專利名稱：腫瘤選擇性復制型腺病毒-胸苷激酶基因構(gòu)建體的獲得及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人類5型腺病毒(Human adenovirus type 5，Ad5)重組體的構(gòu)建方案，其技術(shù)特征在于定向缺失Ad5基因組的第920-946nt JPGAT CTT ACC TGC CAC GAG GCTGGC TTT，該序列編碼ElA蛋白121至1 位氨基酸，在此基礎(chǔ)上，進一步缺失Ad5E3區(qū)觀530-四360壯，在上述缺失區(qū)域引入一個ClaI酶切位點；同時在該缺失區(qū)插入HSV-TK基因的全長編碼序列(1131bp，具體序列見核酸序列表)，從而獲取對腫瘤具有治療作用的腫瘤選擇性復制型腺病毒構(gòu)建體Ad5/Δ ElA/Δ 6. 7k/gpl9k/HSV_TK。發(fā)明內(nèi)容屬于醫(yī)學基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
當前，惡性腫瘤是全球面臨的最嚴重的公共衛(wèi)生問題之一，我國更是腫瘤疾病的高發(fā)、高死亡地區(qū)之一。根據(jù)美國癌癥協(xié)會、國際癌癥研究會(IARC)發(fā)布的報告及國家衛(wèi)生部統(tǒng)計公報等資料分析2006年，全球新發(fā)病例1230萬人，死亡760萬人；我國新發(fā)病例 238萬人，死亡178萬人，構(gòu)成死因的沈％，已成為我國居民首要死因，因此，腫瘤疾病嚴重影響了我國勞動力人口的健康，并在很大程度上制約了我國經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展。專家預測， 今后二、三十年內(nèi)的發(fā)病及死亡率仍將繼續(xù)保持上升趨勢。經(jīng)過多年發(fā)展，腫瘤治療方法目前主要有手術(shù)、化療、放療和生物治療等四種，并已形成較成熟的治療體系，對部分腫瘤疾病可達到臨床治愈的效果。然而，這四種方法均存在各自的局限性，只能在一定程度上改善腫瘤患者的生存質(zhì)量和提高生存率，發(fā)展已處于平臺期，而試圖通過改進治療方案、進一步提高療效的潛力十分有限，總體來說治療效果是不盡如人意的。因此，要進一步提高療效乃至根治惡性腫瘤，亟待發(fā)現(xiàn)新的高效治療方法和藥物?，F(xiàn)代分子醫(yī)學的發(fā)展極大地推動了腫瘤治療概念性的更新?？梢哉f，未來腫瘤的有效控制在根本上依賴于分子治療的發(fā)展與完善。作為分子治療主要手段之一的基因治療，近年來已開始廣泛應用于多種腫瘤疾病的臨床試驗性治療。作為一種全新的治療模式， 基因治療已逐漸成為對以往一些“不治之癥”的最具希望的有效治療手段，顯示出良好的臨床應用前景。在目前實施的所有基因治療臨床試驗方案中，腫瘤治療約占2/3，已成為腫瘤治療中最引人注目、進展最迅速的研究新領(lǐng)域，代表了 21世紀腫瘤治療的發(fā)展方向。有專家分析，今后十年內(nèi)，基因治療將發(fā)展為一個成熟的治療途徑，因此，基因治療抗腫瘤藥物的應用前景和市場潛力將是十分巨大的。重組Ad5載體作為腫瘤基因治療應用最為廣泛的載體之一，其臨床可行性和安全性已獲公認，腺病毒基因治療載體具有以下突出的生物學優(yōu)勢和臨床應用優(yōu)勢感染譜廣； 不整合入宿主基因組，無致突變、致癌的危險性；臨床應用安全，副作用輕微；臨床應用方便；腺病毒在細胞體內(nèi)持續(xù)表達時間短，尤其適合腫瘤治療；臨床級數(shù)量、質(zhì)量的病毒易于生產(chǎn)、純化。
目前腫瘤臨床試用的絕大部分載體為缺失了 El及E3區(qū)的復制缺陷性腺病毒，進入腫瘤病灶后，對腫瘤的殺滅效應依賴于體外高濃度治療病毒的輸入，距離注射點較遠的病灶的殺滅效應較弱。為此，近年來，出現(xiàn)了從復制缺陷性腺病毒載體向條件復制性腺病毒載體(conditionally implicative adenovirus)轉(zhuǎn)化的新的發(fā)展趨勢，所謂條件性復制腺病毒載體是指載體能選擇性地在腫瘤細胞內(nèi)復制增殖，將腫瘤細胞作為生產(chǎn)病毒的場所， 最終達到裂解殺滅腫瘤細胞的治療目的，腫瘤細胞裂解釋放出高濃度的病毒后，可進一步感染距離注射點較遠的病灶腫瘤細胞，形成新一輪的感染波，周而復始形成一種正反饋，達到最大的治療效應。此類載體另一個非常理想的優(yōu)勢是它們不能在正常細胞內(nèi)完成復制， 因此對正常細胞無任何殺傷效應。在第21屆美國腫瘤研究年會上，來自休斯頓Anderson 腫瘤中心的一份研究報告表明局部注射后，復制缺陷性腺病毒在人體惡性膠質(zhì)瘤病灶中的分布較局限，在一定程度上影響了療效的發(fā)揮，與此形成鮮明的對比，能在腫瘤細胞內(nèi)特異性復制的腺病毒0NYX-015，通過在腫瘤局部的增殖，其分布遍及全瘤灶，取得顯著療效。 0NYX-015是美國ONYX藥物生物技術(shù)公司近年研制出的能在腫瘤細胞內(nèi)選擇性復制的腺病毒，其構(gòu)建特點是在wt-Ad5的基因組上，部分缺失ElB 55kDa的編碼序列，并加入翻譯終止信號，但保留19kDa ElB的編碼序列。作為條件復制性腺病毒載體代表產(chǎn)品的0NYX-015在1996年進入臨床試驗以來， 已經(jīng)取得了非常令人鼓舞的臨床療效。目前，美國輝瑞(pifzer)藥物公司已從0Ν (生物技術(shù)公司購買使用專利，并已在多種腫瘤進行臨床期試驗，其中，對復發(fā)性，難治性頭頸部腫瘤的治療正進行臨床III期試驗，已取得非常滿意的療效，對其他腫瘤如轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌、 肺癌、胰腺癌、口腔粘膜白斑病(oral leukoplakia)和惡性膠質(zhì)瘤的臨床I_II期試驗正在進行中。國內(nèi)已有4例與0NYX-015類似原理的專利申請，其中專利申請(一種缺陷型病毒及其構(gòu)建方法)991M030. 8通過缺失ElB 55kDa位于^09_3329bp編碼序列，并在缺失部位插入終止碼的方法得到ElB 55kDa部分缺失的構(gòu)建體。專利申請(缺失凋亡抑制基因病毒的構(gòu)建及在腫瘤基因治療中的應用)96013494. 7通過部分缺失ElB 55kDa編碼序列，并在該缺失部位插入標志基因LacZ，得到ElB 55kDa部分缺失同時攜帶標志基因的病毒構(gòu)建體，該構(gòu)建體的另一特點是有E3區(qū)的缺失。另外兩項為申請人領(lǐng)導的研究小組提交的申請，專利號011446 . 5 “一種缺失ElA編碼序列的重組腺病毒構(gòu)建體的獲得及用途”，缺失ElA 382-1630nt序列，篩選出不能表達ElA功能蛋白的重組腺病毒構(gòu)建體，專利號01144629. 3 “一種聯(lián)合缺失19kDa、55kDa ElB編碼序列重組腺病毒構(gòu)建體的構(gòu)建及用途”，篩選出不能表達ElB功能蛋白的重組腺病毒構(gòu)建體。國內(nèi)外現(xiàn)有的腺病毒基因治療載體與前期的載體相比，無論在治療原理上，還是在實際治療效果上均具有明顯的改進，并取得突破性進展。然而，它們?nèi)匀淮嬖谝韵氯秉c <1>基于腺病毒生物學基礎(chǔ)設(shè)計的載體雖然具備腫瘤條件復制性的治療優(yōu)勢，由于設(shè)計上的種種不足，獲取的腺病毒在腫瘤細胞中的復制、裂解腫瘤細胞的效力遠遠弱于野生型腺病毒；<2>目前的腺病毒基因治療載體結(jié)合的外源性啟動子在體內(nèi)的活性不穩(wěn)定或較低。

發(fā)明內(nèi)容
基于以上技術(shù)背景和重大的醫(yī)療需求，本發(fā)明將公開一種新的Ad5基因治療載體的構(gòu)建方案，通過該方案獲得的構(gòu)建體具有腫瘤特異性復制、高度腫瘤特異性大量表達外源性治療蛋白、強大的腫瘤特異性旁觀者效應等明顯的優(yōu)勢，并具備高度的治療指數(shù)，適于靜脈用藥，可以解決目前腫瘤治療技術(shù)和實踐中關(guān)鍵的不足之處。本發(fā)明的理論基礎(chǔ)基于現(xiàn)有研究對Ad5病毒生物學的深入認識。當Ad5進入細胞后1小時內(nèi)，Ad5就會表達出ElA功能蛋白，其生物學效應主要包括兩方面，首先，ElA蛋白結(jié)合視網(wǎng)膜母細胞瘤突變基因(Rb)蛋白，使宿主細胞內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子E2F從Rb-E2F的復合物中釋放出來，與此同時，ElA蛋白將激活Ad5表達出ElB功能蛋白，以此滅活宿主細胞內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子P53對細胞周期驅(qū)動激酶的抑制，在E1A、E1B和E2F的共同驅(qū)動下，宿主細胞進入DNA合成期，為病毒基因組的自我復制提供前提條件；其次，Ad5依賴ElA蛋白激活 Ad5的早期基因(E1B，E2，E3，E4)和晚期基因(L1-6)的表達，為病毒基因組的自我復制、病毒顆粒的包裝、逃避宿主細胞的免疫清除、裂解細胞、釋放病毒顆粒、再感染等完整的生命周期提供允許環(huán)境。由此可見，Ad5依賴ElA蛋白啟動其它蛋白的序貫性合成，完成病毒的生命周期，最終裂解宿主細胞。功能蛋白ElA的編碼序列位于Ad5基因組560-1112nt，1229-1545nt，包含三個重要序列，分別為677-799nt，此序列為ElA保守序列1 (CRl)，用于結(jié)合轉(zhuǎn)錄輔助因子P3(l(l， 917-979 nt為ElA保守序列2 (CR2)，用于結(jié)合視網(wǎng)膜母細胞瘤突變基因(1 )，1007-1115nt 為保守序列3 (CR3)，為基因轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。由于幾乎所有的腫瘤均存在Rb調(diào)控徑路的缺陷， 如果對ElA917-979nt的CR2區(qū)加以不同的缺失改造，達到滅活ElA蛋白的RB結(jié)合特性的同時盡可能保留ElA轉(zhuǎn)錄激活特性的效果，由此獲取的腺病毒重組體將有可能在腫瘤細胞內(nèi)有效復制，最終殺滅腫瘤細胞，另一方面，正常細胞具有的Rb調(diào)控徑路，可以有效遏止腺病毒重組體依賴ElA蛋白啟動其序貫性的生命周期，最終僅形成流產(chǎn)感染。上述理論已經(jīng)被眾多的研究所證實。我們構(gòu)建的新型Ad5重組體，其技術(shù)特征在于定向缺失Ad5基因組的920_946nt 序列，并進一步缺失Ad5 E3區(qū)觀530-四360壯，在該缺失區(qū)域引入一個ClaI酶切位點；在 ClaI酶切位點中插入HSV-TK基因的全長編碼序列(1131bp)，從而獲取對腫瘤具有治療作用的腫瘤選擇性復制型腺病毒構(gòu)建體Ad5/ Δ ElA/ Δ 6. 7k/gpl9k/HSV_TK。該載體代表了國內(nèi)外腺病毒基因治療載體研究的最新方向，具有以下生物學特性及治療優(yōu)勢<1>高效的腫瘤細胞選擇性復制及治療基因表達的選擇性；<2>病毒感染腫瘤細胞后治療基因即可獲得即時表達，腫瘤細胞裂解后在腫瘤局部可產(chǎn)生的病毒治療圈，加之與治療靶點的優(yōu)勢聯(lián)合，可形成強效旁的觀者效應；<3>腫瘤細胞內(nèi)病毒的高效擴增，同時轉(zhuǎn)錄出大量治療靶基因，讓腫瘤細胞成為治療蛋白合成的“加工廠”;<4>抗癌譜廣；<5> 對腫瘤動物模型的體內(nèi)模型研究證實，通過腫瘤局部注射或靜脈注射的用藥途徑，該腫瘤選擇性復制型腺病毒構(gòu)建體對受試的所有腫瘤動物模型均具顯著的治療作用，并可有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，且對治療動物無明顯的治療相關(guān)毒性。
四

附圖1 腫瘤選擇性復制型腺病毒構(gòu)建體Ad5/Δ El/Δ 6. 7k/gpl9k/HSV_TK E3區(qū)結(jié)構(gòu)示意圖，該區(qū)域編碼7種蛋白，要缺失的區(qū)域為^53049360bp，為E36. 7k/gpWk基因， 在該缺失區(qū)域插入HSV-TK基因的全長編碼序列(1131bp)。附圖2 腫瘤選擇性復制型腺病毒構(gòu)建體Ad5/Δ ElA/Δ 6. 7k/gpl9k/HSV_TK結(jié)構(gòu)示意圖。 五、具體實施例下列實施例中，除特別注明外，技術(shù)流程中所用的酶和PCR引物均購自美國Gibco 公司。例1、pXCl系列突變體(Δ 920-946pXCl)的構(gòu)建pXCl 購于 Microbix Biosystem Inc. (Toronato, Ontario, Canada,目錄號 PD-01-03)，該質(zhì)粒包含人類5型腺病毒(Ad5) 22_5790nt序列。采用3次PCR法缺失920-946nt，片段1的獲取引物1 = 5' -CG GGA TCC GGG CCC CCATTT CC-3'，相當于9洲3_990&^，下劃線部分為BamHI酶切位點；引物2 = 5 ‘ -GTC ACT GGGTGG ATC GAT CAC CTC CGG TAC-3 ‘，相當于 922_905nt，下劃線部分為與引物 3 互補部分；以PXCl為模板，行PCR反應，反應體系總體積為100 μ 1包括含MgCl2 的 10 X PCR 緩沖液 10 μ 12mM dNTP10 μ 110 μ M 引物 1Ιμ 10 μ M 引物 21 μ 1pXCl IOng/ μ 11 μ 1pfu 高保真 Taq 酶2· 5u加水至100 μ 1 ；反應條件為95°C 30秒；95°C 45秒、60°C 1分鐘、72°C 2分鐘共觀循環(huán)；72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物長940bp，形成片段1，常規(guī)電泳分離純化后，檢測濃度用于后繼PCR反應。片段2 的獲取引物 3 = 5 ‘ -GAG GTG ATC GAT CCA CCC AGT GAC GAC GAG-3 ‘， 相當于91 l-947nt，下劃線部分為與引物2互補部分；引物4 = 5' -TGC TCT AGA CAC AGG TGATGT CG-3'，相當于1344_1325nt，下劃線部分為XbaI酶切位點；以pXCl為模板，行PCR反應，反應條件同上，產(chǎn)物長400bp，形成片段2，常規(guī)電泳分離純化后，檢測濃度用于后繼PCR反應。片段3的獲取將50ng/2 μ 1片段1與25ng/l μ 1片段2混合，作為模板行PCR反應，上游引物為引物1，下游引物為引物4，反應條件同上，產(chǎn)物約為1400bp，形成片段3，用 QIAquick8PCR 產(chǎn)物純化試劑盒(QIAGEN, German, Cat :28142)純化后，用 BamHI，XbaI 雙酶切過夜，酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳分離后回收酶切片段用于克隆。將pXCl用BamHIjbaI雙酶切過夜，酶切產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠電泳分離后產(chǎn)生2 條帶，約為1400bp和8500bp，回收8500bp酶切片段用于克隆。取40ng的8500bp pXCl酶切片段及90ng片段3，用DNA T4連接酶做連接反應， 取1.5μ1轉(zhuǎn)化ΙΟΟμΙ DH5a感受態(tài)細菌，鋪皿過夜培養(yǎng)，第二天挑取單個菌落克隆，提取其內(nèi)擴增的質(zhì)粒，DNA測序鑒定篩選得到缺失121-129AA 920-946nt的pXCl質(zhì)粒突變體-Δ 920-946p)(Cl，用于重組腺病毒的克隆。例2、Δ 920-946Ad5重組腺病毒的構(gòu)建pBHGE3 1 T Microbix Biosystem Inc. (Toronato, Ontario, Canada, g 5 PD-01-12)，該質(zhì)粒包含除Ad5包裝信號(194-358nt)外的全部基因組序列。pBHGE3從Microbix Biosystem Inc.獲取時，總量為10 μ g，先電轉(zhuǎn)入感受態(tài)細菌，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，得到的質(zhì)粒用CsCl2-EB超速離心法純化。同源重組法獲取Δ 920-946Ad5重組腺病毒構(gòu)建體，方法如下在15cm培養(yǎng)皿中種入7. 5X1(^293細胞，培養(yǎng)液為10% FBS DMEM，到第二天，細胞應為1-1. 5X106，大約70%的細胞融合；轉(zhuǎn)染前3-4小時，換成新鮮培養(yǎng)液。配制共轉(zhuǎn)染DNA-磷酸鈣溶液將1600μ 1滅菌的2XHBSQ80mM NaCl,43mMHEPES, IOmM KCl, IOmM Na2HPO4. 7H20,2% dextrose, pH 7. 05-7. 15)/pBHGE3 ^P Δ 920_946pXCl 各 42 μ g/加滅菌的雙蒸水至沘40 μ 1混勻，緩慢加入50 μ 1 2. 5Μ的CaCl2,顛倒混勻，在室溫下讓DNA/CaCl2沉淀45-60分鐘，形成微混濁的沉淀。力Π 500 μ 1上述混合液至含5ml 60mm培養(yǎng)皿的293細胞中，在37°C、5% C02中孵育4-6小時，吸去上述液體，用PBS洗一次。用含15%的甘油/DMEM處理1_2分鐘以促進轉(zhuǎn)染效率，用PBS洗一次，換為完全培養(yǎng)液。制備1.8%低溶點瓊脂糖，高壓滅菌，分裝成5ml，用前在沸水中融化，保溫在 45°C，用時加入等量4% FBS DMEM，即刻鋪入培養(yǎng)皿中。吸去培養(yǎng)液，加入5ml上述液體。每4-5天，加入3ml上述液體。14-21天，噬斑出現(xiàn)，選定6-12個噬斑。將噬斑轉(zhuǎn)移到含無血清DMEM培養(yǎng)基的 1.5ml的EP管中，在37°C孵育24小時。在M孔板培養(yǎng)皿中種入IX 105293細胞，培養(yǎng)液為10% FBS DMEM，到第二天，細胞應為2X 105，大約70%的細胞融合，吸去液體，從上述孵育液取100 μ 1 (大約為IO3病毒) 加入，輕輕晃動液體3次，在37°C、5% CO2中孵育90分鐘。加入完全培養(yǎng)基至1ml，將細胞放置于37°C，5% C02中孵育5_10天，直至完全的 CPE出現(xiàn)，所謂CPE，即細胞毒效應，細胞表現(xiàn)為變圓、漂浮、細胞以核仁為主。假如10天后， 完全的CPE未出現(xiàn)，則提示病毒的效價太低，需進行第二輪的擴增。將培養(yǎng)板進行三輪的凍/解凍的循環(huán)，釋放出病毒，將裂解液收集于15ml試管，最大速度離心10分鐘，收集上清液，凍于-80°C，該液體稱為第二代病毒，大約為5 X IOVml病對以上病毒進行再次擴增，在75cm2培養(yǎng)皿中種入5X1(^293細胞，培養(yǎng)液為 IOml 10% FBS DMEM，到第二天，細胞應為1 X 107，大約70%細胞融合；轉(zhuǎn)染前3-4小時，換成新鮮培養(yǎng)液；取Iml第二代病毒儲存液加入完全培養(yǎng)基至1ml，用于轉(zhuǎn)染；該MOI約為5 ；除去 75cm2培養(yǎng)皿的液體，加入以上液體，輕輕搖動三次；在37°C、5% C02中孵育90分鐘；加入 9ml 2% FBS DMEM，在37°C、5 % C02中孵育4_7天，用于提取病毒DNA用于陽性病毒的篩選。因為293細胞基因組包含完整的ElA基因，提取陽性病毒DNA時容易污染293細胞DNA，造成鑒定失敗，為此將A920-946Ad5在腫瘤細胞Hela中再擴增一次，用于鑒定，步驟如下在6孔板培養(yǎng)皿中種入IX KfHela細胞，培養(yǎng)液為10% FBS DMEM，到第二天，細胞應為2 X IO5,大約70 %的細胞融合，吸去液體，從上述濾過液取100 μ 1 (大約為IO3病毒) 加入，輕輕晃動液體3次，在37°C、5% CO2中孵育90分鐘。加入完全培養(yǎng)基至1ml，將細胞放置于37°C、5% C02中孵育5_10天，直至完全的 CPE出現(xiàn)，將細胞刮下，收集于1.5ml EP管，離心棄上清，加入300 μ 1 PBS溶液，進行三輪的凍/解凍的循環(huán)，釋放出病毒，將裂解液最大速度離心10分鐘，收集上清液，凍于-80°C， 用Qiagen公司試劑盒mini DNA isolation kit，參照試劑盒說明提取DNA。以病毒DNA 為模板，行PCR反應，上游引物=5' -CG GGA TCC GGG CCC CCA TTT CC-3'，下游引物= 5' -TGCTCT AGA CAC AGG TGA TGT CG-3'，反應體系總體積為 100 μ 1 包括含 MgC12 的 10 XPCR緩沖液10μ l/2mM dNTP 10 μ 1/10 μ M上游引物1 μ 1，10 μ M下游引物1 μ 1/病毒 DNA 10ng/pfu高保真Taq酶2. 5u/加水至100 μ 1。反應條件為95°C 30秒/95°C 45秒、 600C 1分鐘、72°C 2分鐘共28循環(huán)/72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物為1400bp，常規(guī)電泳分離純化后，檢測濃度用于DNA測序，測序引物為5' -AGCCGGAGCAGAGAGCCTTG-3 ‘，挑出正確克隆用于構(gòu)建Ad5/ Δ El/Δ 6. 7k/gpl9k/HSV-TK重組腺病毒。例3、Ad5E3區(qū)的亞克隆載體pCDNA3. 1-Δ 6. 7k/gpl9k的構(gòu)建Ad5E3區(qū)全稱為Ad5早期區(qū)域3，該區(qū)域在內(nèi)源性啟動子的驅(qū)動下，編碼7種蛋白， 序列、結(jié)構(gòu)、功能參見附圖 1 :12. 5k，2785848179nt，功能未明；6. 7k, 27547-28736nt, ^P RID復合體一起抑制TRAIL受體1、2在細胞表面的表達；gpl9k，^73549215nt，結(jié)合MHC I類抗原，抑制其至細胞表面的呈遞，逃避CTL的清除；ADP，四419-四770壯，裂解細胞，釋放病毒;RIDa，29784-30057nt，％RID3形成復合物，防止TNF的裂解，清除FAS抗原；RID β， 30062-30458nt 及 14. 7k，30453-30837，抑制 TNF 的裂解。本實驗的目的是要缺失E3區(qū)^53049360nt區(qū)域，并在重組腺病毒的E36. 7k/ gpl9k區(qū)域插入外源性治療基因。采用3 次 PCR 法缺失 Ad5E3 區(qū) 28530_29360nt 片段1 的獲取引物 1 = 5' -ATACGCGCCCACCGAAAC-3‘，相當于 27306_27323nt ； 引物 2 = 5' -AATCTATGGATATCGATTAGCTGCGCCTTTGGCCTA-3‘，相當于 ^51H8529nt，(下劃線部分為與引物3互補部分，ATCGAT為Cla I酶切位點)；以Ad5DNA為模板，行PCR反應，反應體系總體積為100 μ 1包括含MgCl2的10XPCR緩沖液10 μ 12mM dNTP10 μ 110 μ M引物11 μ 110 μ M引物21 μ 1Ad5DNA 200ng/μ 11 μ 1Pfu高保真Taq酶2. 5u加水至ΙΟΟμ 1 ；反應條件為94 0C 30 秒；940C 30秒、46°C 1分鐘、72°C 1分鐘共30循環(huán)；72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物為1234bp (片段1)，常規(guī)電泳分離純化后，檢測濃度用于后繼PCR反應。
片段 2 的獲取引物 3 = 5 ‘ -ATCGACGCGGATCGATACTCTATGTGGGATATGCTC-3 ‘(相當于2961-29380n)(下劃線部分為與引物2互補部分，ATCGAT為Cla I酶切位點)引物4 =5' -ATGTCTTTGAGGCTTGGAGG-3‘(相當于 30137_30118nt) ；PCR 反應條件同上，產(chǎn)物為 794bp (片段2)，常規(guī)電泳分離純化后，檢測濃度用于后繼PCR反應。片段3的獲取將片段1與片段2等量混合，作為模板行PCR反應，上游引物為引物1，下游引物為引物4，反應條件同上，產(chǎn)物約為2000bp (片段3)，用QIAquick 8PCR產(chǎn)物純化試劑盒OlIAGEN，German，Cat :28142)純化后，用EcoRI酶切過夜，酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳分離后回收，酶切片段用于后繼連接反應。將pCDNA3. 1 (Invitrogen, U. S. Α.，Cat :V79020)用 EcoRI 酶切過夜，酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳分離后回收酶切片段，去磷酸化后用于后繼連接反應。將PCR反應產(chǎn)物片段3與酶切、去磷酸化后ρ⑶NA3. 1連接，取1.5μ 1轉(zhuǎn)入ΙΟΟμ 1 DH5a感受態(tài)細菌，挑取陽性克隆，質(zhì)粒小提，DNA測序鑒定篩選得到缺失四477-四714肚的 PCDNA3. 1質(zhì)粒突變體-pCDNA3. 1-Δ6. 7k/gpl9k，用于插入外源性治療基因的亞克隆。例4、在載體 pCDNA3. 1-Δ 6. 7k/gpl9k 的中插入 HSV-TK 全長 cDNA 片段HSV-TK基因全長片段從本實驗室的第一代腺病毒ADV-TK中擴增而來上游引物為 5 ‘ -CCATCGATATGGCTTCGTATCCCGGCC-3 ‘，該片段相當于 HSV-TK cDNA 編碼序列的第l_19nt (下劃線部分為Cla I酶切位點)；下游引物為5 ‘ -CC ATCGATTCAGTGAGCCGCCCCCATCT-3 ‘，該片段相當于 HSV-TK cDNA 編碼序列的第 1131-1112nt (下劃線部分為Cla I酶切位點)，擴增片段包括HSV-TK全長cDNA編碼序列，
全長為114;3bp。
反應體系總體積為100 μ1包括
含MgCl2的10XPCR緩沖液 10 μ 1
2mM dNTP10 μ 1
10 μ M上游引物1 μ 1
10 μ M下游引物1 μ 1
ADV-TK DNA2μ 1
Pfu高保真Taq酶2. 5u
加水至ΙΟΟμ 1 ；
反應條件為
94 0C 30 秒；
940C 30 秒、52 °C 1 分鐘、72 °C 1分鐘共30循環(huán)；
72°C延伸10分鐘。
PCR 產(chǎn)物為 114;3bp，ClaI酶切后，常規(guī)電泳分離純化，檢測濃度用于后繼反應。
載體ρ⑶NA3. 1-Δ6. 7k/gpl9k用Cla I酶切線形化后，常規(guī)電泳分離純化，去磷酸化后與 HSV-TKcDNA連接，取1. 5μ 1轉(zhuǎn)入100 μ 1 DH5 α感受態(tài)細菌，挑取陽性克隆，質(zhì)粒小提，DNA 測序鑒定篩選得到在Cla I酶切位點插入插入HSV-TK全長cDNA(1131bp)片段的質(zhì)粒突變體-pCDNA3. 1-Δ6. 7k/gpl9k/HSV_TK，用于后繼重組腺病毒的克隆。例5、腫瘤選擇性復制型腺病毒Ad5/ Δ ElA/ Δ 6. 7k/gpl9k/HSV_TK的獲取腫瘤選擇性復制型腺病毒Α(15/ΔΕ1Α/Δ6. 7k/gpl9k/HSV_TK的獲取按照參考文獻"Adenovirus methods and protocol,edited by William S. M. Wold,construction of mutations in theadenovirus early region 3 (E3) transcription units，11—24，，建立的連接法(ligation protocol)進行，主要步驟包括TP DNA的提??；用于重組腺病毒構(gòu)建 E3區(qū)DNA的準備；連接反應；共轉(zhuǎn)染293細胞同源重組；噬斑的挑取和鑒定；陽性病毒的擴增和純化。詳細方法參見該文獻。通過以上實驗步驟得到重組腺病毒構(gòu)建體Ad5/AE1A/ Δ6· 7k/gpl9k/HSV-TK，該腺病毒缺失了 Ad5920-946nt 序列(GAT CTT ACC TGC CAC GAG GCT GGC TTT)，該序列編碼ElA蛋白121至1 位氨基酸，并缺失Ad5 E3區(qū)^53049360nt，在 ClaI酶切位點中插入HSV-TK基因全長cDNA片段，其他基因組結(jié)構(gòu)與wt_Ad5完全相同，其序列及結(jié)構(gòu)見附圖2及附錄1。例6、腫瘤選擇性復制型腺病毒Α(15/ΔΕ1Α/Δ6. 7k/gpl9k/HSV_TK治療效應的鑒定1、腫瘤選擇性復制型腺病毒的體外腫瘤細胞殺傷效應的鑒定本實驗的目的在于鑒定Ad5/ Δ ElA/ Δ 6. 7k/gpl9k/HSV_TK腫瘤選擇性復制型腺病毒對一系列腫瘤及正常細胞的殺傷效應，實驗將以wt-Ad5為陽性對照，以復制缺陷型病毒Ad5CMV-GFP為陰性對照。選用細胞系為人肺癌細胞系A(chǔ)M9，人高轉(zhuǎn)移性前列腺癌細胞系PC3M-1E8、人成骨細胞瘤細胞系U-20S、人結(jié)腸癌細胞系HCT-8、人乳腺癌細胞系MCF-7、 人卵巢癌細胞系SK0V-3、人肝癌細胞系H印G2、人食管癌細胞系Eca-109、人胃癌細胞系 MKN-45、人腦膠質(zhì)瘤細胞系SHG-44、人頭頸部鱗狀細胞癌細胞系A(chǔ)GZY-973、人胰腺癌細胞系BxPC-3、人子宮內(nèi)膜癌細胞系HEC-1-A、人直腸癌細胞系Colo320和人鼻咽癌細胞系 CNE-2。選用的細胞系具有不同的P53，RB基因表型；具有不同組織源性，因此實驗結(jié)果可代表不同類型的腫瘤。選用的正常細胞為原代的血管內(nèi)皮細胞、原代的肺小氣管上皮細胞、前列腺上皮細胞、骨髓單個核細胞，選用原則為靜脈用藥后將接觸大量腺病毒的正常組織細胞。在M孔板培養(yǎng)皿中種入IX IO5腫瘤或正常上皮細胞，培養(yǎng)液為10% FBS DMEM 或RIPM1640，到第二天大約70%的細胞融合，吸去液體，加入達到70%所需的MOI稀釋至 100 μ 1加入，輕輕晃動液體3次，在37°C、5% CO2中孵育90分鐘。加入含10% FBS DMEM或RIPM1640培養(yǎng)基至2ml同時加入更昔洛韋(GCV)，將細胞放置于37°C 5% C02中孵育3天，流式細胞儀檢測細胞的凋亡率。實驗結(jié)果表明，陽性對照wt_Ad5無選擇性地裂解腫瘤和正常細胞；復制缺陷型腺病毒Ad5CMV-GFP對細胞的殺傷效應非常弱，腫瘤選擇性復制型腺病毒構(gòu)建體Ad5/ Δ ElA/ Δ 6. 7k/gpl9k/HSV-TK+GCV選擇性地殺傷腫瘤細胞，其效應顯著強于wt_Ad5對細胞的殺傷效應，同時該腫瘤選擇性復制型腺病毒構(gòu)建體對正常對照細胞系無明顯影響。結(jié)果充分表明腫瘤選擇性復制型腺病毒構(gòu)建體Ad5/ Δ ElA/Δ 6. 7k/gpl9k/HSV_TK選擇性高效殺滅腫
瘤細胞，具體數(shù)據(jù)見下表
權(quán)利要求
1.一種腫瘤選擇性復制型腺病毒構(gòu)建體，其技術(shù)特征在于該腫瘤選擇性復制型腺病毒構(gòu)建體稱為Ad5/ Δ ElA/ Δ 6. 7k/gpl9k/HSV_TK，該構(gòu)建體是在野生型Ad5(具體序列見核酸表)的基礎(chǔ)上缺失了其第920-946nt GAT CTT ACC TGC CACGAG GCT GGC TTT,該序列編碼Ad5ElA蛋白的121至1 位氨基酸，同時缺失E3區(qū)位于 6. 7k/gpWk基因區(qū)的第觀530-四360壯，在該缺失區(qū)域引入一個ClaI酶切位點；利用該酶切位點插入HSV-TK基因的全長編碼序列(1131bp，具體序列見核酸序列表)，其它基因組結(jié)構(gòu)與野生型Ad5完全相同(詳見說明書附圖)。
2.制備權(quán)利要求1所述的腫瘤選擇性復制型腺病毒構(gòu)建體的方法，其特征在于用PCR擴增定點缺失技術(shù)分別缺失包含腺病22nt至5790nt序列pXCl質(zhì)粒中ElA 的編碼區(qū)920-946nt，序列為GAT CTT ACC TGC CAC GAG GCT GGC TTT，組成新的載體 A920-946pXCl, Δ 920-946pXCl質(zhì)粒與穿梭載體pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細胞，篩選出表達 ElA突變體功能蛋白的重組腺病毒構(gòu)建體A920-946Ad5 ；采用PCR擴增定點缺失技術(shù)缺失Ad5 E3區(qū)觀530-四360壯，并在上述缺失區(qū)域引入一個ClaI酶切位點，組成新的載體 PCDNA3. 1-Δ6. 7k/gpl9k，在ClaI酶切位點處插入HSV-TK基因的全長編碼序列(1131bp) nt，組成新的載體 pCDNA3. 1-Δ6. 7k/gpl9k/HSV-TK ；提取 Δ 920_946Ad5 TP-DNA，用 EcoRI 酶切，與用EcoRI酶切出的載體pCDNA3. 1-Δ6. 7k/gpl9k/HSV_TK片段共轉(zhuǎn)染293細胞， 篩選出表達ElA突變體的腫瘤選擇性復制型腺病毒構(gòu)建體Ad5/AE1A/Δ 6. 7k/gpl9k/ HSV-TKo
3.權(quán)利要求1所述的腫瘤選擇性復制型腺病毒構(gòu)建體在制備用于實體腫瘤治療的藥物中的應用。
4.權(quán)利要求1所述的腫瘤選擇性復制型腺病毒構(gòu)建體在制備基因治療載體中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人工改造人類5型腺病毒(Ad5)的構(gòu)建方案，以及用該方案獲取的一種腫瘤選擇性復制型腺病毒構(gòu)建體在腫瘤治療中的具體用途，屬于醫(yī)學基因工程技術(shù)領(lǐng)域。用PCR擴增定點缺失、酶切、連接、克隆、同源重組、轉(zhuǎn)染、腺病毒單克隆純化等技術(shù)，獲得的一種重組腺病毒構(gòu)建體，其技術(shù)特征在于Ad5基因組E1A保守序列2(CR2)區(qū)缺失27個堿基；E3區(qū)6.7k/gp19k基因的28530-29360nt缺失，同時在該缺失區(qū)插入HSV-TK全長cDNA(1131bp)片段。該構(gòu)建體是一種具有高度的腫瘤選擇性復制能力的新型溶瘤腺病毒載體，其利用HSV-TK的自殺基因作用和溶瘤病毒溶解腫瘤細胞的雙重殺傷效應在腫瘤的生物治療中具有獨特的實用價值。
文檔編號C12N7/01GK102206613SQ20101062109
公開日2011年10月5日 申請日期2010年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月26日
發(fā)明者盧運萍, 周劍峰, 王世宣, 韓志強, 馬丁 申請人:周劍峰