dá)均有改變(參見Johnsson A, Vallon-Christensson J, Strand C, Litman Τ, Eriksen J. Anticancer Res. 2005 25:2661-8·)。Artus 等發(fā)現(xiàn) CD44與其單抗結(jié)合能觸發(fā)一種新的Caspase非依賴性通路，通過釋放鈣蛋白酶依賴性凋亡 誘導(dǎo)因子發(fā)揮作用(參見Artus C, Maquarre Ε, Moubarak RS, Delettre C, Jasmin C,Susin SA, Robert-Lezenes J. . Oncogene. 2006 25 5741—51. )。Zada 等研究發(fā)現(xiàn)，CD44 的單抗A3D8通過特異性破壞細(xì)胞周期、誘導(dǎo)G0/G1期停滯發(fā)揮作用；同時可引起p21表達(dá) 增加、pRb磷酸化減弱、⑶K2/⑶K4激酶活性降低。AML原代細(xì)胞、HL-60、U937細(xì)胞經(jīng)A3D8 作用后，mRNA和蛋白水平的c-jim表達(dá)下調(diào)，JNK蛋白表達(dá)降低、磷酸化的c-jim減少，瞬時 轉(zhuǎn)染顯示c-jim啟動子活性被A3D8抑制；HL-60細(xì)胞中c-jim異位過表達(dá)能誘導(dǎo)增殖、阻 止A3D8的增殖抑制作用，說明CD44與其抗體結(jié)合可誘導(dǎo)髓性白血病細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯 和增殖停滯，在此過程中，細(xì)胞周期和增殖的重要調(diào)節(jié)器c-jim有重要作用(參見Zada AA, Singh SM, Reddy VA, Els sser A, Meisel A, Haferlach Τ, Tenen DG, Hiddemann W, Behre G. Oncogene. 2003 22:2296-308·)。rsll821102是位于第18號染色體⑶44基因啟動子區(qū)域的一個T>G多態(tài)。其在 世界人群的頻率分布，T占0. 62，G占0. 38左右。中國人群的分布T占0. 45，G占0. 25左 右。現(xiàn)有技術(shù)中，并沒有CD44基因啟動子區(qū)域的T>G多態(tài)與急性髓系白血病易感性相關(guān)性 的研究報道，也沒有通過檢測絲裂原活化蛋白激酶激酶4 (CD44)的單核苷酸多態(tài)性(SNP) 位點(diǎn)來預(yù)測急性髓系白血病的易感性的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測急性髓系白血病易感性的試劑盒。本發(fā)明的原理為發(fā)明人通過分子生物學(xué)研究表明，絲裂原活化蛋白激酶激酶4 (⑶44)的rsll821102位點(diǎn)上T>G的替代可增加⑶44基因啟動子與核蛋白的結(jié)合，增加 CD44基因的表達(dá)；通過大規(guī)模人群的急性髓系白血病病例對照研究，CD44基因啟動子區(qū)域 的T>G多態(tài)與急性髓系白血病發(fā)生相關(guān)，并且呈基因劑量-反應(yīng)關(guān)系，即使在調(diào)整年齡、性 別、吸煙、腫瘤家族史等多種混雜因素后，這種相關(guān)性仍然存在；同時，發(fā)明人的研究還顯示 rsll821102與散發(fā)性腸癌及鼻咽癌的發(fā)生相關(guān)，均表現(xiàn)為rsll821102基因型為G時腫瘤發(fā) 生率降低。因此這個SNP的多態(tài)可用于評估個體急性髓系白血病的易感性。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種檢測急性髓系白血病易感性 的試劑盒，包括檢測絲裂原活化蛋白激酶激酶4 (CD44)的rsll821102號單核苷酸多態(tài)性 (SNP)位點(diǎn)的特異性引物對及特異性熒光探針對、熒光定量PCR的常規(guī)組件；其中，所述特 異性引物對包括有義引物序列SEQ ID NO: 1和反義引物序列SEQ ID N0:2，具體如下所示 SEQ ID N0:1 有義引物序列5，-CCACAAAGCAGAAAGAAGAAGAAAA-3，，Tm 值為 60°C ;SEQ ID NO: 2 反義引物序列5，-GGGAATAGTGCAGAAAGTTGACATC-3，，Tm 值為 58°C ；
所述特異性熒光探針對包括野生型探針序列和突變型探針序列，具體如下所示SEQ ID N0:3 野生型探針序列5，-CAGAGTTGATCTGTAGAAT-3，，Tm 值為 66 °C;SEQ ID N0:4 突變 型探針序列5’ -TTAGACAGAGTTGATCTATAGA-3，，Tm 值為 67 "C。上述技術(shù)方案中，所述特異性弓丨物是針對⑶44基因上的rs 11821102號SNP位點(diǎn) 而設(shè)計，能特異性擴(kuò)增出包含針對⑶44基因上的rsll821102號SNP位點(diǎn)的DNA引物對；優(yōu) 選地，本試劑盒包括具有SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示序列的引物對。特異引物對可 用常規(guī)的合成技術(shù)合成。本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解，本發(fā)明的引物不限于這對引物。上述技術(shù)方案中，所述特異性熒光探針是針對⑶44基因上的rsll821102號SNP 位點(diǎn)而設(shè)計，能特異性檢測rsll821102這個急性髓系白血病一個基因型的DNA探針對；優(yōu)選地，本試劑盒包括具有SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示序列的熒光探針對。特異熒光 引物對可用常規(guī)的合成技術(shù)合成。本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解，本發(fā)明的引物不限于這對熒光 探針。所有可用于熒光定量PCR檢測CD44基因上的rsll821102號SNP位點(diǎn)的探針均在本 發(fā)明范圍內(nèi)。上述技術(shù)方案中，所述熒光定量PCR的常規(guī)組件包括Taq DNA聚合酶、dNTP混合 液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液和去離子水；所述熒光定量PCR的常規(guī)組件的成 分及其制備方法均為現(xiàn)有技術(shù)。具體地，一種檢測急性髓系白血病易感性的試劑盒，每10 μ 1的PCR體系中包括 10 μ M特異性引物對兩條各0. 225 μ 1，5 μ M特異性熒光探針兩條各0. 1μ 1 ； (5unit/y 1) Taq DNA 聚合酶 0. 02 μ 1 ；20mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1 ;25 mM MgCl2 溶液 0. 5 μ 1 ;5X 熒光定 量PCR反應(yīng)緩沖液2 μ 1 ；去離子水補(bǔ)足；上述試劑盒的保存溫度為-20°C。本發(fā)明同時要求保護(hù)上述的試劑盒檢測通過熒光定量PCR法檢測絲裂原活化蛋 白激酶激酶4的rsl 1821102號單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的應(yīng)用。采用上述檢測急性髓系白血病易感性的試劑盒檢測待測DNA的CD44基因上的 rsll821102號SNP位點(diǎn)的基因型，其中，PCR反應(yīng)條件為50 "C 2 min, 95 "C 10 min，再 進(jìn)行40 55個PCR循環(huán)92 V 15 s，60 V 1 min ；反應(yīng)結(jié)束后在；采用熒光定量PCR儀讀 取熒光量，區(qū)分基因型被檢測DNA的⑶44基因上的rsll821102號SNP位點(diǎn)攜帶有G時， 為急性髓系白血病易感型。由于上述技術(shù)方案的使用，本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)
由于本發(fā)明所述試劑盒中包含的特異性引物對是針對CD44基因上的rsll821102號 SNP位點(diǎn)而設(shè)計，能特異性擴(kuò)增出包含針對⑶44基因上的rsl 1821102號SNP位點(diǎn)的DNA引 物對；所述的特異性熒光探針是針對⑶44基因上的rsll821102號SNP位點(diǎn)而設(shè)計，能特 異性擴(kuò)增出包含針對⑶44基因上的rsl 1821102號SNP位點(diǎn)的DNA探針對；因此，可以檢測 DNA的CD44基因上的rsl 1821102號SNP位點(diǎn)的基因型，從而檢測個體急性髓系白血病的易 感性，也適用于對胃癌、前列腺癌及卵巢癌的預(yù)后檢測，更可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療研究。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明 實施例一
一種檢測急性髓系白血病易感性的試劑盒，包括檢測⑶44基因上的rsll821102號 SNP位點(diǎn)的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgC12溶液、 熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液和去離子水；
所述檢測⑶44基因上的rsl 1821102號SNP位點(diǎn)的特異性引物對的序列如序列表SEQ ID NO :1所示，有義引物序列的Tm值為60 °C，反義引物序列的Tm值為58 °C ；所述檢測 ⑶44基因上的rsl 1821102號SNP位點(diǎn)的特異性熒光探針對的序列如序列表SEQ IDNO :2所 示，野生型探針序列的Tm值為66 °C，突變型探針序列的Tm值為67 °C ；
所述的特異性引物，能特異性擴(kuò)增出包含針對⑶44基因上的rsll821102號SNP位點(diǎn) 的DNA引物對和DNA探針對。以供檢測一人份使用試劑盒為例，該試劑盒中各物質(zhì)的含量為10μΜ特異性引物對兩條各0.225 μ 1，5 μ M特異性熒光探針兩條各0. 1μ 1 ； (5unit/y l)Taq DNA聚合酶 0. 02 μ 1 ； 20mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1 ；25 mM MgCl2 溶液 0. 5 μ 1 ；5Χ 熒光定量 PCR 反應(yīng)緩沖 液2μ 1 ；去離子水4. 1μ 1。在ABI 7900ΗΤ型熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50 V 2 min, 95 V 10 min，再進(jìn)行 40 55 個 PCR 循環(huán)92 "C 15 s，60 "C 1 min。反應(yīng)結(jié)束后在 ABI 7900HT 型熒光定量PCR儀讀取熒光量。步驟3 基因型分析及確定基因型
采用 ABI 7900HT 型熒光定量 PCR 儀自帶軟件 SDS (Sequence Detection Systems) V2. 3判讀基因型，自動分析結(jié)果。被檢測DNA的⑶44基因上的rsll821102號SNP位點(diǎn)攜 帶有G時，為急性髓系白血病易感型。實施例二 步驟1 :DNA的提取
對被檢測者進(jìn)行服務(wù)前咨詢，由被檢測者簽署知情同意書，填寫生活飲食習(xí)慣問卷表。 常規(guī)方法抽取被檢測者EDTA抗凝血5ml。用硅膠吸附法提取血液標(biāo)本的基因組DNA。步驟2:基因分型檢測
使用實施例一所述試劑盒，對被檢測者DNA的⑶44基因上的rsll821102號SNP位點(diǎn) 進(jìn)行熒光定量PCR檢測，確定該位點(diǎn)的基因型。步驟3 指導(dǎo)人們主動預(yù)防急性髓系白血病
通過對被檢測者基因型的分析，出具基因分型檢測報告和對被檢測者個體化健康指導(dǎo) 報告?；蚍中蜋z測報告詳細(xì)說明了被檢測者急性髓系白血病易感程度的高低以及患病概 率大小。個體化健康指導(dǎo)報告以被檢測者的基因分型檢測結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合其生活飲食習(xí) 慣問卷調(diào)查結(jié)果，評估被檢測這急性髓系白血病遺傳易感的相對風(fēng)險。同時制定出針對被 檢測者的個性化健康行動方案，包括在飲食習(xí)慣、生活方式生活的改進(jìn)建議等，并為被檢測 者普及預(yù)防急性髓系白血病的健康知識。實施例三
通過我們設(shè)計的方法對314例急性髓系白血病患者和615例正常對照進(jìn)行基因分型 后，將所得數(shù)據(jù)繪制成表1
表1、CD44基因rsl 1821102單核苷酸多態(tài)與乳腺癌風(fēng)險
權(quán)利要求
1.一種檢測急性髓系白血病易感性的試劑盒，包括熒光定量PCR的常規(guī)組件，其特征 在于，還包括檢測絲裂原活化蛋白激酶激酶4的rsll821102號單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的特 異性引物對及特異性熒光探針對。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述特異性引物對包括有義引物序列SEQ ID NO: 1和反義引物序列SEQ ID N0:2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述特異性熒光探針對包括野生型探針 序列SEQ ID NO:3和突變型探針序列SEQ ID N0:4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述熒光定量PCR的常規(guī)組件包括Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液和去離子水。
5.一種檢測急性髓系白血病易感性的試劑盒，每10 μ 1的PCR體系中包括10μΜ特異 性引物對兩條各0. 225 μ 1，5 μ M特異性熒光探針兩條各0. 1 μ 1 ；5unit/ μ 1的I1aq DNA聚 合酶 0. 02 μ 1 ；20mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1 ；25 mM MgCl2 溶液 0. 5 μ 1 ；5Χ 熒光定量PCR 反應(yīng) 緩沖液2μ1 ；去離子水補(bǔ)足。
6.權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的試劑盒檢測通過熒光定量PCR法檢測絲裂原活化蛋白 激酶激酶4的rsl 1821102號單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒，通過檢測絲裂原活化蛋白激酶激酶4(CD44)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)來預(yù)測急性髓系白血病的易感性。所述試劑盒，包括熒光定量PCR的常規(guī)組件、檢測絲裂原活化蛋白激酶激酶4的rs11821102號單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物對及特異性熒光探針對。本發(fā)明所述試劑盒可以檢測DNA的CD44基因上的rs11821102號SNP位點(diǎn)的基因型，從而檢測個體急性髓系白血病的易感性，也適用于對胃癌、前列腺癌及卵巢癌的預(yù)后檢測，更可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療研究。
文檔編號C12Q1/68GK102146441SQ20101061655
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者周翊峰, 姜嵐, 游永鶴, 鄭健 申請人:蘇州大學(xué)