專利名稱：一種骨骼肌特異性capn3啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子遺 傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及了一種骨骼肌特異性表達(dá)基因5'調(diào)控區(qū)特異性啟動子及其在轉(zhuǎn)基因豬中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
真核生物基因表達(dá)的時間和水平嚴(yán)格按照發(fā)育順序進(jìn)行。某些特定基因表達(dá)的調(diào)節(jié)由轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合于調(diào)控區(qū)相關(guān)元件，成為轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵步驟，并最終導(dǎo)致基因的時間和空間表達(dá)。編碼組織特異蛋白的基因嚴(yán)格按照組織特異性和發(fā)育階段性表達(dá)，為基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了很好的研究模式。在特異高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動物中，獲得能廣泛應(yīng)用的特異性啟動子非常重要。但啟動子的特異性由多個元件控制，在不同種類和不同發(fā)育時期起關(guān)鍵作用的調(diào)控元件并不相同，調(diào)控元件和反式作用因子之間的相互作用也十分復(fù)雜。因此要使外源基因能夠在動物組織中特異高效地表達(dá)，必須構(gòu)建一個可以特異高效表達(dá)的動物表達(dá)載體，其中啟動子的選擇是重要的條件之一。鈣蛋白酶3(CalpaStatin 3，CAPN3)是典型的組織特異性鈣蛋白酶，主要存在于肌Z線處，是導(dǎo)致肌原纖維蛋白降解的關(guān)鍵因素，與骨骼肌生長代謝密切相關(guān)，利用其基因調(diào)控區(qū)的相關(guān)元件構(gòu)建骨骼肌特異性表達(dá)載體是一種有效的方法。但是上述的研究均還處在起步階段，對于轉(zhuǎn)基因豬的培育和肉品品質(zhì)的提高均沒有起到較好的促進(jìn)作用。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述的原因，本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)豬鈣蛋白酶3基因5'調(diào)控區(qū)具有骨骼肌特異性啟動特性，并利用這一特性設(shè)計了一種骨骼肌特異性表達(dá)啟動子載體，該啟動子可以在轉(zhuǎn)基因豬的培育中應(yīng)用。該啟動子載體具有骨骼肌特異性啟動特性，而在除骨骼肌外的多種細(xì)胞中均無啟動活性，可見該啟動子在骨髂肌中特異性地啟動下游基因的表達(dá)，能夠滿足目的基因在骨骼肌中特異性表達(dá)的要求，為轉(zhuǎn)基因載體提供了一種重要的元件。本發(fā)明所提供的骨骼肌特異性表達(dá)基因5'調(diào)控區(qū)特異性啟動子，其基因序列如 Seq IDNo 1 所示；除了上述的啟動子之外，還可以是該啟動子的變體或者片段，均具有如Seq ID No 1所示的基因序列。“變體”是指對豬CAPN3啟動子Seq ID No :1序列進(jìn)行一個或者多個堿基的任何取代、變異、修飾、替換、缺失或者添加所產(chǎn)生的序列，該序列仍然表現(xiàn)出類似于Seq ID No 1序列的活性?！捌巍笔侵富綝NA序列的一個或者多個區(qū)域，其仍然類似于豬CAPN3啟動子Seq IDNo 1的活性。具有上述序列的啟動子或其變體，或者片段，具有骨骼肌特異性啟動特性，而在骨骼肌之外的多種細(xì)胞中均無啟動活性，該基因啟動子在骨骼肌中能特異性地啟動下游基因的表達(dá)，可以滿足目的基因在骨骼肌中特異性表達(dá)的要求，并能應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因豬的培育中。應(yīng)用上述的核酸時，一般采用重組核酸序列，其中含有上述的啟動子或其變體，或者片段，這樣就可以使于啟動子下游的目的基因在骨骼肌中特異性表達(dá)，作為分析、開發(fā)、 改造骨骼肌特性的研究模型。還可以利用已有的分子生物學(xué)操作技術(shù)獲得包含目的基因的重組核酸，通過顯微注射等基因?qū)爰夹g(shù)獲得轉(zhuǎn)基因胚胎，用于建立轉(zhuǎn)基因動物。重組核酸序列中的目的基因，含有下列的至少一種功能基因，主要包括提高肌肉品質(zhì)基因，加快生長速度基因，抗病基因，提高飼料報酬的基因以及生產(chǎn)特定藥物的基因，這樣就 可以在獲得骨骼肌特異性啟動特性之外，提高該重組核酸序列的性能，為轉(zhuǎn)基因豬的培養(yǎng)提供更多的功能性方向，增加其附加產(chǎn)值，如將去飽和脂肪酸酶基因在該啟動子指導(dǎo)下表達(dá)可以特異性提高骨骼肌中不飽和脂肪酸的含量，提高肉品營養(yǎng)價值。在獲得了上述的重組核酸序列之后，還可以用其建立特殊的表達(dá)系統(tǒng)，以便更好的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因豬的培育過程。將目的基因重組至該啟動子下游，通過基因轉(zhuǎn)入技術(shù)使調(diào)控區(qū)與目的基因共同整合進(jìn)染色體中，獲得轉(zhuǎn)基因動物，在該啟動子作用下目的基因僅在骨骼肌中表達(dá)，在其他組織器官中不表達(dá)，降低目的基因?qū)游锏挠绊?，提高轉(zhuǎn)基因的效 本發(fā)明主要通過報告基因分析確定該啟動子的啟動特征。首先構(gòu)建無啟動子綠色熒光蛋白載體，為保證報告基因正確翻譯，在綠色熒光蛋白基因上游插入內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)。然后通過PCR或者片段捕獲等技術(shù)獲得骨骼肌中特異性表達(dá)的鈣蛋白酶 35'調(diào)控區(qū)，長度為1059bp，插入內(nèi)部核糖體位點上游，得到啟動子報告基因分析載體，將 CMV啟動子(589bp)連入空載體中作為陽性對照，空載體為陰性對照。質(zhì)粒去內(nèi)毒素后，轉(zhuǎn)染C2C12小鼠成肌細(xì)胞系，同時轉(zhuǎn)染豬原代腎上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞為對照，轉(zhuǎn)染24h后更換含馬血清的誘導(dǎo)培養(yǎng)基至成肌細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞分化融合，48h后用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，分析啟動子特性。當(dāng)上述的啟動子，或者重組核酸序列或者表達(dá)系統(tǒng)被應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因豬的培育中后，可以有效的提高培育的效果，且通過添加各種功能性基因，使得轉(zhuǎn)基因豬可以獲得更好的肌肉品質(zhì)，更高的生長速度，更好的抗病性以及降低飼養(yǎng)成本，還可以在特定藥物的生產(chǎn)中得到更為廣泛的應(yīng)用，對于該領(lǐng)域的研究有著很好的參考價值。


圖1為CAPN3F和CAPN3R弓丨物PCR擴(kuò)增CAPN35 ‘調(diào)控區(qū)片段電泳圖，泳道1為PCR 產(chǎn)物，M 為 DL2000Maker ；圖2為無啟動子CMV Enhancer-IRES-AcGFP載體圖譜；圖 3 為轉(zhuǎn)染 CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP 48h 小鼠 C2C 12 細(xì)胞照片，左側(cè)為200倍光鏡下照片，細(xì)胞狀態(tài)良好，右側(cè)為藍(lán)色激發(fā)模塊下照片，可見GFP 表達(dá)，CAPN3Promoter有啟動活性；圖 4 為轉(zhuǎn)染 CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP 48h 豬 PIEC 細(xì)胞照片，左側(cè)為100倍光鏡下照片，細(xì)胞狀態(tài)良好，右側(cè)為藍(lán)色激發(fā)模塊下照片，無GFP表達(dá)，CAPN3Promoter無啟動活性；
圖 5 為轉(zhuǎn)染 CMV Promoter-IRES-AcGFP 48h 豬 PIEC 細(xì)胞照片，

左側(cè)為100倍光鏡下照片，細(xì)胞狀態(tài)良好，右側(cè)為藍(lán)色激發(fā)模塊下照片，可見GFP 表達(dá)，轉(zhuǎn)染技術(shù)有效；圖 6 為轉(zhuǎn)染 CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP 48h 大鼠心肌細(xì)胞系 H9c2照片，左側(cè)為100倍光鏡下照片，細(xì)胞狀態(tài)良好，右側(cè)為藍(lán)色激發(fā)模塊下照片，無GFP表達(dá)，CAPN3Promoter無啟動活性；圖7為轉(zhuǎn)染CMV Promoter-IRES-AcGFP 48h大鼠心肌細(xì)胞系H9c2照片，左側(cè)為 100倍光鏡下照片，細(xì)胞狀態(tài)良好，右側(cè)為藍(lán)色激發(fā)模塊下照片，可見GFP表達(dá)，轉(zhuǎn)染技術(shù)有效；圖 8 為轉(zhuǎn)染 CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP 48h 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系3T3-L1照片，左側(cè)為100倍光鏡下照片，細(xì)胞狀態(tài)良好，右側(cè)為藍(lán)色激發(fā)模塊下照片， 無GFP表達(dá)，CAPN3Promoter無啟動活性；圖9為轉(zhuǎn)染CMV Promoter-IRES-AcGFP 48h小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系3T3-L1照片， 左側(cè)為100倍光鏡下照片，細(xì)胞狀態(tài)良好，右側(cè)為藍(lán)色激發(fā)模塊下照片，可見GFP表達(dá)，轉(zhuǎn)染技術(shù)有效；圖 10 為轉(zhuǎn)染 CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP 4他人肝細(xì)胞系 HL-7702照片，左側(cè)為100倍光鏡下照片，細(xì)胞狀態(tài)良好，右側(cè)為藍(lán)色激發(fā)模塊下照片，無 GFP表達(dá)，CAPN3Promoter無啟動活性；圖11為轉(zhuǎn)染CMV Promoter-IRES-AcGFP 48h人肝細(xì)胞系HL-7702照片，左側(cè)為 100倍光鏡下照片，細(xì)胞狀態(tài)良好，右側(cè)為藍(lán)色激發(fā)模塊下照片，可見GFP表達(dá)，轉(zhuǎn)染技術(shù)有效；圖 12 為轉(zhuǎn)染 CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP 48h 原代豬腎細(xì)胞照片，左側(cè)為40倍光鏡下照片，細(xì)胞狀態(tài)良好，右側(cè)為藍(lán)色激發(fā)模塊下照片，無GFP表達(dá)， CAPN3Promoter無啟動活性；圖13為轉(zhuǎn)染CMV Promoter-IRES-AcGFP 48h原代豬腎細(xì)胞照片，左側(cè)為200倍光鏡下照片，細(xì)胞狀態(tài)良好，右側(cè)為藍(lán)色激發(fā)模塊下照片，可見GFP表達(dá)，轉(zhuǎn)染技術(shù)有效；
具體實施例方式在本說明書的上下文中，除非特別指明否則本說明書所用的任何術(shù)語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員在本領(lǐng)域中通常理解的含義，而未注明詳細(xì)條件的實驗方法是按照常規(guī)試驗方法或按照供應(yīng)商所建議的操作說明書進(jìn)行的。實施例1無啟動子IRES-AcGFP載體構(gòu)建為了避免分析序列中ATG對報告基因翻譯的影響，保證下游報告基因GFP的正確表達(dá)，特構(gòu)建無啟動子IRES-AcGFP載體，該載體包含一個內(nèi)部核糖體進(jìn)入元件，該方法有利于保留轉(zhuǎn)錄起始位點下游的調(diào)控元件，可以獲得更大的調(diào)控區(qū)分析區(qū)間。以 pIRES2-AcGFPl為骨架，用Ase I.Nhe I酶切，回收4723bp片段，得到無CMV啟動子的載體； PCR擴(kuò)增CMV Enhancer元件，下游引物加入Xba I酶切位點及保護(hù)性堿基，加粗表示。CMV Enhancer Forward 核酸序列如 Seq ID No :2 所示,CMV Enhancer Reverse 核酸序列如 Seq ID No 3 所示。
引.物名稱引物序列載體位置
CMV Enhancer ForwardGGATAACCGTATTACCGCCATGC1
CMV Enhancer Reverse_GCTCTAGACAAAACAAACTCCCATTG485_按照如下體系配制PCR反應(yīng)液
2 χ PrimeSTAR GC Buffer 10 μ
dNTP Mixture ( 2.5 mM each)2 μ
CMV Enhancer Forward0.3μΜ ( final conc.)CMV Enhancer Reverse0.3μΜ ( final conc.) pIRES2-AcGFPl 質(zhì)粒DNA1 ng PrimeSTAR HS DNA Polymerase ( 2.5 U/μΙ)0.2 μ H2O補(bǔ)足至20 μ PCR程序設(shè)定如下
95 "C 40 sec -η60°C 15 sec31Cycles 72 °C 40 sec _將擴(kuò)增后的產(chǎn)物與6 X Loading buffer混合上樣至1 % TAE瓊脂糖凝膠，5V/cm 電泳20min后切膠回收目的片段，按Axygen瓊脂糖凝膠純化試劑盒純化說明書操作得到純化產(chǎn)物，用AseI (Fermentas)和Xba I (Fermentas)酶切純化產(chǎn)物，酶切之后瓊脂糖切膠回收得到粘性末端的CMV Enhancer，將CMV Enhancer元件與酶切后的載體用Rapid DNA Ligation (Fermentas)連接，克隆轉(zhuǎn)化，獲得含CMV Ehancer無啟動子的pIRES-AcGFP，該載體同時作為陰性對照載體。將完整的CMV啟動子正向連入該載體中，得到陽性對照載體。將包含陰性對照和陽性對照載體的菌液按照1 500的比例分別接種至含卡那霉素50 μ g/ ml LB培養(yǎng)基中，200rpm劇烈搖晃14h。4°C 6000 Xg收集菌體至50ml離心管中，用于無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取，具體操作按照EndoFree Plasmid Maxi (QIAGEN)說明書進(jìn)行，純化得到的質(zhì)粒A260/280在1. 8-1. 9之間。實施例2啟動子報告基因載體的構(gòu)建基因組提取取大約克夏豬耳組織，按照TIANamp genomic DNA (天根)試劑盒說明書進(jìn)行基因組DNA提取。跟據(jù)NCBI (Gene ID :NW_003299273. 1)設(shè)計如下，上下游引物加入Bgl II酶切位點及保護(hù)性堿基，加粗表示，CAPN3F核酸序列如Seq ID No 4所示，CAPN3R核酸序列如Seq IDNo 5 所示。
引物名稱引物序列位置
CAPN3F GAAGATCTTCGTCTCCTTACAGCCTGGGTAG_1059
CAPN3R GAAGATCTTCGATACGGCTACCTTTAAGGAAAG “1
按照如下體系配制PCR反應(yīng)液
權(quán)利要求
1.一種骨骼肌特異性CAPN3啟動子，其特征在于該啟動子的基因序列如％(1 ID No 1所示。
2.一種重組核酸序列，其特征在于序列中包含有基因序列如kq ID No :1所示的啟動子或者該啟動子的變體，或者片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所屬的重組核酸序列，其特征在于序列中還包含有至少一種功能基因，所述功能基因包括提高肌肉品質(zhì)基因或加快生長速度基因或抗病基因或提高飼料報酬的基因或生產(chǎn)特定藥物的基因或其組合。
4.一種表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于包含有如權(quán)利要求2或3所述的重組核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種骨骼肌特異性啟動子及其應(yīng)用，特別提供了一種骨骼肌特異性表達(dá)基因5′調(diào)控區(qū)特異性啟動子及其在轉(zhuǎn)基因豬中的應(yīng)用，該啟動子只在骨骼肌中具有啟動特性，而在除骨骼肌外的多種細(xì)胞中均無啟動活性，可見該基因啟動子只在骨骼肌中特異性地啟動下游基因的表達(dá)，因此能夠滿足目的基因在骨骼肌中特異性表達(dá)的要求，為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來提高豬肉的品質(zhì)提供了一種重要的元件。
文檔編號C12N15/85GK102154288SQ20101061712
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者姜運良, 康麗, 張旭, 張渝潔, 梁森 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)