專利名稱：一種利用葡萄糖酸鹽廢菌體制備葡萄糖氧化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于葡萄糖氧化酶的一種制備方法，具體涉及葡萄糖酸鹽系列產(chǎn)品的黑曲霉發(fā)酵廢菌體中葡萄糖氧化酶的提取方法。
背景技術(shù)：
葡萄糖氧化酶是一種需氧脫氫酶，可以除去食品和容器中的氧，從而有效地防止食物的變質(zhì)，廣泛應(yīng)用于茶葉、冰淇淋、奶粉、啤酒、果酒及其他飲料制品的包裝中。目前葡萄糖氧化酶主要從培養(yǎng)黑曲霉或從霉菌中提取，通常利用黑曲霉、青霉發(fā)酵后獲得的菌絲體，經(jīng)過破壁，緩沖液，離心提取，獲得胞內(nèi)葡萄糖氧化酶的粗酶液；或直接利用發(fā)酵液經(jīng)過濾、硫酸銨鹽析沉淀、Sephadex脫鹽、DEAE-纖維素離子交換層析及 SpehadexG-IOO凝膠層析進行分離純化，制得一定量的酶制劑。其生產(chǎn)成本高，提取工藝繁瑣，周期長，廢水量大。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有生產(chǎn)方法中所存在的缺點，本發(fā)明提供了一種利用葡萄糖酸鹽生產(chǎn)過程中的廢菌體提取制備葡萄糖氧化酶的方法。本發(fā)明所述的利用葡萄糖酸鹽生產(chǎn)中的廢菌體制備葡萄糖氧化酶的方法，包括將葡萄糖酸鹽發(fā)酵液經(jīng)過板框過濾后，分離制得黑曲霉菌體；菌體洗滌后，經(jīng)高壓均漿機中均質(zhì)處理，使其破壁自溶；通過兩次超濾濃縮，得到粗制酶液，冷凍離心得到含有葡萄糖氧化酶的上清液；上清液經(jīng)過鹽析沉淀、透析、濃縮后得到食品級葡萄糖氧化酶。本發(fā)明所述制備葡萄糖氧化酶的方法具體操作方法如下
(1)過濾
將葡萄糖酸鈉發(fā)酵液經(jīng)過濾布孔徑不大于0. 45 μ m的板框過濾后，分離得到廢黑曲霉菌體；
(2)洗滌
將分離得到的廢黑曲霉菌體，用體積比為1: (5 10)的蒸餾水或者pH5飛的Tris-HCl 緩沖液洗滌，去除菌絲體表面的雜質(zhì)；
(3)破壁自溶
將清洗后的黑曲霉菌體，利用轉(zhuǎn)速達1200(Tl5000rad/min的高壓均漿機均質(zhì)2 4hr， 進行破壁處理，并用用體積比為1 (5 10)、pH5飛的Tris-HCl緩沖液保存24hr，使菌體內(nèi)葡萄糖氧化酶游離出來；
(4)超濾濃縮
將上述菌體液，先用分子量為2000(T150000 Dal超濾膜膜過濾，去除小分子蛋白質(zhì)及鹽類；再用分子量為15000(T300000Dal的超濾膜濃縮，去除大分子蛋白質(zhì)；
(5)冷凍離心
將菌體液用Tris-HCl緩沖液靜置48hr，采用1200(Tl5000rad/min的高壓均漿機，在溫度4°C，冷凍離心20-30min，得到含有葡萄糖氧化酶的上清液；
(6)鹽析沉淀
將含有葡萄糖氧化酶的上清液，采用PH值為5、的5(Γ80%飽和度硫酸銨溶液進行鹽析沉淀，過濾后得到葡萄糖氧化酶沉淀；
(7)透析
將葡萄糖氧化酶沉淀，用Tris-HCl緩沖液稀釋后，采用0. 5^2%的碳酸氫鈉和廣3mmol/ L的EDTA進行透析；
(8)濃縮
將透析液在0、°C溫度下，采用分子量為200(Γ6000的聚乙二醇行濃縮，得到葡萄糖氧化酶酶液成品。本發(fā)明制備葡萄糖氧化酶的方法所用的原料為生產(chǎn)葡萄糖酸鹽系列產(chǎn)品(如葡萄糖酸鉀、鈉、鋅、鈣、銅等)的廢棄物——發(fā)酵后分離出的廢菌體，原料成本極低，所制得的葡萄糖氧化酶的成本不及現(xiàn)有技術(shù)的一半，所制備的葡萄糖氧化酶質(zhì)量達到了我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760-1996)規(guī)定，完全可以在食品等行業(yè)中使用。
具體實施例方式實施例1
將約20m3的葡萄糖酸鈉發(fā)酵液，經(jīng)過板框過濾后，分離制得黑曲霉菌體3. 7噸(濕基)； 將所得的黑曲霉菌體，用1:10體積的Tris-HCl緩沖液洗滌，去除菌絲體表面的雜質(zhì)；將黑曲霉菌體利用高壓均漿機40Mpa破壁3hr，并用pH值5 6的Tris-HCl緩沖液保存24hr， 使菌體內(nèi)葡萄糖氧化酶游離出來；將菌體液先用50000Dal膜超濾，去除小分子蛋白質(zhì)及鹽類；再用200000Dal膜超濾，去除大分子蛋白質(zhì)，得到濃縮的葡萄糖氧化酶；將濃縮液用 Tris-HCl緩沖液靜置48hr，15000 rad/min、4°C冷凍離心30min后，得到含有葡萄糖氧化酶的上清液；將上清液采用PH值為7的80%飽和度硫酸銨溶液進行沉淀，過濾后得到葡萄糖氧化酶沉淀；將沉淀用Tris-HCl緩沖液稀釋后，透析；將透析液0°C采用聚乙二醇2000進行濃縮，得到比活為145U/mg的葡萄糖氧化酶酶液4. 9L。實施例2和實施例3操作步驟與實施例1基本相同，詳細(xì)操作條件見下表 實施實例操作條件表
權(quán)利要求
1.一種利用葡萄糖酸鹽廢菌體制備葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于包括以下步驟 將葡萄糖酸鹽發(fā)酵液經(jīng)過板框過濾后，分離制得黑曲霉菌體；菌體洗滌后，經(jīng)高壓均漿機中均質(zhì)處理，使其破壁自溶；通過兩次超濾濃縮，得到粗制酶液，冷凍離心得到含有葡萄糖氧化酶的上清液；上清液經(jīng)過鹽析沉淀、透析、濃縮后得到食品級葡萄糖氧化酶。
2.如權(quán)利要求1所述的制備葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于葡萄糖酸鹽發(fā)酵液的板框過濾分離所用的濾布孔徑不大于0. 45 μ m。
3.如權(quán)利要求1所述的制備葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于黑曲霉菌體的洗滌，采用PH值為5飛Tris-HCl緩沖液，菌體與緩沖液體積比為1: (5 10)。
4.如權(quán)利要求1所述的制備葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于黑曲霉菌體破壁自溶， 采用轉(zhuǎn)速達1000(Tl5000rad/min的高壓均漿機均質(zhì)處理2 4hr。
5.如權(quán)利要求1所述的制備葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述黑曲霉菌體的兩次超濾濃縮分別采用2000(Tl50000Dal和15000(T300000Dal分子量的超濾膜。
6.如權(quán)利要求1所述的制備葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述葡萄糖氧化酶酶液的冷凍離心采用轉(zhuǎn)速12000 15000 rad/min的高壓均漿機采用1200(Tl5000rad/min的高壓均漿機，在溫度4°C，冷凍離心20-30min，得到含有葡萄糖氧化酶的上清液。
7.如權(quán)利要求1所述的制備葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述葡萄糖氧化酶上清液的鹽析沉淀采用50、0%硫酸銨飽和度溶液，pH值為5 8，進行鹽析沉淀。
8.如權(quán)利要求1所述的制備葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述葡萄糖氧化酶上清液的透析采用0. 5^2%的碳酸氫鈉和廣3mmol/L的EDTA進行透析。
9.如權(quán)利要求1所述的制備葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述葡萄糖氧化酶上清液的濃縮，采用分子量為2000 6000的聚乙二醇進行濃縮，溫度為0、°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用葡萄糖酸鈉廢菌體制備葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)方法，包括將葡萄糖酸鈉發(fā)酵液，經(jīng)過板框過濾后，分離制得黑曲霉菌體；黑曲霉菌體經(jīng)洗滌后，經(jīng)高壓均漿機中均質(zhì)處理，使其破壁自溶；通過兩次超濾濃縮，得到粗制酶液；冷凍離心后得到含有葡萄糖氧化酶的上清液；上清液經(jīng)過鹽析沉淀、透析、濃縮后得到食品級葡萄糖氧化酶。本發(fā)明方法所提取葡萄糖氧化酶達到我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB2760-1996)規(guī)定。
文檔編號C12N9/02GK102154233SQ20101061840
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者張樹祿, 王一, 王勇, 馬仕敏 申請人:山東西王生化科技有限公司