專利名稱：一種光合細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及實(shí)驗(yàn)操作方法領(lǐng)域，具體涉及一種光合細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法。
背景技術(shù)：
光合細(xì)菌力acteri<3，簡(jiǎn)稱PBS)是地球上最早出現(xiàn)具有原始光 能合成體系的原核生物，是一大類在厭氧條件下進(jìn)行不放氧光合作用的細(xì)菌的總稱。由于 它具有能利用有機(jī)小分子作為碳源的生理特性，且菌體本身又無(wú)毒無(wú)害、營(yíng)養(yǎng)豐富的特點(diǎn)， 因之在水產(chǎn)養(yǎng)殖、廢水處理等行業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用，并在新能源開發(fā)、種植業(yè)、食品、化 妝品、醫(yī)藥保健等行業(yè)顯示出廣闊的應(yīng)用前景。一些種屬的光合細(xì)菌在一定的培養(yǎng)條件下 產(chǎn)生粘性物質(zhì)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)粘性物質(zhì)增多，如莢膜紅假單胞菌、球形紅假單胞菌， 但是沼澤紅假單胞菌的培養(yǎng)液不具備粘性特征，這就為不同菌的計(jì)數(shù)方法提出了針對(duì)性要 求。光合細(xì)菌數(shù)的測(cè)定一直是產(chǎn)品質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標(biāo)，目前光合細(xì)菌菌數(shù)常用的測(cè) 定方法有顯微鏡計(jì)數(shù)法(血球計(jì)數(shù)板)法，稀釋平板法，雙層平板法，MPN (最大或然數(shù)法)， 比濁計(jì)數(shù)法等進(jìn)行光合細(xì)菌菌數(shù)的測(cè)定。這些方法在實(shí)際生產(chǎn)中普遍存在操作復(fù)雜、培養(yǎng) 時(shí)間長(zhǎng)、結(jié)果重復(fù)性差等問(wèn)題。如血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法，雖然操作簡(jiǎn)單，但是不適用于光合 細(xì)菌因光合細(xì)菌的菌體小，一般廣1. 3 μ mX 2、μ m，血球計(jì)數(shù)板較厚，很難對(duì)光合細(xì)菌進(jìn)行 計(jì)數(shù)，血球計(jì)數(shù)板一般多用于酵母菌的計(jì)數(shù)，酵母菌的大小一般為2. 5^10 μ mX4. 5^21 ym； 稀釋平板在光合細(xì)菌技術(shù)上面應(yīng)用的不多，只有個(gè)別在黑暗、需氧的情況下代謝能力旺盛 的菌才適用，大部分光合細(xì)菌的生長(zhǎng)是需要厭氧、光照的，在進(jìn)行厭氧、光照培養(yǎng)過(guò)程中平 板培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，且有水珠產(chǎn)生，容易污染；雙層平板計(jì)數(shù)法解決了厭氧的問(wèn)題，但是培養(yǎng)的 菌往往較小、顏色淡，甚至無(wú)色，且生長(zhǎng)的周期長(zhǎng)，MPN方法準(zhǔn)確，且是行標(biāo)推薦使用的方法， 但是技術(shù)操作繁瑣，時(shí)間周期長(zhǎng)，一般需要12 15天才能判斷出結(jié)果，且在進(jìn)行粘性光合細(xì) 菌計(jì)數(shù)時(shí)，結(jié)果差異較大，不適用于生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)量的監(jiān)控；比濁法是大多數(shù)無(wú)粘性物質(zhì)光合 細(xì)菌常用的計(jì)數(shù)方法，但是培養(yǎng)基等會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的光合細(xì)菌在計(jì)數(shù)時(shí)存在的計(jì)數(shù)時(shí)間長(zhǎng)、結(jié)果差異較 大等問(wèn)題，提供一種檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的光合細(xì)菌的快速計(jì)數(shù)方法。本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn) 一種光合細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法，包括如下步驟
(1)配制染色液；
(2)菌液的稀釋取光合細(xì)菌廣anl，無(wú)菌水稀釋；
(3)細(xì)菌計(jì)數(shù)板的清洗將細(xì)菌計(jì)數(shù)板和蓋玻片在75%酒精中浸泡;T5min，取出后用無(wú) 菌濾紙吸取多余的酒精，備用；
(4)玻片的制備吸取光合細(xì)菌懸液，加至細(xì)菌計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)區(qū)，滴加染色液，蓋上蓋玻片；
(5)計(jì)數(shù)。作為一種優(yōu)選方案，步驟(1)中所述染色液包括結(jié)晶紫廣2. 0g、草酸銨0. 5^0. Sg、 酒精20ml和蒸餾水80ml。更進(jìn)一步地，所述染色液包括結(jié)晶紫2. Og,草酸銨0. Sg,95%酒精20ml，蒸餾水 80ml。作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明所述染色液的配制方法是先將結(jié)晶紫溶于酒精，草酸 銨溶于蒸餾水中，然后將兩種溶液混合，過(guò)濾，靜置，靜置時(shí)間優(yōu)選為48h。作為一種優(yōu)選方案，步驟(2)中所述無(wú)菌水稀釋是先用無(wú)菌水進(jìn)行1 100稀釋，稀 釋后漩渦震蕩3(T60s，再取稀釋液進(jìn)行1:10稀釋。作為一種優(yōu)選方案，步驟(4)中所述將粘性光合細(xì)菌懸液加至細(xì)菌計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù) 區(qū)后，每個(gè)計(jì)數(shù)格的細(xì)菌數(shù)為5 10個(gè)。作為一種優(yōu)選方案，步驟(4)中，所述滴加染色液是在細(xì)菌計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)區(qū)滴加 3μ L的染色液。作為一種優(yōu)選方案，所述光合細(xì)菌為粘性光合細(xì)菌。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明方法所用時(shí)間短，利用改良的細(xì)菌計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，添加了染色液，可以很清晰地在 顯微鏡下直接觀察細(xì)菌，一般15min左右完成一個(gè)樣品計(jì)數(shù)，增加了計(jì)數(shù)的靈敏度，減少誤 差，重復(fù)性好，非常適合大規(guī)模生產(chǎn)中應(yīng)用，本方法與MPN (最大或然數(shù))方法進(jìn)行了計(jì)數(shù)結(jié) 果對(duì)比，差異不明顯。本方法步驟簡(jiǎn)單，操作方便，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求不高，是一種簡(jiǎn)單、快 捷的光合細(xì)菌技術(shù)方法。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。以下實(shí)施例所用的顯微鏡為目鏡16X，接物鏡40X，細(xì)菌計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)區(qū)邊長(zhǎng)為 1mm，計(jì)數(shù)區(qū)的面積為1mm2，每個(gè)小方格的面積為l/400mm2。蓋上蓋玻片后，計(jì)數(shù)區(qū)的高度為 0. 1mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的體積為0. 1mm3，每個(gè)小方格的體積為l/4000mm3。Imm3體積應(yīng)含有 小方格數(shù)為1000mm7l/4000mm3=4X IO6個(gè)小方格，即系數(shù)K=4X IO6。實(shí)施例1粘性光合細(xì)菌的計(jì)數(shù)
1、取結(jié)晶紫2g，草酸銨0. 8g，95%酒精20ml，蒸餾水80ml，先將結(jié)晶紫溶于酒精， 草酸銨溶于蒸餾水中，然后將兩液混合，過(guò)濾，靜置48h。2、取莢膜紅假單胞菌培養(yǎng)物Iml，放入99ml無(wú)菌水里稀釋，漩渦震蕩60秒，稀釋倍 數(shù)為100倍。每個(gè)計(jì)數(shù)小格的菌數(shù)月8個(gè)。3、把細(xì)菌計(jì)數(shù)板和蓋玻片在75%酒精中浸泡:3min左右，取出后用無(wú)菌濾紙吸去 多余的酒精，備用。4、用微量移液槍吸取3 μ L稀釋液置于細(xì)菌計(jì)數(shù)板的技術(shù)區(qū)，滴加3 μ L的染色液， 從左之后蓋上蓋玻片上，避免氣泡的產(chǎn)生，菌液盡量避免溢出蓋玻片。5、將細(xì)菌計(jì)數(shù)板在顯微鏡下觀察，選擇大于20個(gè)計(jì)數(shù)格的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)的路徑一般采用“弓”型路線，保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確，共計(jì)M個(gè)格，菌數(shù)共180個(gè)。6、計(jì)算結(jié)果
光合細(xì)菌總數(shù)=2 XKX菌液稀釋倍數(shù)=告X4X IO6X 100=3X IO90 M24實(shí)施例2粘性光合細(xì)菌的計(jì)數(shù)
1、取結(jié)晶紫lg，草酸銨0. 5g，95%酒精20ml，蒸餾水80ml，先將結(jié)晶紫溶于酒精，草酸 銨溶于蒸餾水中，然后將兩液混合，過(guò)濾，靜置48h。2、取濃縮的球形紅假單胞菌培養(yǎng)物lml，放入99ml無(wú)菌水里稀釋，漩渦震蕩60秒， 取稀釋液Iml加入9ml的無(wú)菌水里，漩渦震蕩30秒，再取稀釋液Iml加入9ml無(wú)菌稀釋液 后，漩渦震蕩30秒，此次的稀釋倍數(shù)為10000倍。每個(gè)計(jì)數(shù)小格的菌數(shù)約9個(gè)。3、把細(xì)菌計(jì)數(shù)板和蓋玻片在75%酒精中浸泡;3min左右，取出后用無(wú)菌濾紙吸去 多余的酒精，備用。4、用微量移液槍吸取3 μ L稀釋液置于細(xì)菌計(jì)數(shù)板的技術(shù)區(qū)，滴加3 μ L的染色液， 從左之后蓋上蓋玻片上，避免氣泡的產(chǎn)生，菌液盡量避免溢出蓋玻片。5、將細(xì)菌計(jì)數(shù)板在顯微鏡下觀察，選擇大于20個(gè)計(jì)數(shù)格的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)的 路徑一般采用“弓”型路線，保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確，共計(jì)30個(gè)格，菌數(shù)共240個(gè)。6、計(jì)算結(jié)果
光合細(xì)菌總數(shù)=I X K X菌液稀釋倍數(shù)=^xixio6Xioooo=SJXio11tj M30實(shí)施例3非粘性光合細(xì)菌的計(jì)數(shù)
1、取結(jié)晶紫lg，草酸銨0. 5g，95%酒精20ml，蒸餾水80ml，先將結(jié)晶紫溶于酒精，草酸 銨溶于蒸餾水中，然后將兩液混合，過(guò)濾，靜置48h。2、取沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)物lml，放入99ml無(wú)菌水里稀釋，漩渦震蕩60秒，漩渦震 蕩30秒，此次的稀釋倍數(shù)為100倍。每個(gè)計(jì)數(shù)小格的菌數(shù)約7個(gè)。3、把細(xì)菌計(jì)數(shù)板和蓋玻片在75%酒精中浸泡;3min左右，取出后用無(wú)菌濾紙吸去 多余的酒精，備用。4、用微量移液槍吸取3 μ L稀釋液置于細(xì)菌計(jì)數(shù)板的技術(shù)區(qū)，滴加3 μ L的染色液， 從左之后蓋上蓋玻片上，避免氣泡的產(chǎn)生，菌液盡量避免溢出蓋玻片。5、將細(xì)菌計(jì)數(shù)板在顯微鏡下觀察，選擇大于20個(gè)計(jì)數(shù)格的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)的 路徑一般采用“弓”型路線，保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確，共計(jì)35個(gè)格，菌數(shù)共245個(gè)。6、計(jì)算結(jié)果
光合細(xì)菌總數(shù)=2 χ K X菌液稀釋倍數(shù)=^5X 4Χ IO6X 100=2. 8X 109。
權(quán)利要求
1.一種光合細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法，其特征在于包括如下步驟(1)配制染色液；(2)菌液的稀釋取光合細(xì)菌廣anl，無(wú)菌水稀釋；(3)細(xì)菌計(jì)數(shù)板的清洗將細(xì)菌計(jì)數(shù)板和蓋玻片在75%酒精中浸泡;T5min，取出后用無(wú) 菌濾紙吸取多余的酒精，備用；(4)玻片的制備吸取光合細(xì)菌懸液，加至細(xì)菌計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)區(qū)，滴加染色液，蓋上蓋玻片；(5)計(jì)數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光合細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法，其特征在于步驟(1)中所述染色液包 括結(jié)晶紫Γ2. 0g、草酸銨0. 5 0. Sg、酒精20ml和蒸餾水80ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的光合細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法，其特征在于所述染色液包括結(jié)晶紫 2. Og,草酸銨0. 8g，95%酒精20ml，蒸餾水80ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求廣3中任意一條權(quán)利要求所述光合細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法，其特征在于所述 染色液的配制方法是先將結(jié)晶紫溶于酒精，草酸銨溶于蒸餾水中，然后兩種溶液混合， 過(guò)濾，靜置。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的光合細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法，其特征在于所述靜置時(shí)間為48h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光合細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法，其特征在于步驟(2)中所述無(wú)菌水稀 釋是先用無(wú)菌水進(jìn)行1 100稀釋，稀釋后漩渦震蕩3(T60s，再取稀釋液進(jìn)行1 10稀釋。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光合細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法，其特征在于步驟(4)中，所述將粘性光 合細(xì)菌懸液加至細(xì)菌計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)區(qū)后，每個(gè)計(jì)數(shù)格的細(xì)菌數(shù)為5 10個(gè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光合細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法，其特征在于步驟(4)中，所述滴加染色 液是在細(xì)菌計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)區(qū)滴加3 μ L的染色液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光合細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法，其特征在于所述光合細(xì)菌為粘性光合 細(xì)菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種光合細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法。本發(fā)明方法通過(guò)在傳統(tǒng)細(xì)菌計(jì)數(shù)方法的基礎(chǔ)上添加了染色液，增加了細(xì)菌計(jì)數(shù)的靈敏度及準(zhǔn)確性。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，適用于實(shí)驗(yàn)室或工廠化的生產(chǎn)操作。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK102134583SQ20101061694
公開日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者王蔚淼 申請(qǐng)人:清遠(yuǎn)海貝生物技術(shù)有限公司